HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG MÃ SỐ: 62 62 01 11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2016 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH TS RAMONA THIEME Phản biện 1: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC THÀNH Viện Công nghệ Sinh học Phản biện 2: PGS.TS HÀ VIẾT CƢỜNG Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: PGS.TS ĐẶNG TRỌNG LƢƠNG Viện Di truyền Nông nghiệp Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trong bệnh gây hại khoai tây, bệnh mốc sương Phytophthora infestans (Mont.) de Bary gây coi bệnh phổ biến nguy hại Trong điều kiện thuận lợi bệnh phát triển nhanh thành dịch, phá hủy toàn mùa màng vòng đến hai tuần lễ Việc sử dụng biện pháp phòng chống bệnh hại thuốc hóa học vừa gây ô nhiễm môi trường vừa tăng chi phí sản xuất (Darsow et al., 2008) không giảm thiệt hại hoàn toàn Hơn nữa, nấm mốc sương có tính di truyền linh động thích ứng cao nên dễ kháng loại thuốc hóa học Chọn giống kháng bệnh mốc sương coi biện pháp hiệu Chọn giống khoai tây kháng bệnh vào đầu kỷ 20 (những năm 1950 1960) tập trung vào việc sử dụng gen trội (R gọi gen Rpi) kháng mốc sương từ loài hoang dại Solanum demissum 11 gen R chuyển vào khoai tây Mặc dù gen kháng có hiệu cao, tính kháng giống mang gen kháng R nhanh chóng bị vượt qua nấm mốc sương có khả thích nghi với kháng nhanh (Fry, 2008; McDonald and Linde, 2002) Tuy nhiên, nhiều chiến lược khác xem xét để sử dụng nhiều gen kháng để tạo khả kháng đồng ruộng bền vững (Jones, 2001; Park et al., 2009; Darsow, 2014) sử dụng gen kháng từ nhiều loài hoang dại khác Các gen kháng từ nguồn khác tích tụ nhờ phương pháp lai chuyển gen truyền thống sử dụng chị thị phân tử (Tan et al., 2008, 2010) Các nghiên cứu gần cho thấy nhiều loài khoai tây dại mang nguồn gen kháng bệnh mốc sương cao (Szczerbakowa et al., 2005, Thieme et al., 2008, 2010) Tuy nhiên, khó để chuyển đặc tính kháng qua đường lai hữu tính loài hoang dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) chế cách ly sinh sản (Jackson and Hanneman, 1999), cụ thể khác biệt số lượng nhiễm sắc thể số cân nội nhũ (Borgato et al., 2007; Tiwari et al,, 2010) Để khắc phục rào cản lai nhà chọn giống sử dụng kỹ thuật nhiễm sắc thể, lai bắc cầu, thụ phấn mento, xử lý auxin cứu phôi Dung hợp tế bào trần để tạo lai, gọi lai soma, giải pháp để khắc phục rào cản lai xa (Oberwalder et al., 2000; Wielgat and Wasilewska, 2001) chuyển nhiều gen kháng vào khoai tây trồng Dung hợp tế bào trần hay lai soma chuyển tính trạng đơn gen đa gen từ loài hoang dại vào khoai tây bảo toàn hệ gen nhân tế bào chất (Gavrilenko et al., 2003) tạo nguồn vật liệu đa dạng mang mức kháng bệnh cao (Mattheij et al., 1992; Thach et al., 1993; Davey et al., 2005; Thieme et al., 2010) 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định thông số để tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần loài khoai tây dại nhị bội kháng bệnh mốc sương giống khoai tây trồng mẫn cảm với bệnh mốc sương Tạo lai soma dung hợp tế bào trần loài khoai tây dại nhị bội với giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại vào khoai tây trồng Tạo lai lại (backcross) lai soma với giống khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen kháng có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây kháng bệnh mốc sương Việt Nam 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Trên sở thu thập nguồn vật liệu quý dòng khoai tây dại mang nguồn gen kháng bệnh mốc sương, đề tài tập trung nghiên cứu quy trình tách, dung hợp tạo thể lai soma cải thiện khả kháng bệnh mốc sương đồng thời tổ hợp tính trạng quý từ khoai tây trồng Trên đa dạng di truyền tạo tiền hành đánh giá, chọn lọc thể lai soma có khả kháng bệnh mốc sương mang đặc tính nông sinh học quý 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đã xác định thông số để dung hợp tế bào trần khoai tây dại mang gen kháng bệnh mốc sương khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho dòng/giống; thời gian ủ thích hợp mẫu dung dịch enzyme dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung hợp thông số 800 kHz với lần xung; mật độ tế bào thích hợp để xung điện từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml; môi trường nuôi cấy sản phẩm sau dung hợp môi trường VKMII lỏng; môi trường Cul-medium để tạo callus môi trường RJM để tái sinh chồi Đã lai thành công soma dung hợp tế bào khoai tây dại nhị bội (2x) mang gen kháng bệnh mốc sương (S bulbocastanum, S pinnatisectum, S tarnii) với giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) tứ bội (4x) mẫn cảm với bệnh mốc sương (Agave, Atlantic, Delikat, Quarta Rasant) có suất chất lượng tốt Các lai soma tổ hợp lai dòng khoai tây dại S.bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4, 2181/10 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sương Rpi-blb1 Rpi-blb3 nguồn vật liệu kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh Việt Nam Đã lai trở lại thành công lai soma với khoai tây trồng tạo 11 tổ hợp lai chọn lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 13.1303.11) mang gen kháng bệnh mốc sương đồng thời có đặc điểm nông sinh học phù hợp, nguồn vật liệu có giá trị cho chọn giống khoai tây kháng bệnh nước ta 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN 1.5.1 Ý nghĩa khoa học Đây nghiên cứu có tính khoa học chuyên sâu di truyền chọn giống trồng Đề tài bước phát triển kỹ thuật cao công nghệ tế bào thực vật (kỹ thuật dung hợp tế bào trần) tạo giống khoai tây Các kết đề tài có giá trị khoa học nước quốc tế Đề tài góp phần chứng minh khả chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài khoai tây dại sang giống khoai tây trồng thông qua dung hợp tế bào trần ứng dụng thành công kết chọn tạo giống khoai tây trồng kháng loại bệnh quan trọng 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu chọn tạo thành công dòng lai soma khoai tây trồng giống Delikat (blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat dòng 13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 13.1303.11 có khả kháng bệnh mốc sương đồng thời có đặc điểm nông sinh học phù hợp Đây nguồn vật