TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƢỢNG SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ (Taxus wallichiana Zucc.) Vũ Bình Dương*; Nguyễn Văn Long* TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng tiêu chuẩn sở (TCCS) sinh khối tế bào (SKTB) Thông đỏ (Taxus wallichiana) Đối tượng phương pháp: SKTB Thông đỏ nuôi cấy môi trường lỏng Tiến hành khảo sát tiêu chất lượng chung theo Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV, định tính định lượng paclitaxel, baccatin III HPLC Kết quả: khảo sát tiêu chất lượng SKTB Thông đỏ Từ đưa tiêu chất lượng sản phẩm, bao gồm: hình thức cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan axít, định tính, định lượng, độ nhiễm khuẩn Trong đó, tiêu chất lượng quan trọng định tính, định lượng paclitaxel baccatin III: hàm lượng paclitaxel không < 0,03% baccatin III không 0,005% Kết luận: xây dựng thẩm định TCCS SKTB Thông đỏ Với TCCS xây dựng được, sử dụng kiểm nghiệm đánh giá chất lượng SKTB Thông đỏ thu từ trình nuôi cấy sinh khối * Từ khóa: Thông đỏ; Sinh khối tế bào; Tiêu chuẩn chất lượng; Nuôi cấy tế bào Initial Study of the Standardization of Cellmass of Taxus Wallichiana Summary Objective: Establishment of institutional standard of Taxus wallichiana cellmass Subjects and methods: Taxus wallichiana cellmass which was cultured in liquid media Evaluate general specifications as regulated by Vietnamese Pharmacopoeia IV, qualitative and quantitative determination of baccatin III by HPLC Results: All specification of Taxus wallichiana cellmass has been evaluated for standardization From which, we established the standard criteria of Taxus cellmass including: appearance, humidity, total ash, acid-insoluble ash, qualitative, quantitative, bacteria count In which, the most important specifications are qualitative and quantitative criteria of paclitaxel and baccatin III: the content of paclitaxel is recommended to be not less than 0.03% and baccatin III should be not less than 0.005% Conclusion: Institutional standard of taxus wallichiana cellmass has been established With the selected criteria, the Taxus cellmass can be evaluated for quality control during plant cell biomass production process * Key words: Taxus wallichiana; Cellmass; Quality control; Plant cell culture * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com) Ngày nhận bài: 14/11/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 25/12/2014 Ngày báo đăng: 29/12/2014 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) phân bố Cao nguyên Đà Lạt (Lâm Đồng) với số lượng cá thể nhỏ Đây dược liệu ghi sách đỏ cần lưu ý bảo vệ [2] Từ Thông đỏ chiết xuất paclitaxel (biệt dược taxol) sử dụng phổ biến hiệu điều trị nhiều loại ung thư như: ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư dày Tuy nhiên, việc khai thác Thông đỏ tự nhiên để chiết xuất paclitaxel khó đáp ứng nhu cầu điều trị ung thư (do tốc độ sinh trưởng chậm, hàm lượng hoạt chất thấp) Để khắc phục nhược điểm này, bên cạnh việc nghiên cứu nhân giống, trồng phát triển nguồn gen Thông đỏ, công nghệ SKTB thực vật hướng có triển vọng sản xuất hoạt chất từ dược liệu nói chung loài Thông đỏ nói riêng [3] Học viện Quân y nghiên cứu thành công quy trình SKTB Thông đỏ quy mô phòng thí nghiệm để chiết xuất paclitaxel dẫn chất sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [4] Để có cho việc thẩm định quy trình sản xuất sinh khối, sử dụng sản phẩm SKTB Thông đỏ cho chiết xuất paclitaxel hoạt chất ổn định, cần có nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm Chúng nghiên cứu đề tài nhằm: Khảo sát xây dựng TCCS SKTB Thông đỏ NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu thiết bị Sinh khối tế bào Thông đỏ thu hoạch từ nuôi cấy môi trường lỏng hildebrandt, rửa sạch, sấy khô (lô SH 03/2011); hóa chất, dung môi