BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐẶNG KIM THU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG KHỐI U THỰC NGHIỆM CỦA SAPONIN TOÀN PHẦN VÀ PHYTOSOME SAPONIN TỪ TAM THẤT (PANAX NOTOGINSENG (BURK.) F.H.CHEN) TRỒNG Ở TỈNH LÀO CAI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐẶNG KIM THU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG KHỐI U THỰC NGHIỆM CỦA SAPONIN TOÀN PHẦN VÀ PHYTOSOME SAPONIN TỪ TAM THẤT (PANAX NOTOGINSENG (BURK.) F.H.CHEN) TRỒNG Ở TỈNH LÀO CAI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ VÀ DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 60720405 Người hướng dẫn khoa học: TS Bùi Thanh Tùng TS Nguyễn Thùy Dƣơng HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực hoàn thành luận văn nhận nhiều giúp đỡ từ gia đình, thầy cô bạn bè Chính vậy, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: TS Bùi Thanh Tùng, Giảng viên Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy tận tình dạy mà động viên nhiều trình hoàn thiện luận văn TS Nguyễn Thùy Dương, Giảng viên Bộ môn Dược lực, Đại học Dược Hà Nội, người thầy bảo, cho lời khuyên bổ ích trình thực luận văn PGS TS Nguyễn Thanh Hải, Phó Chủ nhiệm phụ trách Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước: “Nghiên cứu phát triển (theo hướng GACP) bào chế số chế phẩm từ dược liệu Ô đầu, Ý dĩ, Tam thất, Đan sâm vùng Tây Bắc” Mã số: KHCN-TB.05C/13-18 TS Vũ Đức Lợi, Giảng viên Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyển, Khoa Y Dược hỗ trợ hoàn thiện luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu toàn thể cán Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện để lĩnh hội kiến thức quý giá suốt thời gian học tập, nghiên cứu trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Gia đình, Bạn bè đặc biệt Bố Mẹ sát cánh động viên hoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 03 năm 2016 Học viên Đặng Kim Thu MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Đại cương bệnh ung thư 1.1.1 Khái niệm bệnh ung thư 1.1.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh ung thư 1.1.3 Nguyên nhân gây ung thư 1.1.4 Cơ chế bệnh sinh 1.1.5 Điều trị ung thư 1.2 Tổng quan tam thất 12 1.2.1 Tên khoa học 12 1.2.2 Đặc điểm thực vật 12 1.2.3 Đặc điểm phân bố 13 1.2.4 Thành phần hóa học 13 1.2.5 Phytosome saponin từ tam thất 16 1.2.6 Tác dụng sinh học 18 1.3 Sơ lược mô hình đánh giá tác dụng chống khối u 19 1.3.1 Mô hình đánh giá tác dụng in vitro tế bào ung thư 19 1.3.2 Mô hình gây khối u vú thực nghiệm 20 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 22 2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 22 2.2 Phương tiện nghiên cứu 24 2.2.1 Tế bào ung thư 24 2.2.2 Động vật thí nghiệm 25 2.2.3 Hóa chất 25 2.2.4 Thiết bị nghiên cứu 26 2.3 Nội dung nghiên cứu 26 2.4 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Nghiên cứu độc tính hai dòng tế bào ung thư vú ung thư phổi in vitro saponin toàn phần phytosome saponin 27 2.4.2 Nghiên cứu tác dụng chống khối u saponin toàn phần phytosome saponin mô hình gây u vú thực nghiệm 29 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 33 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 Kết đánh giá độc tính hai dòng tế bào ung thư vú ung thư phổi in vitro saponin toàn phần phytosome saponin 34 3.1.1 Kết định tính phương pháp quan sát hình thái tế bào 34 