liệu có giá trị cho chương trình chọn giống khoai tây kháng bệnh mốc sương Việt Nam PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT KHOAI TÂY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Theo số liệu tổng kết FAOSTAT (2014), tổng diện tích trồng khoai tây giới năm 2013 19.463.041 ha, khu vực Châu Á chiếm 51,68% tổng diện tích trồng khoai tây giới, Việt Nam có diện tích trồng khoai tây năm 2013 23.077 ha) Năng suất bình quân giới 18,9 tấn/ha suất bình quân thực tế Việt Nam đạt 13,6 tấn/ha Vấn đề khó khăn ngành sản xuất khoai tây giống, đặc biệt giống khoai tây bệnh Hiện giống khoai tây nước đáp ứng từ 20-25% nhu cầu, số lại phải nhập từ Trung Quốc, Hà Lan… 2.2 NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI VÀ TÌNH HÌNH KHAI KHÁC NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI Có nhiều loài dại phát mang đặc tính kháng sâu bệnh chống chịu với điều kiện bất thuận phát khai thác vào nguồn gen khoai tây trồng Ross (1986) có loài khoai tây dại khai thác cho giống khoai tây trồng Châu Âu bao gồm: S demissum (kháng mốc sương, PLRV), S acaule (Kháng PVX, PLRV, PSTV, wart, Globoder chịu sương giá), S stoloniferum (Kháng PVA, PVY), S chacoense (Kháng PVA, PVY, mốc sương, Colorado beetle, bọ nhậy), S spegazzinii (kháng Fusarium, wart, Globodera), S vernei (kháng GloboderaI, có hàm lượng tinh bột cao) Theo thời gian, nguồn gen kháng từ loài khoai tây dại khai thác chuyển vào nguồn gen khoai tây trồng 2.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƢƠNG PHÁP DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN Những khâu quan trọng kỹ thuật bao gồm: tách, nuôi cấy tái sinh tế bào trần; dung hợp tế bào trần; chọn lọc thể lai soma Để tách tế bào trần người ta sử dụng hai phương pháp tách học tách enzyme Trong phương pháp enzyme sử dụng rộng rãi có hiệu cao.Tế bào trần sau tách nuôi cấy môi trường thích hợp có khả tái tạo thành tế bào, phân chia tạo hoàn chỉnh Những yêu cầu mặt dinh dưỡng cho việc nuôi cấy tế bào trần gần giống với môi trường nuôi cấy mô tế bào Các phương pháp nuôi cấy nói chung nhiều tác giả công bố có phương pháp nuôi cấy dịch huyền phù giọt Tế bào trần hòa lơ lửng môi trường lỏng mật độ khoảng 10 tế bào trần /ml hộp chứa lớp mỏng môi trường nuôi cấy điều kiện tĩnh Quá trình nuôi cấy giọt phát triển Kao et al (1974) Các tế bào trần sau nuôi cấy thường có biểu tăng thể tích tế bào chất, tăng kích thước phát sinh hầu hết quan tử (chủ yếu lục lạp) tụ thành đám quanh nhân (có thể quan sát rõ kính hiển vi) Tỷ lệ tái tạo độ thành thục thành tế bào trình nuôi cấy phụ thuộc vào yếu tố: giai đoạn phân hóa tế bào trần, điều kiện tách tế bào trần tính đặc thù loài thực vật Quá trình tái tạo thành tế bào diễn vài sau tách hoàn thiện sau 2-7 ngày Sau thành tế bào tái tạo hoàn chỉnh, tế bào trần không giữ nguyên hình dạng ban đầu (Nguyễn Quang Thạch cs., 2009) Sự phân chia diễn liên tục tạo thành cụm đa bào goi microcallus (những cụm đa bào kết tái tạo thành phân chia tế bào) Sau 3-8 tuần thu marcocallus với kích thước 0,5-1,5mm nằm bề mặt thạch Các marcocallus cấy chuyển tiếp sang môi trường tái sinh RJM (Möllers and Wenzel, 1992), đặt điều kiện nuôi cấy macrocallus Khoảng 812 tuần sau cấy chuyển, marcocallus tái sinh thể chồi Các thể chồi chuyển sang môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) để tạo hoàn chỉnh Hai đối tượng tế bào đem lai dung hợp thành tế bào cách tự phát cảm ứng tác nhân hóa chất (dung hợp hóa chất polyethylen glycol, ký hiệu PEG) hay xung điện (dung hợp xung điệnelectrofusion) Đối với khoai tây người ta sử dụng hai phương pháp Tuy nhiên so với phương pháp dung hợp hóa chất, dung hợp xung điện áp dụng phổ biến đạt hiệu cao hơn thao tác đơn giản, tốc độ nhanh, hiệu suất dung hợp cao thời điểm gây độc tế bào Phương pháp dung hợp hóa chất PEG thường gây độc cho tế bào trần không rửa hết PEG, ảnh hưởng đến khả tái sinh sau (Nguyễn Quang Thạch cs., 2009) Nhìn chung khoảng 20%-25% tế bào trần bị kích thích dung hợp yếu tố kích thích hình thành thể nhân 50-70% (Nguyễn Quang Thạch cs., 2009) Tuy nhiên, nhận biết thể dị nhân không đơn giản, cần phải có phương pháp chọn lọc đặc trung Việc tách cá thể lai heterocariot (dị nhân) khỏi cá thể đồng dung hợp hay chưa dung hợp tái sinh quan trọng Trong mục tiêu nghiên cứu lý thuyết, người ta sử dụng “bố”, “mẹ” có đặc trưng khác để dễ dàng lọc thể lai môi trường chọn lọc Bằng phương pháp thị phân tử (AFLP, RAPD, RELP, PCR) isozyme xác định xác lai soma mang gen bố mẹ dung hợp 2.4 BỆNH MỐC SƢƠNG TRÊN CÂY KHOAI TÂY Bệnh mốc sương nấm Phytophthora infestans gây bệnh gây hại nghiêm trọng bậc cho khoai tây, đặc biệt bệnh bùng phát thành dịch nguy hiểm vùng chuyên canh Một nguồn gen kháng mốc sương phát gần tập trung nghiên cứu gen kháng có nguồn gốc từ loài khoai tây dại Solanum bulbocastanum Đây loài dại nhị bội, có nguồn gốc từ vùng trung Mỹ, phát triển vùng đồi núi có độ cao từ 1200 đến 2300 mét so với mực nước biển, thuộc đông bắc Mexico (Spooner et al., 2005) Cho đến nhà khoa học phát nhân dòng gen kháng bệnh mốc sương có nguồn gốc từ loài dại Solanum bulbocastanum thuộc vùng lặp giàu Leucine (NBS-LRR), bao gồm: Gen Rpi-blb1 (van der Vossen et al., 2003) hay biết đến với tên RB (Song et al., 2003); gen Rpi-blb2 (van der Vossen et al., 2005); gen Rpiblb3 (Lokosou et al., 2009); gen Rpi-bt1 (Oosumi et al., 2009) phát từ phép lai S bulbocastanum S tuberosum 2.5 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY 2.5.1 Chọn tạo giống khoai tây phƣơng pháp truyền thống Các phương pháp chọn tạo khoai tây truyền thống thường áp dụng kỹ thuật lai tạo, lai lại (backcross), đột biến chọn lọc (Kuckuck et al., 1985) Nhược điểm phương pháp truyền thống vấp phải khó khăn mặt đặc tính di truyền kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum) 2.5.2 Chọn tạo giống khoai tây phƣơng pháp chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen khoai tây ứng dụng để chuyển gen kháng bệnh virus, kháng bệnh mốc sương, bệnh tuyến trùng (root-knot), héo xanh (Verticillium wilt) rệp Tuy nhiên phương pháp chuyển gen nhiều hạn chế: nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng chuyển vào trồng công nghệ gen chúng kiểm soát đa gen; gen kiểm soát tính trạng mong muốn chưa biết đến; nhiều gen khó để tách nhân dòng thành công; khoai tây lương thực, thực phẩm nên nhiều tranh cãi sử dụng sản phẩm chuyển gen (GMO) 2.5.3 Chọn tạo giống khoai tây phƣơng pháp dung hợp tế bào trần Đã có nhiều công trình công bố việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại để chuyển vào giống khoai tây trồng dung hợp tế bào trần lai hữu tính (Thieme et al., 2010): S Chacoense (Butenko et al., 1982); S.niggrum (Binding et al., 1982, 1988); S.brevidens (Austin et al., 1985; Helgeson, 1993); S.circaeifolium (Mattheij et al., 1992); S.berthaultii (Serraf et al.,1991); S.commersonii (Cardi et al., 1993); S.khasianum, S.aculeatissimum (Stattmann et al., 1994); S.torvum (Jadari et al., 1992); S.phureja (Puite et al., 1986); S.pinnatisectum (Sidorov et al., 1987, 1994; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995); S.bulbocastanum (Austin et al., 1993; Brown et al., 1995; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995) Thieme et al (1997) lai tạo thành công khoai tây trồng S tuberosum (2n = 2x 2n = 3x) với loài khoai tây dại nhị bội Mê-xi-cô (S.pinnasisexta S.bulbocastana) qua dung hợp tế bào trần xung điện Dinu and Thieme (2000) tạo thành công tổ hợp lai loài khoai tây dại với giống khoai tây trồng S tuberosum L., dòng khoai tây chọn tạo giống dòng nhị bội nhằm để chuyển gen kháng bệnh mốc sương gen kháng bệnh virus vào khoai tây trồng Thieme et al (2010) tạo lai không đa dạng hình thái, tính trạng nông sinh học mà chúng đồng thời kháng bệnh sâu hại Để chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài khoai tây dại Solanum michoacanum (mch) (có khả kháng bệnh mốc sương cao) vào khoai tây trồng Solanum tuberosum, phép lai soma dung hợp tế bào trần áp dụng mch với dòng khoai tây nhị bội DG 81-68 DG 88-89 giống khoai tây trồng tứ bội Rynal nhạy cảm với bệnh mốc sương (Smyda et al., 2013) Tiếp nối nghiên cứu này, Smyda et al (2016) dung thị DArT (Diversity array technology) để phân tích thành phần genom nhân 97 lai soma tổ hợp lai S.michoacanum với S.tuberosum 11 lai loài 4x mch (những lai có tính kháng bệnh mốc sương) Phân tích cấu trúc nhiễm sắc thể lai cho thấy có mặt hay mặt thị phân tử từ genom bố mẹ dọc theo chiều dài nhiễm sắc thể lai soma Ở Việt Nam, công nghệ mẻ Hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây lâu Việt Nam chủ yếu công tác nhập nội khảo nghiệm, sở đề xuất giống phù hợp cho sản xuất Gần đây, nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây có sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần bắt đầu tiến hành Việt Nam (Nguyễn Thị Phương Thảo cs., 2009, 2011, 2012; Đỗ Thị Thu Hà cs., 2012, Đinh Thị Thu Lê cs, 2012, Vũ Thị Thu cs., 2012) Tiếp tục hướng nghiên cứu này, tiến hành nghiên cứu tạo lai soma tổ hợp đặc tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại đặc tính nông học quý từ khoai tây trồng Đây hướng quan trọng để tạo vật liệu khởi đầu cho chương trình chọn tạo giống khoai tây Việt Nam PHẦN PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Nghiên cứu tiến hành Viện Sinh học nông nghiệp – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Viện Nghiên cứu chọn tạo giống trồng (Viện JKI- CHLB Đức) thời gian nghiên cứu từ năm 2011 đến năm 2015 3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Các dòng khoai tây dại kháng bệnh mốc sương: S bulbocastanum, S tarnii, S pinnatisectum thu thập từ Ngân hàng Gen khoai tây quốc tế Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK, Genebank) Các giống khoai tây trồng mang tính trạng nông sinh học quý thích nghi với điều kiện khí hậu Việt Nam 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.3.1 Nội dung 1: Tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng - Tách tế bào trần dòng khoai tây dại giống khoai tây Atlantic - Dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với dòng khoai tây trồng thu thập - Nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai sau dung hợp 3.3.2 Nội dung 2: Xác định lai soma phƣơng pháp đếm độ bội (Flow cytometry) thị phân tử SSR - Xác định lai soma phương pháp đếm độ bội Flow cytometry - Xác định lai soma thị phân tử SSR 3.3.3 Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma lây nhiễm nhân tạo thị phân tử - Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai soma lây nhiễm nhân tạo thị phân tử - Đánh giá lai soma tính trạng nông sinh học lai soma 3.3.4 Nội dung 4: Lai lại lai soma với giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc - Lai lại lai soma với giống khoai tây trồng - Đánh giá chọn lọc từ quần thể lai BC thu khả kháng mốc sương đặc tính nông sinh học 3.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1 Tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng 3.4.1.1 Tách tế bào trần dòng khoai tây dại giống khoai tây Atlantic Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nồng độ dung dịch enzym đến mật độ tế bào trần thu Vật liệu nhân 10-20 in vitro/mỗi kiểu gen bố mẹ bình thủy tinh từ 3-4 tuần tuổi, điều kiện 16 chiếu sáng 22oC, để nguyên liệu tối trước tiến hành thí nghiệm dung hợp Phương pháp tách tế bào trần (Theo quy trình Cooking et al (1960), có cải tiến theo Thach et al (1993) Thieme et al (1997)) Tiến hành tách tế bào trần nồng độ enzym khác nhau: E1 = Dung dịch enzym 1: có 0,2% Macerozym, 0,8% Cellulase; E2 = Dung dịch enzym 2: có 0,1% Macerozym, 0,6% Cellulase, E3 = Dung dịch enzym 3:có 0,1% Macerozym, 0,8% Cellulase; E4 = Dung dịch enzym 4: có 0,1% Macerozym, 1% Cellulase Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thời gian ủ mẫu dung dịch enzym đến mật độ tế bào trần thu Tiến hành ủ mẫu dòng/giống khoai tây (đã cắt nhỏ xử lý qua dung dịch gây co nguyên sinh) thời gian ủ khác dung dịch enzym: 13 giờ; 14 giờ; 15 16 3.4.1.2 Dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với dòng khoai tây trồng thu thập (Theo Thieme et al., 2008) Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng tần số dung hợp số lần xung đến chất lượng tế bào sau dung hợp Tiến hành dung hợp tế bào trần mật độ x 10 tế bào/ml