hữu đạt tiêu chuẩn tinh khiết tinh khiết phân tích; chất chuẩn paclitaxel baccatin III (Sigma) Thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt (Memmert GmbH + Co.KG D-91126 Schwabach FRG, Đức) Máy cất quay (Rotavapor R-200, Buchi, Đức); cân phân tích Sartorius (độ xác 0,1 mg); cân kỹ thuật (độ xác 0,01 g); máy ly tâm lạnh Universal 320 (Hettich, Đức); máy lắc siêu âm (Soniclean Úc); sắc ký lỏng hiệu cao (Waters 2695D, Mỹ) số trang thiết bị khác Phƣơng pháp nghiên cứu Tiến hành khảo sát tiêu chất lượng SKTB Thông đỏ theo phương pháp chung DĐVN IV [1] quy định với dược liệu gồm: hình thức, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan axít, độ nhiễm khuẩn - Định tính paclitaxel baccatin III: tiến hành định tính phương pháp HPLC [5], phân tích sắc ký đồ mẫu thử với dung dịch hỗn hợp chất chuẩn với mẫu Thông đỏ tự nhiên chuẩn - Định lượng paclitaxel baccatin III: phương pháp HPLC khảo sát trước [5] gồm: điều kiện sắc ký: cột Luna Phenomenex C18 (5 m, 250 mm x 4,6 mm); pha động:acetonitril:nước cất (chạy theo chương trình gradient), thể tích bơm mẫu (20 µl), detector PDA (238 nm), cột Luna (5 m); tốc độ dòng: 0,7 ml/phút Xử lý mẫu theo quy trình khảo sát [5] So sánh diện tích pic mẫu thử với paclitaxel baccatin III chuẩn Từ tính hàm lượng paclitaxel baccatin III mẫu sinh khối TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hình thức cảm quan Thấy SKTB Thông đỏ khối tế bào khô, xốp, màu nâu, nấm mốc, mùi lạ Độ ẩm Cân xác 1,000 g SKTB Thông đỏ Tiến hành theo phương pháp mô tả phụ lục 9.6 - DĐVN IV Bảng 1: Kết xác định độ ẩm SKTB Thông đỏ (n = 5) g X g 1,1124 1,0568 5,00 1,1920 1,1429 4,12 1,1154 1,0612 4,86 1,0256 0,9784 4,60 1,0325 0,9827 4,82 4,68 ± 0,34 ± SD Độ ẩm SKTB Thông đỏ 4,68 ± 0,34% Tro toàn phần Cân xác 1,500 g sinh khối, tiến hành xác định tro toàn phần theo phương pháp mô tả phụ lục 9.8 - DĐVN IV Bảng 2: Kết xác định tro toàn phần SKTB Thông đỏ (n = 5) (g) (g) X 1,5235 0,0943 7,19 1,5795 0,0979 6,20 1,5987 0,1092 6,83 1,5654 0,1001 6,39 1,5901 0,0976 6,14 ± SD 6,35 ± 0,28 Khối lượng tro toàn phần SKTB Thông đỏ 6,35 ± 0,28% Tro không tan axít Cân khoảng 1,500 g dược liệu, nung 4500C để thu tro toàn phần Tiếp tục thêm 25 ml dung dịch HCl 2M (TT), tiến hành theo phương pháp mô tả phụ lục 9.7 - DĐVN IV TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 Bảng 3: Kết xác định tro không tan axít SKTB Thông đỏ (n = 5) g X mg 1,5235 1,5795 1,5987 1,5654 1,5901 2,7 2,6 3,3 1,8 2,5 0,13 0,12 0,15 0,09 0,09 0,11 ± 0,02 ± SD Khối lượng tro không tan axít dược liệu SKTB Thông đỏ 0,11 ± 0,02% Định tính paclitaxel baccatin III Cân khoảng 500 mg SKTB Thông đỏ mẫu Thông đỏ tự nhiên Tiến hành định tính paclitaxel baccatin III theo phương pháp HPLC a 31.144 0.020 18.626 0.025 AU 0.015 0.010 0.005 0.000 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 Minutes 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 0.025 0.020 0.010 b 31.149 18.629 AU 0.015 0.005 0.000 -0.005 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 Minutes 28.00 30.00 0.025 0.020 AU 31.131 c 0.015 18.650 0.010 0.005 0.000 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 Minutes 28.00 30.00 Hình 1: Sắc ký đồ chuẩn (a), mẫu Thông đỏ tự nhiên (b) mẫu SKTB Thông đỏ (c) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 Đa số pic xuất mẫu Thông đỏ tự nhiên xuất pic mẫu SKTB Thông đỏ Tại thời điểm 18,6 phút 31,1 phút, sắc ký đồ mẫu SKTB xuất pic giống pic mẫu chuẩn baccatin III paclitaxel Như vậy, SKTB Thông đỏ có baccatin III paclitaxel Định lƣợng paclitaxel baccatin III Cân xác 500,0 mg SKTB nghiền mịn cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm 10 ml methanol, lắc xoáy với tốc độ 1.000 vòng/phút phút Ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút 10 phút Gạn lấy dịch, SKTB ống ly tâm chiết lần nữa, lần với 10 