3.1.2 Kết định lượng phương pháp MTS 38 3.2 Kết đánh giá tác dụng chống khối u saponin toàn phần phytosome saponin mô hình gây u vú thực nghiệm 39 3.2.1 Khối lượng thể 39 3.2.2 Thể tích khối u 42 3.2.3 Các số sinh hóa 44 Chƣơng BÀN LUẬN 51 4.1 Về độc tính hai dòng tế bào ung thư vú ung thư phổi in vitro saponin toàn phần phytosome saponin tam thất 51 4.1.1 Về định tính phương pháp quan sát hình thái tế bào 51 4.1.2 Về định lượng phương pháp MTS 52 4.2 Về tác dụng chống khối u saponin toàn phần chiết xuất từ tam thất phytosome saponin mô hình gây u vú thực nghiệm 53 4.2.1 Về mô hình gây u vú thực nghiệm DMBA 53 4.2.2 Về ảnh hưởng saponin toàn phần phytosome saponin lên khối lượng thể chuột thể tích khối u 54 4.2.3 Về ảnh hưởng saponin toàn phần phytosome saponin lên hoạt tính peroxyd hóa lipid hoạt độ enzym chống oxy hóa 55 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt tắt ADP Adenosin Diphosphat BuOH Butanol CAT Catalase COX-2 Cyclooxygenase-2 CT Computed Tomography Chụp quét cắt lớp điện toán DCEG Division of Cancer Trung tâm Dịch tễ học Di Epidemiology and Genetics truyền học Ung thư Acid deoxyribonucleic DNA Deoxyribonucleic Acid DMBA 7,12-dimethylbenzaanthracene DMSO Dimethyl sulfoxide 10 DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 11 ĐCDM Đối chứng dung môi 12 ĐMSH Đối chứng sinh học 13 GPx Glutathione peroxidase 14 HPV Human papillomavirus Virut HPV 15 IC50 Inhibitory concentration Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử 16 JNK c-Jun N-terminal kinase 17 NO Nitric oxyd Nitơ oxyd 18 MAPK Mitogen-activated protein Protein kinases hoạt hóa phân kinases bào 19 MPTP 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine 20 MTS - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – - (3-carboxymethoxyphenyl) – - (4-sulfophenyl) - 2H – tetrazolium 21 LDL low-density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp 22 LPO Lipid peroxidation Peroxy hóa lipid 23 LPS Lipopolysaccharide 24 PPD Protopanaxadiol 25 PPT Protopanaxatriol 26 TLC Thin layer chromatography 27 SOD Superoxide dismutase 28 ROS Reactive Oxygen Species Gốc phản ứng oxy 29 WHO World Health Organization Tổ chức y tế giới Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC BẢNG STT Ký hiệu Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số saponin thuộc nhóm protopanaxadiol 14 Bảng 1.2 Một số saponin thuộc nhóm Protopanaxatriol 15 Bảng 2.1 Dãy nồng độ thử độc tính saponin, saponin 28 phytosome paclitaxel dòng tế bào Bảng 3.1 Giá trị IC50 saponin toàn phần, phytosome 38 Saponin paclitaxel hai dòng tế bào ung thư H460 BT474 Bảng 3.2 Kết khối lượng thể chuột nhóm chuột 40 theo thời gian Bảng 3.3 Ảnh hưởng paclitaxel, saponin toàn phần 42 phytosome saponin đến thể tích khối u chuột gây u DMBA Bảng 3.4 Ảnh hưởng pacxitaxel, saponin toàn phần, 44 phytosome saponin đến hoạt tính chống peroxide hóa lipid Bảng 3.5 Ảnh hưởng paclitaxel, saponin toàn phần phytosome saponin đến hoạt độ enzym chống oxy hóa 46 DANH MỤC HÌNH ST Ký hiệu Tên hình Trang Hình 1.1 Quá trình sinh ung thư tế bào Hình 1.2 Chu kỳ tế bào Hình 1.3 Cấu trúc hóa học saponin nhóm protopanaxadiol 14 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học saponin nhóm protopanaxatriol 15 Hình 1.5 Sự khác biệt phytosome liposome 17 Hình 2.1 Mẫu dược liệu tam thất 22 Hình 2.2 Sơ đồ bào chế phytosome saponin 