dung dịch dung hợp với thông số dung hợp khác nhau: CT1: AC=700 kHz+ lần xung (Rokka et al., 1994), CT2: 800 kHz+ lần xung, CT3: 900 kHz+2 lần xung, CT4: 1000KHz+1 lần xung Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp Tiến hành thí nghiệm dung hợp với thông số dung hợp tối ưu tìm thí nghiệm với mật độ khác nhau: 1x 105 tế bào trần/ml ; 2x 105 tế bào trần/ml, x 105 tế bào trần/ml, x 105 tế bào trần/ml, x 105 tế bào trần/ml Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng kiểu gen khác đến khả tái sinh tế bào sau dung hợp Theo dõi ảnh hưởng tổ hợp lai khác đến kết tái sinh sau dung hợp 3.4.1.3 Nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai sau dung hợp Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy đến phân chia tế bào trần sau dung hợp xuất sau tuần lây nhiễm Tiến hành đo vết bệnh lần nhiễm bệnh 0,1% - 100% Đánh giá phản ứng bệnh toàn trình phát triển bệnh theo số tích lũy bệnh theo thời gian (Area Under Disease Progress Curve - AUDPC) số tích lũy bệnh theo thời gian tương đối (r) AUDPC; Phân tích sai khác (variance) sử dụng để đánh giá tất giống Kết so sánh với giống đối chứng) (Truberg et al., 2008) Thí nghiệm 15 Đánh giá có mặt gen kháng bệnh mốc sương thị phân tử Xác định gen kháng Rpi-blb lai soma có sử dụng mồi đặc hiệu gen: Rpi-blb1, (Wang et al., 2008) Rpi-blb3 (Lokossou et al., 2010) 3.4.3.2 Đánh giá lai soma tính trạng nông sinh học lai soma Thí nghiệm 16 Đánh giá lai soma tính trạng nông sinh học lai soma Các dòng lai soma dòng bố mẹ sau nuôi cấy in vitro tuần trồng vào vụ Đông – Xuân năm 2013-2014 cánh đồng thực nghiệm- Viện Sinh học Nông nghiệp để đánh giá tính trạng hình thái, sinh trưởng, phát triển, yếu tố cấu thành suất khả kháng bệnh Thí nghiệm bố trí lần lặp cho dòng, lần lặp lại 10 Phương pháp đánh giá: theo tiêu chuẩn ngành (số 32-1998/QĐ-BNN-KHCN ngày 24 tháng năm 1998) quy chuẩn Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (QCVN 01- 69:2011/BNNPTNT) 3.4.4 Lai lại lai soma với giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc Thí nghiệm 17 Đánh giá chọn lọc từ quần thể lai BC thu khả kháng mốc sương đặc tính nông sinh học Các hạt lai khoai tây xử lý ngủ nghỉ dung dịch Gibberelic Acid Solution (GA3 nồng độ 1mg/l) Khi hạt nảy mầm đến giai đoạn thật phun dịch lây nhiễm bệnh mốc sương (nồng độ dịch lây nhiễm 6000 túi bào tử/ml), Triệu chứng xất sau ngày, giữ lại khỏe loại bỏ bệnh Dùng thuốc trừ nấm phun phòng cho khỏe sau lây nhiễm Tiếp tục chăm sóc thu hoạch củ 3.5 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU + Số liệu thí nghiệm tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần xử lý theo chương trình EXCEL (thí nghiệm 1; 2; 3; 5) + Số liệu thí nghiệm đánh giá cho điểm bệnh mốc sương xử lý theo chương trình EXCEL, dùng hàm “standard deviation” (= stdev) để xác định sai số lần lặp lại (thí nghiệm 11; 12 13) 11 + Số liệu thí nghiệm đánh giá đặc tính nông sinh học lai (các tiêu: chiều cao cây, số củ trung bình/khóm, khối lượng củ trung bình/khóm thí nghiệm 16) xử lý thông kê đánh giá sai khác có ý nghĩa mức α = 0,05 theo phần mềm SAS 9.1 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ 4.1.1 Tách dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng 4.1.1.1 Tách tế bào trần dòng khoai tây dại giống khoai tây Atlantic a Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nồng độ dung dịch enzym đến mật độ tế bào trần thu Các loại dung dịch enzym khác có ảnh hưởng khác đến hiệu tách tế bào trần Để tách tế bào trần có hiệu suất cao nhất, dòng/giống khoai tây cần loại dung dịch enzyme phù hợp: dung dịch E1 (0,2% Macerozym 0,8% Cellulase) sử dụng để tách tế bào trần dòng/giống blb2G, trn3G, Rasant, Agave; dung dịch E2 (0,1% Macerozym 0,6% dùng để tách tế bào trần dòng/giống pnt2G Delikat; dung dịch E3 (0,1% Macerozym 0,8% Cellulase); dung dịch E4 (0,1% Macerozym 1% Cellulase) dùng để tách tế bào trần giống Atlantic b Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thời gian ủ mẫu dung dịch enzym đến hiệu suất tách tế bào trần Thời gian ủ mô dung dịch enzym có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu tách tế bào trần Thời gian ủ thích hợp mẫu dung dịch enzyme dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 (bảng 4.1) Bảng 4.1 Ảnh hƣởng thời gian ủ mô dung dịch enzym đến hiệu suất tế bào trần thu đƣợc Thời gian ủ (giờ) (số tế bào trần/ml) Tên dòng/giống 13 14 15 16 5 pnt2G 0,9 x 10 2,5 x 10 3,0 x 10 3,9 x 105 blb2G 1,4 x 105 2,9 x 105 2, x 105 3, x 105 trn3G 1,1 x 105 2,9 x 105 3,4 x 105 4,0x 105 Delikat 1,2 x 105 2,8 x 105 2,8 x 105 3,6 x 105 Quatar 1,2 x 105 2,9 x 105 3,3x 105 3,4 x 105 Rasant 2,4 x 105 3,8 x 105 2,8 x 105 4,6 x 105 Agave 2,1 x 105 3,9 x 105 2,5 x 105 4,4 x 105 Atlantic 2,1 x 105 3, x 105 2,1 x 105 3,5 x 105 12 4.1.1.2 Dung hợp tế bào trần dòng khoai tây dại với dòng khoai tây trồng thu thập a Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng tần số dung hợp số lần xung đến chất lượng tế bào sau dung hợp Tế bào dung hợp thông số CT2 (tần số 800kHz lần xung), tế bào có tỷ lệ nguyên vẹn cao, thời gian xuất hiện phân chia sớm (sau ngày nuôi cấy), microcallus hình thành sau 18 ngày nuôi cấy môi trường lỏng, số macrocallus hình thành/đĩa nhiều (trung bình 85,4 macrocallus/đĩa) (bảng 4.2) Bảng 4.2 Ảnh hƣởng tần số dung hợp số lần xung đến chất lƣợng tế bào sau dung hợp tổ hợp Solanum bulbocastanum Delikat Thời gian tế bào Thời gian xuất Số lƣợng STT CT phân chia (ngày) microcallus (ngày) macrocallus/đĩa CT1 21 49,5 CT2 18 65,4 28 27,6 CT3 CT4 24 38,2 Chú thích: CT1- AC=700 kHz+ lần xung (Rokka et al, 1994), CT2- 800 kHz+ lần xung, CT3- 900 kHz+2 lần xung, CT4- 1000KHz+1 lần xung b Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp Mật độ ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân chia tế bào tỷ lệ lai lục bội tạo thành Mật độ tế bào tham gia dung hợp cao tế bào phân chia sớm tỷ lệ lai lai lục bội (6x) tăng (bảng 4.3) Dung hợp mật độ x 105 tế bào/ml, tế bào cảm ứng nhanh phân chia sau ngày nuôi cấy Tỷ lệ lai 6x mật độ dung hợp 65,6% lai lai 6x Như mật độ xung cho hiệu dung hợp tạo lai 6x cao x 105 tế bào/ml (bảng 4.3) Bảng 