B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC s PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC NHÂN NHANH CÂY HOA CẨM CHƯỚNG GIÓNG MIX (Dianthus Mix) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 0114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC • • • Nguửi hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Văn Đính HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Đính tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy, cô Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, Phòng Sau đại học trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thòi gian học tập chương trình thạc sĩ Trong thòi gian thực tập nhận giúp đỡ tận tình ThS La Việt Hồng - Trưởng phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, đóng góp ý kiến để hoàn chỉnh luận văn, nhân xin gửi lời cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn Tập thể cán Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học Chuyển giao Công nghệ - trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lọi thiết bị, phương tiện để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè người động viên, góp ý cho thời gian qua Hà Nội, tháng năm 2015 Học viên NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC L Ờ I CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu ữong luận văn trung thực chưa công bố Hà Nội, thảng năm 2015 Học viên NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC MUC LUC • • MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nhiệm yụ nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2.Ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG .4 Chương TÔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÂY HOA CẨM CHƯỚNG 1.1.1 Đặc điểm phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Điều kiện sinh thái hoa cẩm chướng 1.2 GIÁ TRỊ KINH TẾ CỦA NGÀNH SẢN XUẤT HOA TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.2.1 Sản xuất hoa giớ i .6 1.2.2 Sản xuất hoa Việt Nam .8 1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THựC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẢNH 12 1.3.1 Nhân giống chồi chồi bên .13 1.3.2 Nhân giống chồi bất định 14 1.4 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THựC VẬT TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẨM CHƯỚNG 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN cứu 18 2.1.1 Mau v ậ t 18 2.1.2 Thòi gian địa điểm thực 18 2.1.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 18 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 19 2.1.5 Điều kiện nuôi cấy .19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19 2.2.1 Phương pháp khử trùng 19 2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 20 2.2.3 Phương pháp phân tích số liệu 24 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 TẠO VẬT LIỆU KHỞI Đ Ầ U 25 3.2 TÁI SINH VÀ NHÂN NHANH CHỒI THÔNG QUA s ự PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI NÁCH .29 3.3 RA RỄ TẠO CÂY CẨM CHƯỚNG IN VITRO HOÀN CHỈNH 32 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC DỪA ĐẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA CÂY .38 3.5 RÈN LUYỆN CÂY THÍCH NGHI VỚI MÔI TRƯỜNG 44 3.6 KHẢO SÁT SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY HOA CẨM CHƯỚNG ĐƯỢC GIỐNG IN VITRO NGOÀI ĐIỀU KIỆN T ự NHIÊN 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .47 Kết luận .47 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .49 DANH MUC CHỮ VIẾT TẮT Agar Thạch a-NAA a - Napứialene acelic acid BAP - benzyl amino purin ND Nước dừa ĐC Đối chứng CT Công thức GA Gibberellic acid IAA p - indoleacetic acid IBA p - indole butyric acid H20 Hydro peroxide (nước oxy già) HgCl2 Thủy ngân Clorua MS Murashige and Skoog, 1962 mg/1 Miligram/lít TDZ N-phenyl-N'-1,2,3-thidiazol-5-yl urea 