23 Hình 2.3 Hình ảnh dòng tế bào ung thư nghiên cứu 25 Hình 2.4 10 Hình 2.5 11 Hình 3.1 12 Hình 3.2 13 Hình 3.3 T Quy trình thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư vú ung thư phổi Quy trình tiến hành thí nghiệm mô hình gây u thực nghiệm DMBA Hình ảnh tế bào H460 giếng ĐCSH (A) ĐCDM (B) Hình ảnh tế bào BT474 giếng ĐCSH (A) ĐCDM (B) Hình ảnh tế bào H460 tác dụng thuốc chứng dương paclitaxel nồng độ khác (100x5.6) 29 31 34 34 35 Hình ảnh tế bào H460 tác dụng saponin toàn 14 Hình 3.4 phần (A) 2,5 μg, phytosome Saponin (B) 7,5 μg 36 paclitaxel (C) 0,039 μg (100x5.6) Hình ảnh tế bào H460 tác dụng saponin toàn 15 Hình 3.5 phần (A) 1000 μg, phytosome Saponin (B) 3000 μg 36 paclitaxel (C) μg (100x5.6) 16 Hình 3.6 Hình ảnh tế bào BT474 tác dụng saponin toàn 37 phần (A) 2,5 μg, phytosome Saponin (B) 7,5 μg paclitaxel (C) 0,039 μg (100x5.6) Hình ảnh tế bào BT474 tác dụng saponin toàn 17 Hình 3.7 phần (A)1000 μg, phytosome Saponin (B)3000 μg 37 paclitaxel (C)5 μg (100x5.6) 18 Hình 3.8 Diễn biến khối lượng thể chuột nhóm theo thời gian 41 Ảnh hưởng paclitaxel, saponin toàn phần 19 Hình 3.9 phytosome saponin đến thể tích khối u chuột 43 gây u DMBA Ảnh hưởng Paclitaxel, Saponin toàn phần 20 Hình 3.10 phytosome saponin đến hoạt tính chống peroxide hóa 45 lipid (LOP) 21 Hình 3.11 Ảnh hưởng paclitaxel, saponin toàn phần phytosome saponin đến hoạt độ enzyme Catalase (CAT) 47 Ảnh hưởng paclitaxel, saponin toàn phần 22 Hình 3.12 phytosome saponin đến hoạt độ enzym Superoxide 48 dismutase (SOD) Ảnh hưởng paclitaxel, saponin toàn phần 23 Hình 3.13 phytosome saponin đến hoạt độ enzyme Glutathione peroxidase (GPx) 49 Liều dùng saponin toàn phần tam thất sử dụng thí nghiệm xuất phát từ liều dùng hàng ngày dược liệu người, có áp dụng phương pháp ngoại suy Từ mức liều saponin toàn phần này, tăng gấp ba để mức liều thử nghiệm Với phytosome saponin, tính toán mức liều cho lượng saponin phức hợp phytosome saponin tương ứng với lượng saponin có saponin toàn phần tam thất Từ mức liều tính này, tăng gấp ba để mức liều tương ứng với mức liều saponin toàn phần tam thất 4.2.2 Về ảnh hưởng saponin toàn phần phytosome saponin lên khối lượng thể chuột thể tích khối u Kết nghiên cứu cho thấy khối lượng thể chuột nhóm điều trị saponin toàn phần phytosome saponin tăng so với nhóm chứng bệnh, mức tăng phụ thuộc vào mức liều nhóm Nhóm điều trị phytosome saponin liều 450 mg/kg khối lượng thể chuột tăng có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng bệnh (p[...]... quan đến dược li u thì phytosome là một dạng bào chế có nhi u u điểm nổi trội Tại Việt Nam, qua tham khảo các tài li u chúng tôi thấy chưa có công bố nào về tác dụng chống ung thư của saponin toàn phần chiết xuất từ tam thất và dạng phức hợp phytosome saponin Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Đánh giá tác dụng chống khối u thực nghiệm của saponin toàn phần và phytosome saponin từ. .. saponin từ tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H .Chen) trồng ở tỉnh Lào Cai với hai mục ti u: 1 Xác định được hoạt tính gây độc trên hai dòng tế bào ung thư vú và ung thư phổi in vitro của saponin toàn phần và phytosome saponin 2 Đánh giá được tác dụng chống khối u của saponin toàn phần và phytosome saponin trên mô hình gây u vú thực nghiệm bằng DMBA 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng về bệnh ung thƣ... chứng minh rằng, saponin chiết xuất từ tam thất có khả năng gây độc và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư mà không ảnh hưởng tới các tế bào thường [74], [79] Gần đây, nghiên c u của tác giả Park và cộng sự về tác dụng chống khối u của dịch chiết tam thất đã cho rằng saponin chiết xuất từ tam thất có tác dụng chống khối u [56] Tuy nhiên, saponin có đặc điểm là sinh khả dụng không cao do đó rất cần... ERK1/2, JNK và p38 MAPK, và di chuyển của ti u đơn vị NF-κB p65 vào trong nhân tế bào [36] Tác dụng chống huyết khối Tam thất đã được sử dụng theo truyền thống để cầm m u, làm ngừng chảy m u trong và ngoài, giảm sưng và đau, cũng như để làm tan huyết khối, loại bỏ ứ m u và thúc đẩy tuần hoàn m u Các nghiên c u cũng cho thấy tam thất có tác dụng có lợi cho hệ tim như giảm cholesterol trong m u, giảm huyết... đi u trị các bệnh tim mạch vành, nhồi m u cơ tim, đau thắt ngực Tam thất với li u 200 mg/kg ức chế đáng kể quá trình kết tập ti u c u ở chuột bị tắc l u ở động mạch não giữa Kết tập ti u c u gây ra bởi ADP trên in vitro cũng bị ức chế bởi tam thất theo cách phụ thuộc vào nồng độ Hơn nữa, tam thất có thể làm tăng tính l u động của màng ti u c u [25], [39], [82] 1.3 Sơ lƣợc mô hình đánh giá tác dụng chống. .. Đối tƣợng nghiên c u 2.1.1 Dược li u nghiên c u Củ tam thất được thu hái ở Simacai, Lào Cai vào tháng 10 năm 2014, rửa sạch, sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi và bảo quản trong túi nilon M u nghiên c u được xác định tên khoa học bởi ThS Nguyễn Quỳnh Nga và ThS Hoàng Văn Toán, Khoa Tài Nguyên Dược li u, Viện Dược li u Theo kết quả giám định, m u tam thất thu hái tại tỉnh Lào Cai có tên khoa học... mà tam thất có hi u quả trong việc phòng và đi u trị các bệnh về mạch m u [83] Tác dụng chống viêm Có một số nghiên c u cho thấy tam thất có tác dụng chống viêm Tam thất thực hiện tác dụng chống viêm thông qua sự ức chế chức năng bạch c u trung tính bao gồm phân hủy, sản sinh các gốc superoxide và leukotriene B4, và giảm sản sinh oxyd nitric (NO) và prostaglandin PGE2, mà có thể là nhờ giảm sự bi u. .. đi u trị toàn thân Đi u trị nội tiết Đi u trị ung thư bằng nội tiết đã được áp dụng từ l u, gần 2/3 ung thư tiền liệt tuyến di căn, 1/3 ung thư vú di căn đi u trị nội tiết có tác dụng làm bệnh thoái lui và bệnh nhân kéo dài thời gian sống Phần lớn ung thư nội mạc tử cung, một phần ung thư buồng trứng và một phần rất lớn ung thư giáp trạng cũng thu được những kết quả tốt Một số ung thư không liên quan... vú thực nghiệm bằng MNU được phát triển theo phương pháp của Gullino và cộng sự năm 1975 [29] N u như DMBA khi vào cơ thể cần có quá trình chuyển hóa để trở thành chất gây ung thư thì MNU là một tác nhân alkyl hóa, khi vào cơ thể nó trực tiếp gây ung thư mà không cần quá trình chuyển hóa [66] Hiện nay đã có nhi u nghiên c u sử dụng MNU để gây u vú thực nghiệm và cho hi u quả gây u cao [65], [67] Chuột... triển li u pháp gen Tuy nhiên, kết quả đi u vẫn không khả quan Để giảm thi u bệnh ung thư và tử vong do ung thư người ta quan tâm nhi u hơn tới việc phòng ngừa ung thư bằng các biện pháp như thay đổi lối sống và việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ dược li u có tác dụng chống ung thư Tam thất là một loại thảo dược được sử dụng l u đời tại Trung Quốc để ngăn ngừa ung thư Gần đây, nhi u nghiên c u đã