4.3 Kết tái sinh độ bội lai tái sinh sau dung hợp mật độ tế bào dung hợp khác tổ hợp Solanum bulbocastanum Delikat Mật độ Thời gian Số Số Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ xung hợp xuất macrocallus/đĩa tái sinh 2x 4x 6x (tế bào/ phân chia Sau ngày (cây) (%) (%) (%) ml) (ngày) Sau tuần 28,5 16 56,3 25,0 18,7 1x 10 75,7 35 37,1 34,3 28,6 x 10 85,6 46 13,9 45,6 40,5 x 10 68,3 47 14,9 31,9 53,2 4x 10 62,6 29 10,3 24,1 65,6 x 10 Chú thích: dung hợp với thông số AC= 800 kHz, DC=120V lần xung c Thí nghiệm : Ảnh hưởng kiểu gen khác đến khả tái sinh tế bào sau dung hợp Toàn tổ hợp dung hợp phân chia tế bào xảy sau 2-3 ngày nuôi cấy Khả tạo macrocallus tái sinh chồi phụ thuộc vào tổ hợp dung hợp hay phụ thuộc vào 13 chất di truyền dòng nghiên cứu Tổng cộng tạo tổ hợp lai dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng (bảng 4.4) Bảng 4.4 Kết dung hợp dòng khoai tây dại nhị bội với giống khoai tây trồng tứ bội phƣơng pháp xung điện STT Tên tổ hợp lai Số lƣợng Số lƣợng chồi Tỷ lệ tái callus tái sinh tái sinh sinh (%) trn3G + Agave 120 39 32,5 trn3G + Rasant 97 25 25,8 blb2G + Delikat 250 31 12,4 trn3G + Delikat 250 64 25,6 Pnt2G + Atlantic 193 23 11,9 blb2G + Atlantic 307 1,3 trn3G + Atlantic 395 0,5 Tổng 1612 188 4.1.2 Nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai sau dung hợp a Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy đến phân chia tế bào trần sau dung hợp Trên môi trường lỏng VKMII, thời gian bắt đầu phân chia tế bào trần các tổ hợp lai từ sau 2-3 ngày bắt đầu phân chia phục thuộc vào tổ hợp lai khác Sau ngày nuôi cấy, toàn dòng phân chia tạo microcallus sau khoảng tuần nuôi cấy Trên môi trường lỏng, tế bào phân chia tạo hạt microcallus sau khoảng 10-14 ngày với chất lượng microcallus trắng sáng, kích thước hạt to hạt Trong tế bào trần môi trường bán lỏng (nhỏ giọt agar) có thời gian xuất phân chia lâu (sau từ 4-7 ngày) Trên môi trường rắn, tế bào khả phân chia có tổ hợp có xuất phân chia tế bào (blb2G + Delikat; trn3G + Delikat; blb2G + Atlantic) sau thời gian lâu nhiều (trên ngày) (bảng 4.5) Bảng 4.5 Sự phân chia tổ hợp lai sau dung hợp điều kiện môi trƣờng khác nhau* Thời gian xuất tế Thời gian xuất bào phân chia (ngày) microcallus (ngày) Tổ hợp lai Lỏng Bán lỏng Rắn Lỏng Bán lỏng Rắn trn3G + Agave 12 21 trn3G + Rasant 3 14 21 blb2G + Delikat 15 11 26 trn3G + Delikat 12 25 pnt2G + Atlantic 10 22 blb2G + Atlantic 11 12 23 trn3G + Atlantic 14 24 Chú thích: (*) 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp theo dõi phân chia tế bào nuôi cấy môi trường VKM II điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia 14 b Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng loại môi trường nuôi cấy đến phân chia tái sinh tổ hợp lai sau dung hợp Các tế bào trần nuôi cấy môi trường VKMII bắt đầu phân chia sau 23 ngày nuôi cấy tùy thuộc vào dòng khoai tây nuôi cấy Sau ngày nuôi cấy, toàn dòng phân chia tạo microcallus sau tuần nuôi cấy Các tổ hợp lai khác có phân chia hình thành microcallus khác môi trường VKMII Như vậy: môi trường VKMII lỏng môi trường thích hợp để nuôi cấy tạo microcallus tế bào trần sau dung hợp (bảng 4.6) Bảng 4.6 Sự phân chia tổ hợp lai môi trƣờng nuôi cấy khác Tổ hợp lai Thời gian xuất tế bào phân chia (ngày) Thời gian xuất Số lƣợng microcallus microcallus trung (ngày) bình/đĩa petri VK MII A* KM8P VKM KM8 VK A* * II P* MII A* KM8 P* trn3G + Agave 12 - - 22,7 - - trn3G + Rasant 14 21 - 13,3 4,4 - blb2G + Delikat 11 - - 29,6 - - trn3G + Delikat 12 21 - 35,7 - 5,8 Pnt2G + Atlantic 6 10 - 22 48,3 - 1,3 blb2G + Atlantic 12 - - 5,1 - - trn3G + Atlantic 14 21 - 9,4 5,9 - Chú thích: 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp theo dõi phân chia tế bào nuôi cấy môi trường lỏng điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia c Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng môi trường tái sinh khác đến tái sinh chồi tổ hợp lai Trên môi trường RJM, tổ hợp lai có khả tái sinh tạo chồi với số chồi trung bình/đĩa dao động từ 1,3-9,1 chồi/đĩa Khả tạo chồi tổ hợp lai khác khác rõ rệt Các tổ hợp lai trn3G + Delikat, pnt3G +Atlantic có khả tái sinh cao với số chồi trung bình/đĩa 8,8 6,4 Các chồi phát triển tốt, màu xanh Tổ hợp lai blb2G +Atlantic; trn3G +Atlantic có khả tái sinh kém, chất lượng chồi kém, màu trắng xốp (bảng 4.8) Tổng hợp kết nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai sau dung hợp thấy tái sinh tổng số 1612 callus tạo 188 chồi tỷ lệ tái sinh chồi tổ hợp lai khác rõ rệt (bảng 4.7) 15 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng môi trƣờng tái sinh khác đến khả tạo chồi tổ hợp lai Số lƣợng chồi tái sinh/chất lƣợng chồi Tổ hợp lai Môi trƣờng Môi trƣờng Môi trƣờng K8P RJM MSO trn3G + Agave 3,3/++ 0,8/+ 2,5/+ trn3G + Rasant 5,5/++ 1,6/+ 1,3/+ blb2G + Delikat 6,5/++ 0/2,4/+ trn3G + Delikat 8,8/++ 0/0,8/pnt2G + Atlantic 6,4/++ 1,65/+ 0/blb2G + Atlantic 1,7/+ 0/0/trn3G + Atlantic 2,3/0/0/(-): Chồi yếu, màu trắng; +: Chồi phát triển trung bình, màu vàng nhạt; ++: chồi tốt, mập, xanh 4.1.3 Xác định lai soma phƣơng pháp đo độ bội thể (Flow cytometry) thị phân tử SSR 4.1.3.1 Xác định lai soma phương pháp đo độ bội thể (Flow cytometry) Thí nghiệm 9: Xác định lai soma phương pháp đo độ bội Từ kết dung hợp tế bào trần tạo 07 tổ hợp lai dòng khoai tây dại nhị bội giống khoai tây trồng tứ bội Các tổ hợp lai nuôi cấy tái sinh để tạo microcallus, macrocallus tái sinh chồi Sử dụng phương pháp phân tích độ bội Flow cyometry để đo độ bội thể lai Từ 188 chồi tái sinh sau dung hợp có 82 có độ bội thể 2n=6x (chiếm tỷ lệ 43,6 %) Tỷ lệ lục bội (2n=6x) phụ thuộc vào tổ hợp dung hợp khác Trong tổ hợp dung hợp tổ hợp lai Delikat (+) trn3G cho tỷ lệ tái sinh có độ bội thể 6x cao tổ hợp lai Atlantic (+) trn 3G không cho kết tạo lai lục bội (bảng 4.8) Bảng 4.8 Kết tái sinh phân tích độ bội thể tổ hợp lai sau dung hợp STT Tên tổ hợp lai Số lƣợng Số lƣợng chồi Số dòng lục callus tái sinh tái sinh bội (2n= 6x) trn3G + Agave 120 39 15 trn3G + Rasant 97 25 12 blb2G +Delikat 250 31 15 trn3G + Delikat 250 64 28 pnt2G +Atlantic 193 23 blb2G + Atlantic 307 trn3G + Atlantic 395 