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid |iM Micro mol y/y Nồng độ % thể tích/thể tích DANH MUC HÌNH Hình 3.1 Anh hưởng nồng độ khử trùng đến tạo vật liệu ỉn vitro 27 Hình 3.2 Mau sau ngày .28 Hình 3.3 Mau chồi in vitro 28 Hình 3.4: Anh hưởng BAP đến trình tái sinh chồi bên cẩm chướng in vỉtro (sau tuần nuôi cấy) 30 Hình 3.5 Sự tạo chồi ảnh hưởng BAP .31 Hình 3.6 Lá cẩm chướng đơn ừong môi trường ВАР mg/1 (4 tuần nuôi cấy) 32 Hình 3.7 Chồi nách hoa cẩm chướng đơn ừong môi trường BAP lmg/1 (4 tuần nuôi cấy) 32 Hình 3.8 Ảnh hưởng a-NAA đến hình thành số lượng rễ 34 Hình 3.9 Ảnh hưởng a-NAA đến chiều dài rễ 34 Hình 3.10 Ảnh hưởng a-NAA đến hình thành rễ chồi cẩm chướng ỉn vitro 36,36 Hình 3.11 Sự hình thành rễ cẩm chướng môi trường bổ sung a-NAA nồng độ 0,2 т § л (sau ngày nuôi cấy) 37 Hình 3.12 Chiều dài rễ cẩm chướng môi trường bổ sung a-NAA nồng độ 0,2 mgA (sau ngày nuôi cấy) 37 Hình 3.13 Ảnh hưởng nước dừa đến chiều cao ch i 39 Hình 3.14 Ảnh hưởng nước dừa đến số chồi/mẫu 40 Hình 3.15 Ảnh hưởng nước dừa đến tạo rễ chồi cẩm chướng in vitro .40 Hình 3.16 Anh hưởng nước dừa đến khối lượng tươi .41 Hình 3.17 Chiều cao nuôi cấy môi trường MS đối chứng sau tuần 42 Hình 3.18 Chiều cao nuôi cấy môi trường nước dừa 10% - tuần 42 Hình 3.19 Chiều cao nuôi cấy môi trường nước dừa 25% - tuần 43 Hình 3.20 Khối lượng tươi cẩm chướng đối chứng - tuần .43 Hình 3.21 Khối lượng tươi cẩm chướng nước dừa 10% - tuần 43 Hình 3.22 Khối lượng tươi cẩm chướng nước dừa 25% - tuần 44 Hình 3.23: Anh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống vườn ươm 45 Hình 3.24 Hình ảnh hoa cẩm chướng đơn giống Mix thích nghi với môi trường tự nhiên 46 DANH MUC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục thiết bị thí nghiệm 18 Bảng 2.2 Các công thức thí nghiệm xác đinh hiệu quảcủachất khử trùng 20 Bảng 2.3.Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến tái sinh chồi 22 Bảng 2.4 Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng a-NAA đếnsự tạo rễ 22 Bảng 2.5 Các công thức nghiên cứu ảnh hưởng nước dừa đến sinh trưởng phát triển hoa cẩm chướng đơn giống Mix 23 Bảng 2.6 Công thức nghiên cứu thích nghi in vitro qua giá thể 24 Bảng 3.1 Hiệu khử trùng bề mặt dung dịch javel đến tạo vật liệu in vitro 26 Bảng 3.2 Anh hưởng BAP đến trình tái sinh chồi bên cẩm chướng in vitro (sau tuần nuôi cấy) 29 Bảng 3.3 Anh hưởng a-NAA đến trình tạo rễ cẩm chướng Mix (sau ngày nuôi cấy) 33 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến số tiêu sinh trưởng cẩm chướng in vitro 38,39 Bảng 3.5 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống vườn ươm 44 MỞ ĐÀU Lí chon đề tài ■ Cây cẩm chướng (Dianthus carryophyllus) thuộc họ cẩm chướng (icaryophyllaceae) có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản Họ cẩm chướng với khoảng từ 82 đến 120 chi vói khoảng 3.000 loài [16] Họ phổ biến rộng khắp giới cẩm chướng chủ yếu thân thảo, số loài ữong họ Cẩm chướng ữồng làm cảnh có màu sắc đẹp cẩm chướng trồng để cắt hoa trồng chậu nhỏ để nhà, công viên Ở Việt Nam năm gần xuất hoa tươi trở thành ngành sản xuất có thu nhập cao ổn định cho người sản xuất Tuy nhiên xuất hoa tươi đòi hỏi phải có điều kiện chặt chẽ từ giống, gieo trồng, chăm sóc đến thu hoạch, công nghệ bảo quản, đóng gói, vận chuyển, an toàn thực phẩm thị trường nhập Trong điều kiện nay, có doanh nghiệp Việt Nam đáp ứng yêu cầu hoa xuất đòi hỏi mẫu mã đẹp, kích thước đồng đều, đặc biệt bệnh Vì vậy, để có giống hoa bệnh hướng vận dụng công nghệ cao nuôi cấy mô; kỹ thuật canh tác bảo vệ thực vật tiên tiến; áp dụng công nghệ nhà lưới có mái che sáng áp dụng rộng rãi số sở sản xuất Đà Lạt số vùng khác Nuôi cấy mô tế bào có đóng góp quan ừọng để cải tiến giống trồng nhiều tiềm ứng dụng ừong tương lai Trong vài năm gần