ml methanol Gộp dịch ly tâm, chuyển vào bình gạn có sẵn 25 ml dung dịch natri clorid 5%, lắc Loại tạp n-hexan lần, lần 10 ml, gạn bỏ dịch chiết nhexan Lớp nước lắc kỹ với dicloromethan lần, lần 15 ml Gộp dịch chiết dicloromethan, lọc qua natri sulfat khan Sau lọc xong, rửa lớp natri sulfat - ml dicloromethan Gộp dịch lọc dịch rửa dicloromethan, bốc dung môi 350C dòng khí nitơ tới cắn Hòa cắn vừa đủ ml methanol Lọc qua màng lọc 0,45 m, dung dịch tiêm sắc ký Bảng 4: Kết xác định hàm lượng paclitaxel baccatin III SKTB Thông đỏ (n = 6) mg mg X KHỐI LƯỢNG PACLITAXEL (mg) KHỐI LƯỢNG BACCA TIN III (mg) 524,5 4,98 0,1809 0,0363 0,0324 0,0065 498,6 5,04 0,1747 0,0369 0,0270 0,0057 516,7 4,97 0,1743 0,0355 0,0304 0,0062 505,2 4,45 0,1743 0,0361 0,0304 0,0063 501,9 4,69 0,1708 0,0357 0,0277 0,0058 517,4 4,87 0,1742 0,0354 0,0300 0,0061 0,1749 ± 0,0030 0,0360 ± 0,0006 0,0297 ± 0,0018 0,0061 ± 0,0003 ± SD Hàm lượng paclitaxel baccatin III SKTB Thông đỏ 0,0360% 0,0061% Độ nhiễm khuẩn Bảng 5: Kết đánh giá độ nhiễm khuẩn SKTB Thông đỏ Y ª u K Õ t K Õ t Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại không 104/01 g 142 ± 12 Đạt Tống số Enterobacteria không 500/01 g 94 ± 11 Đạt Nấm mốc không 100/01 g 22 ± Đạt Không có Salmonella/10 g Không có Đạt Mẫu Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus./01 g Không có Đạt TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 Độ nhiễm khuẩn mẫu SKTB Thông đỏ đạt mức DĐVN IV Đây mức công bố phù hợp cho thuốc, bán thành phẩm từ dược liệu Từ kết đánh giá trên, vào quy định chung DĐVN IV, đưa TCCS SKTB Thông đỏ gồm tiêu sau: - Nguồn gốc: khối tế bào Thông đỏ tạo công nghệ SKTB thực vật từ nguồn thân non Thông đỏ tự nhiên (Taxus wallichiana Zucc.) SKTB Thông đỏ thu hoạch từ hệ thống bioreactor, lọc, rửa, sấy khô - Hình thức: khối tế bào khô, xốp, màu nâu, nấm mốc, mùi lạ - Độ ẩm: không 12% - Tro toàn phần: không 8% - Tro không tan axít: không 2% - Định tính: phải thể phép thử định tính paclitaxel baccatin III - Định lượng: + Hàm lượng paclitaxel SKTB Thông đỏ không < 0,03% + Hàm lượng baccatin III SKTB Thông đỏ không < 0,005% - Độ nhiễm khuẩn: đạt mức IV DĐVN IV Bản TCCS Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương thẩm định Tiến hành kiểm nghiệm mẫu SKTB Thông đỏ theo TCCS đề xuất Kết mẫu đạt tiêu chất lượng theo TCCS công bố (phiếu kiểm nghiệm số: 42TCH/01 ngày 11 - 12 - 2011 Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương) Như vậy, TCCS khảo sát sử dụng để kiểm nghiệm, đánh giá chất lượng mẫu SKTB Thông đỏ thu từ trình nuôi cấy SKTB 10 KẾT LUẬN Đã khảo sát tiêu chất lượng SKTB Thông đỏ Từ đưa tiêu chất lượng sản phẩm, bao gồm: hình thức cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan axít, định tính, định lượng, độ nhiễm khuẩn Trong đó, tiêu chất lượng quan trọng định tính, định lượng paclitaxel baccatin III: hàm lượng paclitaxel không 0,03% baccatin III không < 0,005% Với tiêu chất lượng khảo sát được, sử dụng kiểm nghiệm đánh giá chất lượng SKTB Thông đỏ thu từ trình nuôi cấy sinh khối TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế Dược điển Việt Nam Nhà xuất Y học 2009 Đỗ Huy Bích CS Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 2009, tr.897-900 Phan Đình Châu, Vũ Bình Dương Sản xuất thuốc điều trị ung thư paclitaxel từ loài Thông đỏ công nghệ SKTB thực vật Tạp chí Thông tin Y Dược học 2011, số 8, 9, tr.7-10, 1215 Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Phạm Văn Hiển, Chử Đức Thành Nghiên cứu nuôi cấy SKTB Thông đỏ Việt Nam môi trường lỏng Tạp chí Y - Dược học Quân 2011, 8, tr.7-14 Vũ Bình Dương, Đào Văn Đôn, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Thị Thiện, Phạm Thị Thanh Hà Nghiên cứu định lượng hoạt chất sinh khối Thông đỏ phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tạp chí Dược học 2010, 9, tr.21-24