1612 188 82 Tổng 16 4.1.3.2 Xác định lai soma thị phân tử Thí nghiệm 10: Xác định lai soma thị phân tử Trong số 188 lai tái sinh có 82 có độ bội 6x có 69 có kiểu gen dị hợp nhân Tùy thuộc vào tổ hợp lai khác nhau, tỷ lệ lai soma tổ hợp dung hợp khác (2/11 tổ hợp dung hợp lai soma có kiểu gen dị hợp nhân) Bảng 4.9 Kết chọn lọc lai soma phân tích độ bội thể thị phân tử SSR Số Tỷ lệ Số dòng Số dòng lai Tên mồi xác lai soma/ Tổ hợp lai lục bội soma xác định định dòng tái (2n= 6x) (Hetezygous) lai độ bội sinh (%) trn3G + Agave 39 15 15 38,5 STM2022 trn3G + Rasant 25 12 24,0 STM2022, STIIKA blb2G + Delikat 31 15 14 45,2 STM2022 trn3G + Delikat 64 28 28 43,7 STM2022 pnt2G +Atlantic 23 26,1 STM3023 blb2G + Atlantic 0,0 STM1106 trn3G + Atlantic 0 0,0 STM1104 Tống 1612 82 69 4.1.4 Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng lai soma lây nhiễm nhân tạo thị phân tử 4.1.4.1 Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai soma lây nhiễm nhân tạo thị phân tử a Thí nghiệm 11: Phân lập nấm Phytophthora infestans chuẩn bị dịch lây nhiễm Mẫu nấm mốc sương phân lập từ mẫu bệnh thu thập vùng trồng khoai tây Hà Nội Lạng Sơn Nguồn nấm nuôi lát củ, sau – ngày triệu chứng nấm xuất lát cắt củ Nguồn nấm bệnh phân lập từ vùng sinh thái khác thể tính độc giống khoai tây trồng Việt Nam, thể mức độ gây bệnh cao đối tượng khảo sát Sau xử lý số liệu thống kê nhận thấy sai khác tính độc chủng nấm phân lập Nguồn nấm bệnh hoàn toàn sử dụng cho thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo b Thí nghiệm 12: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai soma lây nhiễm nhân tạo đơn tách rời Kết đánh giá lây nhiễm nhân tạo cho thấy dòng khoai tây dại sử dụng để dung hợp S.bulbocastanum; S tarnii S pinnatisectum có đặc tính kháng tốt với bệnh mốc sương (điểm đánh giá kích thước vết hoại tử nằm 17 khoảng từ 1,0 – 1,8), giống khoai tây trồng Delikat, Agave, Atlantic, Quarta, Rasant có tính kháng bệnh mốc sương thấp (điểm đánh giá vết hoại tử nằm khoảng từ 3,6-4,6) Các tổ hợp lai soma S tarnii; S pinnatisectum với giống khoai tây trồng Delikat, Atlantic, Rasant Agave không làm thay đổi khả kháng bệnh mốc sương Chỉ có tổ hợp lai loài dại S bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat có tính kháng cao với bệnh mốc sương Điều chứng tỏ dòng dại S.bulbocastanum có khả chuyển đặc tính kháng bệnh mốc sương cho giống khoai tây trồng thông qua dung hợp c Thí nghiệm 13: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai soma lây nhiễm nhân tạo lát cắt củ Tất dòng giống có biểu kháng mốc sương củ với nguồn mốc sương phân lập Mức độ biểu tính kháng bệnh mốc sương củ lai soma tốt bật lai soma tổ hợp lai S bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat Một số lai soma tổ hợp lai dòng dại S tarnii với khoai tây trồng có biểu kháng cao với bệnh mốc sương củ Tổng hợp kết lây nhiễm nhân tạo đơn tách rời lát cắt củ cho thấy lai soma tổ hợp lai S.bulbocastanum Delikat có tính kháng bệnh mốc sương cao Các lai tiếp tục kiểm tra khả có mặt gen kháng bệnh mốc sương d Thí nghiệm 14: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai soma lây nhiễm nhân tạo đồng ruộng (Field test) Các vật liệu tiếp tục đánh giá khả kháng bệnh mốc sương đồng ruộng, sử dụng dung dịch lây nhiễm với nồng độ 20.000 bọc động bào tử/ml Thí nghiệm lây nhiễm tiến hành vào chiều tối mát, trì nhiệt độ khoảng 180C- 250C, ẩm độ khoảng 70-80% Triệu chứng bệnh bắt đầu xuất khoảng tuần sau lây nhiễm Tiến hành đo đếm tuần lần suốt trình diễn biến bệnh (7 lần) Kết tính theo số tích lũy bệnh theo thời gian (bảng 4.17) Hệ số kháng bệnh điều chỉnh theo độ thành thục (∆)rAUDPC > cho thấy giống mẫn cảm với bệnh, (∆)rAUDPC < nghĩa giống có khả kháng cao với bệnh giá trị tuyệt đối (∆)rAUDPC nhỏ khả kháng bệnh cao Giống khoai tây trồng Delikat mẫn cảm với bệnh lai soma dòng giống với dòng dại S bulbocastanum có khả kháng bệnh cao Thông qua đánh giá thành thục đồng ruộng cho thấy có tương quan tính kháng bệnh mốc sương với thành thục kiểu gen khác Các kiểu gen có tính kháng bệnh cao thường chín muộn ngược lại Con lai SH 2292/4 có độ chín muộn lai khác có độ chín trung bình Như có 18 tương quan chặt chẽ tính kháng bệnh mốc sương độ chín Điều nói nên diễn biến bệnh đồng ruộng phức tạp, chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố tự nhiên, nhiều gen kiểm soát cho tính kháng có ý nghĩa quan trọng (tính kháng số lượng- Quantatitive resistance) (bảng 4.10) Bảng 4.10 Kết đánh giá lai soma dòng bố mẹ khả kháng bệnh mốc sƣơng đồng ruộng đánh giá thành thục Cấp bệnh Hệ số kháng Sự thành Tình trạng trung bệnh điều thục Tình trạng cây/ cây/ bình chỉnh theo độ 1- Chín ký hiệu tổ hợp lai (leaflet thành thục sớm; 9-Chín assay) (ΔrAUDPC) muộn (1) (2) Cultivar Delikat 5,0 S 0,311 4,8 Wild species S bulbocastanum 1,0 R Blb + Delikat SH 2282/4 1,0 R -0,352 6,0 SH 2283/5 1,4 R -0,248 6,5 SH 2283/9 1,8 R -0,324 6,0 SH 2292/4 1,0 R -0,030 7,4 e Thí nghiệm 15: đánh giá có mặt gen kháng bệnh mốc sương thị phân tử Sử dụng mồi đặc hiệu để phát gen kháng mốc sương Rpi-blb1 (Wang et al., 2008) gen kháng Rpi-blb3 (Lokosou et al., 2009) Kết phát có mặt gen kháng vật liệu có nguồn gốc từ loài khoai tây dại Solanum bulbocastanum (gồm S bulbocastanum lai soma từ tổ hợp lai S bulbocastanum + Delikat) phù hợp với kết thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo 4.1.4.2 Đánh giá lai soma tính trạng nông sinh học Thí nghiệm 16: Đánh giá lai soma tính trạng nông sinh học Đa số lai tạo có hình thái tương tự với khoai tây trồng (tuberosum) trừ lai 245/6 tổ hợp lai cv Atlantic + pnt2G; 3/7 tổ hợp lai cv Rasant + trn 3G; 4/12; 7/7; 4/4 tổ hợp lai cv Agave + trn 3G có kiểu hình tương đối giống dạng dại (Wild type) Khả hoa lai soma khác Các lai có khả hoa cao 2044/1; 2281/10; 2295/1 2195/2 Đây lai có triển vọng cho chọn tạo giống lai có khả hoa tiếp tục lai trở với khoai tây trồng để chọn tạo giống khoai tây mang đặc tính mong muốn Các lai tổ hợp lai trn 3G + cv Rasant trn 3G + cv.Agave khả hoa Nhiều lai soma có số lượng củ trung bình khóm đạt từ 4-5 củ/khóm lai 248/1 tổ hợp Delikat; 838/11 851/2 tổ hợp lai trn3G +cv.Delikat; 