đây, vi nhân giống trở thành kỹ thuật đày hứa hẹn để nhân nhanh mở rộng sản xuất đối tượng thực vật người chọn lựa Vi nhân giống thực tế phiên thu nhỏ nhân dòng thực điều kiện vô trùng Kỹ thuật vi nhân giống hay nhân 38 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC DỪA ĐẾN SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA CÂY Nhiều nghiên cứu sinh trưởng, phát sinh hình thái in vitro thực vật có sử dụng nước dừa giai đoạn bánh tẻ bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho kết tốt, nước dừa có chứa axit amin, vitamin, khoáng chất chất điều hòa sinh trưởng thực vật auxin xytokinin, giúp kích thích phát triển thực vật (George Sherrington, 1984) Trong nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS đến sinh trưởng hoa cẩm chướng giống Mix in vỉtro Kết nhận thể bảng 3.4, hình 3.13, hình 3.14, hình 3.15, hình 3.16, hình 3.17, hình 3.18, hình 3.19, hình 3.20, hình 3.21và hình 3.22 Bảng 3.4.Ảnh hưởng nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến số tiêu sinh trưởng cẩm chướng ỉn vitro Nồng độ nước dừa bể sung CT (ĐC) CT CT 0% 10% 15% Khối Thời lượng gian Chiều cao Số nuôi cấy chồi (cm) chồi/mẫu Số rễ/mẫu tươi (g) cụm (tuần) chồi 2,83+0,57 1,33+0,27 1,50+0,03 0,11+0,01 4,50+0,50 1,50+0,30 4,17+0,97 0,24+0,03 6,33+0,07 1,6+0,30 5,75+0,92 0,50+0,06 4,42+0,24 3,67+0,17 5,00+0,12 0,17+0,01 7,25+0,28 5,00+0,08 8,67+1,67 0,38+0,08 9,17+0,47 11,6+0,53 14,25+1,10 1,09+0,05 3,75+0,08 4,00+0,18 5,00+1,25 0,19+0,03 39 CT CT 20% 25% 7,83+0,37 4,50+0,17 9,00+1,21 0,24+0,03 9,50+0,31 12,00+0,35 8,25+1,02 1,08+0,08 3,67+0,87 4,83+0,57 5,67+0,27 0,33+0,02 5,17+0,27 13,00+0,04 11,20+0,22 0,62+0,06 10,00+1,08 13,2+1,17 8,50+0,13 1,54+0,12 4,08+1,74 4,17+1,97 0,17+0,04 0,19+0,06 6,50+0,60 6,17+1,97 6,50+0,17 0,52+0,01 9,75+2,58 16,6+1,03 6,50+0,33 1,75+0,05 cm 12 10 Hình 3.13 Ảnh hưởng nước dừa đến chiều cao chồi 40 sổ lượng chồỉ/mẫu 18 16 14 ■ CT1 12 ■ CT2 10 HCT3 ■ CT4 ■ CT5 * tuần tuần tuần Thời gian Hình 3.14 Ảnh hưởng nước dừa đến số chồi/mẫu Số lượng rễ/mẫu 16 14 12 ■ CT1 10 ■ CT2 HCT3 ■ CT4 ■ CT5 tuần tuần tuần Thời gian Hình 3.15 Ảnh hưởng nước dừa đến tạo rễ chồi cẩm chướng ỉn vừro 41 нстз tu ầ n tu ầ n ■ СТ4 ■ СТ5 tu ầ n Thời gian Hình 3.16 Ảnh hưởng nước dừa đến khối lượng tươi Phân tích bảng 3.4 cho thấy nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm tăng số tiêu chồi cẩm chướng đơn in vitro Mức độ ảnh hưởng tùy thuộc vào nồng độ thòi gian nuôi cấy Sau tuần nuôi cấy, môi trường bổ sung nước dừa từ 10-25% cho kết chiều cao chồi у số chồi/mẫu tốt Cụ thể, chiều cao chồi dao động từ 9,17 cm CT đến 10,00 cm CT4, đối chứng đạt 6,33 cm (Hình 3.13) số chồi/mẫu dao động từ 11,6 (CT 2)-16,6 (CT4) (Hình 3.14) Tuy nhiên, số rễ hình thành lại cho kết ngược lại, cao CT2 có 14,25 Các công thức lại (kể đối chứng) dao động từ 5,75 (CT1-ĐC) đến 8,50 (CT4) (Hình 3.15) Khối lượng tươi cụm chồi tăng lên cụm chồi sinh trưởng môi trường có bổ sung nước dừa, tốt CT у CT 5( khối lượng tươi cụm đạt 1,54 g 1,75 g) Ở CT CT đạt lượt 1,09 g 1,08 g CT1 (ĐC) đạt 0,50 g (Hình 3.16).Từ kết thu rút việc sử dụng nước dừa nồng độ 25% nhận kết tốt kinh tế 42 Hình 3.17.Chiều cao nuôi cấy môi trường MS đổi chứng sau tuần Hình 3.18 Chiều cao nuôi cấy môi trường nước dừa 10% tuần 43 Hình 3.19 Chiều cao nuôi cấy môi trường nước dừa 25% tuần ị * ■ V 0.3 ? Hình 3-20- KHfo ltt9®stiro1 [...]