2044/1 tổ hợp lai pnt2G + cv.Rasant; 2292/4 tổ hợp lai blb 2G + cv; 2196/4 tổ hợp lai pnt2G + cv.Delikat Đồng thời củ chúng có hình dạng củ đẹp, phù hợp với tiêu chuẩn ăn tươi chế biến 19 Qua trình đánh giá nhận thấy có đa dạng kiểu hình quần thể dòng lai soma tạo Những biến dị thể dòng lai soma tổ hợp lai Một số số lai soma có xuất biến dị thân, lá, hoa củ khác tổ hợp lai Các biến dị xuất đa dạng khác tổ hợp lai khác khác tổ hợp lai Do lai soma tạo thông qua phép lai xa loài khoai tây dại với khoai tây trồng (có genome khác nhau) mang nhiều tính trạng khác xa với khoai tây trồng Các biến dị tiếp tục chọn lọc thông qua hệ lai backcross với khoai tây trồng nhằm chọn lọc dòng vừa mang đặc tính khoai tây trồng lại vừa có khả kháng bệnh 4.1.5 Lai lại lai soma với giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc Thí nghiệm 17 Đánh giá chọn lọc từ quần thể lai lại thu khả kháng mốc sương đặc tính nông sinh học Kết đánh giá tính kháng bệnh trồng từ hạt lai BC1 Các lai tổ hợp lai blb2G (+) Delikat có khả kháng cao dòng khác Con lai 13.1322 đạt tỷ lệ 60%; Con lai 13.1303 đạt 53,8%; Con lai 13.1311 đạt 55,8% Các dòng lai BC1 sau lọc tính kháng bệnh giai đoạn trồng điều kiện chậu vại Kết phân tích độ bội lai BC1 Sử dụng máy flow cytometry để kiểm tra độ bội dòng lai BC1 triển vọng So sánh kết với mẫu chuẩn nhị bội (2n = 2x=24) để kết luận mức đa bội mẫu cần đánh giá Dựa vào bắt màu mẫu đỉnh đo OD thấy dòng lai BC1 có độ bội 2n=5x, giảm bội so với lai soma 2n=6x Vì theo lý thuyết, tiếp tục tiến hành lai lại dòng với giống khoai tây trồng với mục đích giảm bội Sao cho dòng lai BC có độ bội giống với khoai tây trồng 2n=4x Kết đánh giá đặc tính trồng trọt lai BC1 Kết đánh giá cho thấy hầu hết lai BC1 bảo toàn đặc tính hình thái dạng khoai tây trồng có sức sinh trưởng tương đối giống với khoai tây trồng Ngoài khả hoa lai bố mẹ chúng đánh giá khả hoa định cho việc tiếp tục lai trở lại với khoai tây trồng để chọn tạo giống khoai tây mang đặc tính mong muốn hay không Các lai có khả hoa 13.1302; 13.1303; 13.1304 dòng 13.1304 có khả hoa cao Các dòng lai tổ hợp lai có biểu tính đa dạng kiểu hình cách rõ rệt Trong quần thể lai đánh giá, đặc biệt lưu ý đến dòng tổ hợp lai Delikat + blb2G lai 20 trở lại với giống khoai tây trồng Delikat Các dòng lai BC1 1303.2; BC1 1303.11 BC1 1303.3 có kiểu hình tương đối giống với khoai tây trồng, khả sinh trưởng phát triển tốt biểu khả kháng bệnh mốc sương cao áp lực bệnh điều kiện tự nhiên Kết đánh giá tính trạng củ lai BC1 cho thấy nhiều lai có tiềm năng suất cao (trên 30 tấn/ha) lai 1303.2; 1303.4, 1303.6, 1303.11 1303.28 tổ hợp lai blb2G (+) Delikat x Delikat; lai 1305.5 tổ hợp lai pnt2G (+) Delikat x Delikat (bảng 4.22) Đồng thời qua đánh giá tính trạng phẩm chất củ cho thấy lai 1304.2, 1303.4, 1303.6 1303.11 có hình thái củ đẹp, mắt ngủ nông, chất lượng thử nếm ngon hàm lượng chất khô cao, phù hợp với tiêu chuẩn ăn tươi chế biến (bảng 14.23-A B) Đây nguồn vật liệu quan trọng cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương Việt Nam 4.2 THẢO LUẬN Các thí nghiệm mô tả nghiên cứu xác định thông số quy trình tách, dung hợp tế bào trần xung điện, nuôi cấy tái sinh tổ hợp lai dòng khoai tây dại giống khoai tây trồng Trên sở đó, đạt tỷ lệ cao lai tái sinh từ tổ hợp lai dung hợp Trong số 188 chồi tái sinh từ 1612 callus tổ hợp dung hợp, chọn lọc 82 lai lục bội (2n=6x=72), có 69 lai có kiểu gen dị hợp nhân (hetezygous) chọn lọc thị phân tử SSR Phân tích độ bội Flow cytometry chọn 82/188 (43%) lai có độ bội mong muốn (4x tbr + 2x pnt, blb, trn) Ngoài kết phân tích độ bội thể cho thấy phép dung hợp tế bào trần tạo tổ hợp lai có độ bội đa dạng Các lai có độ bội không mong muốn lai tứ bội (2x + 2x), lai đa bội (polyploidy) hay lai hỗn bội (multiploidy) kết nhiều lần dung hợp xung điện đột biến dòng tế bào soma Ramona Thiemei et al., (1997) tạo 239 callus tái sinh từ tổ hợp lai dòng khoai tây nhị bội (T17) với dòng dại S pinnatisectu (2n = 2x), số chọn lọc 47-89% lai có độ bội mong muốn, 7-16% lai hỗn bội Trong việc lai khác loài khoai tây dại khoai tây trồng khó thành công thông qua phép lai hữu tính, lai khác loài thông qua dung hợp tế bào trần trở thành công cụ hữu hiệu để chuyển đặc tính mong muốn từ loài khoai tây dại vào giống khoai tây trồng, chẳng hạn nghiên cứu tác giả Thieme et al (2008) tạo thành công lai soma loài dại S tarnii với giống khoai tây trồng Delikat Sau năm, Jansky and Hamernik (2009) dung hợp loài khoai tây dại Solanum cardiophilum với giống khoai tây trồng Đức Agave Delikat tạo tỷ lệ thành công lai soma khác loài 21 Ở Việt Nam, nghiên cứu dung hợp tế bào trần khoai tây thành công việc tạo lai soma dòng khoai tây nhị bội kháng virus loài (Nguyễn Thị Phương Thảo cs., 2009, 2011, 2012) Nghiên cứu tạo 69 lai khác loài loài khoai tây dại blb2G, pnt2G trn3G với giống khoai tây trồng Delikat, Rasant, Agave Atlantic Đáng ý lần tạo lai soma loài khoai tây dại S pinnatisectum với giống khoai tây trồng tứ bội Atlantic (một giống khoai tây chế biến nhạy cảm với bệnh mốc sương trồng phổ biến Việt Nam.) Thông qua kết đánh giá đặc tính hình thái, lai có khả sinh trưởng tốt mang nhiều đặc tính giống với khoai tây trồng, đồng thời có khả kháng bệnh chọn lọc tiếp tục lai lại với khoai tây trồng nhằm tổ hợp đặc tính quý từ khoai tây trồng vào lai Những biến dị hình thái lai soma tiếp tục chọn lọc, giữ lại biến dị có lợi, loại bỏ biến dị bất lợi cho chọn tạo giống Trong hầu hết lai soma có biểu tính kháng mức vừa thấp chút so với giống khoai tây trồng, hay nói cách khác khả kháng bệnh lai soma cải thiện rõ rệt Các lai soma loài khoai tây dại Mexico mang khả kháng bệnh mốc sương cao nguồn vật liệu quan trọng cho chương trình chọn tạo giống khoai tây Các công bố trước thành công việc tạo lai soma khoai tây trồng với loài dại S.pinnatisectum mang khả kháng cao với bệnh mốc sương (Orczyk et al., 2003) Con lai soma loài dại S.bulbocastanum với S.tuberosum thể lai BC biểu tính kháng cao lây nhiễm với chủng mốc sương đồng ruộng (Helgeson et al., 1998) Thieme et al (2008) số 31 lai soma tạo loài khoai tây dại Solanum tarnii giống khoai tây trồng Delikat có 24 lai biểu kháng bệnh mốc sương có lai có biểu tính kháng cao với bệnh (điểm đánh giá lây nhiễm nhân tạo 9), so với loài dại Solanum tarnii (điểm đánh giá 8,7) Kết lây nhiễm nhân tạo củ cho thấy lai soma điều biểu mức 3,7-6,1 điểm (kháng cao so với giống Delikat có mức điểm 3,2, loài dại Solanum tarnii có mức điểm 7,0) Nhóm tác giả sử dụng thang điểm 1-9 để đánh giá = Nhạy cảm; = kháng bệnh Trong nghiên cứu này, lai soma tổ hợp lai loài dại Solanum tarnii với giống Delikat (857/5, 851/2, 849/5, 849/4 838/11) biểu nhiễm bệnh với mức điểm đánh giá từ 4,0 -5 Điều lý giải chủng Phytophthora Việt Nam tạo khác biệt so với chủng Phytophthora Châu Âu Các thể lai tiếp tục backross nhiều hệ với khoai tây trồng nhằm chuyển tính kháng bệnh vào dòng vật liệu chọn tạo giống khoai tây 22 Chúng sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen kháng Rpi-blb1 Rpi-blb3 để kiểm tra có mặt gen kháng lai soma Kết phát gen kháng kể lai soma giống loài dại S bulbocastanum Điều thêm lần khẳng định chuyển đặc tính kháng bệnh mốc sương từ loài khoai tây dại S.bulbocastanum vào lai Trong thí nghiệm chúng tôi, dòng lai soma 6x kết phép dung hợp tế bào trần loài khoai tây dại (2x, EBN) với khoai tây trồng (4x, EBN), có giá trị nội nhũ EBN Backcorss lai lục bội với khoai tây trồng tứ bội cho lai BC hệ có độ bội 5x Tiếp tục tiến hành lai backcross lai qua nhiều hệ cho giống khoai tây trồng mang đặc tính mong muốn Kết có ý nghĩa lớn cho sản xuất khoai tây Việt Nam thực tế chưa tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương Các giống có chủ yếu thông qua đường nhập nội Các vật liệu kháng bệnh tạo đường dung hợp tế bào trần, giống chuyển gen nên dễ dàng sản xuất chấp nhận, đồng thời giảm thiểu việc dùng thuốc hóa học gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên thời gian nghiên cứu có hạn, tạo lai BC1 Việc tiếp tục lai trở lại vật liệu qua vài hệ để chọn lọc dòng vừa mang khả kháng bệnh loài khoai tây dại, vừa mang đặc tính nông sinh học quý khoai tây trồng cần thiết Việc nghiên cứu sâu sở lý thuyết biểu gen kháng bệnh lai cần phải tiếp tục lai soma tổ hợp lai từ loài khoai tây dại khác có biểu khả kháng bệnh khác Trong loài khoai tây dại sử dụng nghiên cứu có khả kháng bệnh mốc sương cao, lai soma loài S.bulbocastanum biểu tính kháng bệnh cao, đa số lai soma lại biểu tính kháng bệnh mốc sương mức vừa có cải thiện đôi chút so với giống khoai tây trồng Vấn đề cần phải tiếp tục nghiên cứu Ngoài việc nghiên cứu thêm chế thay đổi số lượng nhiễm sắc thể, EBN độ bội hệ lai BC cần thiết cho giai đoạn nghiên cứu PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Đã xác định thông số để xây dựng quy trình tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần dòng khoai tây dại nhị bội giống khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho dòng/giống, thời gian ủ thích hợp mẫu dung dịch enzyme 23 dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ, dung hợp tần số 800 kHz với lần xung mật độ tế bào thích hợp để xung điện từ 4x 10 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml, môi trường thích hợp để nuôi cấy tế bào trần sau dung hợp môi trường VKMII lỏng môi trường tái sinh tạo chồi từ callus tổ hợp lai môi trường RJM 2) Đã dung hợp thành công 07 tổ hợp dung hợp dòng khoai tây dại nhị bội (blb2G, pnt2G, trn3G) với giống khoai tây trồng tứ bội (Atlantic, Delikat, Rasant Agave); tái sinh 1612 callus 188 chồi từ tổ hợp lai 3) Đã xác định 82/102 dòng thể lục bội (6x) phân tích độ bội Flow cytometry có 69 dòng lai soma có kiểu gen dị hợp nhân phân tích thị SSR bao gồm: 15 lai soma tổ hợp lai trn3G + Delikat, lai soma tổ hợp lai trn3G+ Rasant, 14 lai soma tổ hợp lai blb2G+ Delikat, 28 lai soma tổ hợp lai trn3G+Delikat lai soma tổ hợp lai pnt2G+ Atlantic 4) Đã đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai soma lây nhiễm nhân tạo lá, củ đồng ruộng Kết chọn lọc lai soma tổ hợp lai dòng dại S.bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat có biểu kháng cao với bệnh mốc sương (SH 2283/5; SH 2281/10, SH 2292/4 SH 2295/1), đồng thời lai có mang gen kháng bệnh mốc sương Rpi-blb1 Rpi-blb3 5) Đã đánh giá đặc tính hình thái, sinh trưởng, phát triển yếu tố cấu thành suất lai soma Các lai thể đa dạng kiểu hình tổ hợp lai khác tổ hợp lai Nhiều lai tổ hợp blb2G (+) Delikat có kiểu hình tương đối giống với khoai tây trồng (Tuberosum), sinh trưởng tốt có khả chống chịu mốc sương cao 6) Đã lai tạo thành công 11 tổ hợp lai backcross lai soma với giống khoai tây trồng Kết đánh giá quần thể chọn lọc lựa chọn dòng lai tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6, 13.1303.11) có khả kháng mốc sương cao, đồng thời mang nhiều tính trạng nông sinh học tốt Đây nguồn vật liệu có giá trị cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương 5.2 KIẾN NGHỊ Các dòng khoai tây lai kháng bệnh mốc sương cần phải tiếp tục nghiên cứu về mức độ kiểu gen kiểu hình, đặc biệt ổn định tính kháng theo thời gian để sử dụng cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh nước ta 24 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Hoàng Thị Giang, Đỗ Thị Thu Hà, Vũ Thị Hằng, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Quang Thạch, Ramona Thieme Thilo Hammann (2013) Nghiên cứu tạo, đánh giá lai soma khác loài giống khoai tây trồng Solanum tuberosum L (2n=4x=48) dòng khoai tây dại Solanum bulbocastanum, Solanum tarnli, Solanum pinatisectum (2n=2x=24) mang khả kháng bệnh mốc sương dung hợp tế bào trần Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 22/2013, trang 3-10 Hoàng Thị Giang, Vũ Thị Hằng, Nguyễn Thị Thủy, Đỗ Thị Thu Hà, Ramona Thieme, Thilo Hammann Nguyễn Quang Thạch (2014) Đánh giá khả chuyển đặc tính kháng bệnh mốc sương từ khoai tây dại sang khoai tây trồng thông qua dung hợp tế bào trần Tạp chí Khoa học Phát triển tập 12, số 7/2014, trang 1149-1156 Hoàng Thị Giang, Nguyễn Thị Thủy, Vũ Thị Hằng, Đỗ Thị Thu Hà, Ramona Thieme, Thilo Hammann Nguyễn Quang Thạch (2014) Khả kháng bệnh mốc sương đặc tính nông học dòng lai lại lai soma khoai tây trồng Tạp chí Khoa học Phát triển tập 12, số 8-2014, trang 1302-1313