... nhân giống có hiệu quả cao, đáp ứng thị trường, chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài “NHÂN NHANH CÂY HOA CẨM CHƯỚNG GIỐNG MIX (Dianthus Mix) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO 2 Mục đích nghiên cứu Nhân nhanh cây hoa cẩm chướng đơn giống Mix (Dỉanthus Mix) bằng kỹ thuật nuôi cấy ỉn vỉtro 3 Nhiệm vụ nghiên cứu - Tạo vật liệu khởi đầu ỉn vitro từ đốt thân của cây cẩm chướng ngoài tự nhiên - Tái sinh và nhân. .. và nhân nhanh cây hoa cẩm chướng thông qua phát triển chồi chính và chồi nách - Tìm hiểu ảnh hưởng của nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy tói một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây cẩm chướng in vỉtro - Ra rễ tạo cây con in vitro hoàn chỉnh - Rèn luyện cây con ngoài vườn ươm 3 - Khảo sát sinh trưởng và phát triển của cây hoa cẩm chướng đơn giống Mix được nhân bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro 4 Ỷ... nơi có nhân công rẻ Các quy trình vi nhân giống đã được phát triển trên nhiều đối tượng cây cảnh, chẳng hạn như cây hoa lay ơn [10], [15], hoa hồng, [30], [37], hoa cúc [33], [35], hoa cẩm chướng [21], [26] và cây hoa lan [7], [13] Giống hoa cẩm chướng Dỉanthus Mix là một trong những giống hoa đẹp đang được trồng khá phổ biến ở khu vực Mê Linh - Hà Nội, nhu cầu về giống tốt, sạch bệnh là rất lớn Vì vậy,... nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần bổ sung các qui trình nhân giống các loại cây trồng bằng kĩ thuật ỉn vitro 4.2.Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần đưa ra qui trình nhân nhanh hoa cẩm chướng đơn giống Mix tạo ra nguồn giống cho sản xuất 4 NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÂY HOA CẨM CHƯỚNG... d Đặc điểm hoa cây cẩm chướng: Cây cẩm chướng có 2 dạng: Hoa đơn và hoa kép Hoa mọc đơn, từng chiếc một Hoa nằm ở đàu cành và mang nhiều màu sắc Ngay cả trên một hoa cẩm chướng kép cũng có từ 2 màu khác nhau trở lên Nụ hoa có đường kính 2-2,5 cm Hoa khi nở hoàn toàn có đường kính khoảng 5-8 cm Hạt cẩm chướng nhỏ, nằm ữong quả Mỗi quả thường có từ 100- 600 hạt e Công dụng y học: Hoa cẩm chướng còn được... các loài cẩm chướng (Dỉanthus), nhiều loài được trồng làm cây cảnh 1.1.2.Đặc điểm sinh học a Đặc điểm hệ rễ cây hoa cẩm chướng: cẩm chướng có bộ rễ chùm, phát triển rất mạnh vào vụ chính để hút nước, dinh dưỡng Chiều dài của rễ 15-20 cm Khi vun gốc, cây cẩm chướng sẽ ra rễ phụ ở các đốt thân Rễ phụ cùng với rễ chính tạo thành bộ rễ khoẻ mạnh để giữ cây và hút thức ăn nuôi cây tươi tốt, ra hoa nhiều,... quá trình nhân giống ở quy mô công nghiệp Tính đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành, đặc biệt là ở các nước đang phát triển, nơi có nhân công rẻ 13 Các quy trình vi nhân giống đã được phát triển trên nhiều đối tượng cây cảnh, chẳng hạn như cây hoa lay ơn [10], [15], hoa hồng [30], [37], hoa cúc [33], [35], hoa cẩm chướng [21], [26] và cây hoa lan [7],... 2,4-D và BAP [9] 1.4 ỨNG DUNG KỸ THUÂT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THƯC VÂT • • TRONG NHÂN GIỐNG CÂY HOA CẨM CHƯỚNG Nhóm nghiên cứu Brar và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ và BAP đến quá trình tạo đa chồi từ chồi bên ở các giống cẩm chướng khác nhau {Dỉanthus caryophyllus) [6] số chồi được tạo ra phụ thuộc vào bản chất và nồng độ của cytokinin được sử dụng Giống cẩm chướng Barlo II Nora có số chồi... những kỹ thuật tốt nhất để nhân nhanh giống cây trồng bởi vì sự ổn định di truyền của các dòng được nhân ra Một đinh chồi và một chồi bên khi được sinh trưởng ừong điều kiện có nồng độ cytokinin cao thường phát triển chồi bên tạo thành cụm chồi, từ đó có thể được nhân lên thành các cụm chồi theo cách tương tự Quá trình nhân lên này có thể là vô hạn, từ đó có hàng triệu cây giống có thể được nhân lên... phát sinh chồi bất định từ mẫu lá ỉn vitro của cây hoa cẩm chướng Số chồi bất định cao nhất trên môi trường chứa BAP 4,4 I^M và NAA 2,205 I^M [4] Tác giả Watad và cộng sự (1996) đã đưa ra phương pháp tái sinh cây cẩm chướng hoàn chỉnh trên môi trường có bổ sung TDZ (4 mg/1) và NAA (7,35 ỊiM) [36] Nhóm nghiên cứu Arici và cộng sự (2009) đã phát triển một • • 17 quy trình để vi nhân giống in vitro cây hoa