TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THIỆN NAM NGHIÊN CỨU SỰ ĐA KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2010 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THIỆN NAM NGHIÊN CỨU SỰ ĐA KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TỪ THANH DUNG 2010 LỜI CẢM TẠ Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc chân thành đến: Cô Từ Thanh Dung tận tình hướng dẫn tạo nhiều điều kiện thuận lợi suốt trình thực đề tài Thầy Cô anh chị môn Sinh học bệnh thủy sản, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ Chị Phạm Thanh Hương, Hồ Ngọc Thi, anh Trần Duy Phương nhiệt tình giúp đỡ để đề tài thực thuận lợi MỤC LỤC Danh sách bảng ii Danh sách hình iii Tóm tắt .iv Phần 1: Giới thiệu Phần 2: Lược khảo tài liệu 2.1 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri .3 2.1.1 Đặc tính vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.1.2 Khả gây bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.2 Thuốc kháng sinh nuôi trồng thủy sản 2.2.1 Những hiểu biết thuốc kháng sinh .5 2.2.2 Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh .6 Phần 3: Vật liệu phương pháp nghiên cứu 13 3.1 Vật liệu nghiên cứu 13 3.2 Phương pháp nghiên cứu 13 3.2.1 Phương pháp làm kháng sinh đồ 13 3.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 14 3.2.3 Phương pháp khảo sát khả tiếp hợp vi khuẩn 16 3.2.3 Phương pháp tính toán xử lý số liệu 16 Phần 4: Kết 17 4.1 Kết kháng sinh đồ .17 4.2 Kết MIC 17 4.3 Hiện tượng đa kháng .18 4.4 Kết khảo sát khả tiếp hợp vi khuẩn E ictaluri 19 Phần 5: Thảo luận 21 Phần 6: Kết luận đề xuất 24 Tài liệu tham khảo .25 Phụ lục .29 i DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Tỉ lệ phần trăm chủng vi khuẩn kháng, nhạy nhạy trung bình 17 Bảng 4.2: Giá trị MIC 40 chủng vi khuẩn E ictaluri 18 Bảng 4.3: Một số kiểu hình đa kháng chủng vi khuẩn E ictaluri 19 Bảng 4.4: Tần số tiếp hợp chủng E ictaluri với E coli RC85 .20 ii DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1: Kết MIC oxytetracycline chủng E ictaluri 18 Hình 4.2: Tỉ lệ phần trăm số chủng vi khuẩn đa kháng kháng sinh .19 Hình 4.3: Vi khuẩn E coli RC85 sau tiếp hợp 20 iii TÓM TẮT Sự kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản vấn đề đáng lo ngại, có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng Mục tiêu đề tài nhằm đánh giá khả kháng thuốc khả chuyển gen kháng kháng sinh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Nghiên cứu thực 40 chủng vi khuẩn E ictaluri phân lập từ cá tra bệnh gan thận mủ Đồng sông Cửu Long (2008 – 2009) Kiểm tra kháng sinh đồ với 11 loại kháng sinh xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) vi khuẩn với loại kháng sinh thực phương pháp pha loãng môi trường lỏng Kết kháng sinh đồ cho thấy: đa số chủng E ictaluri nhạy với ampicillin (82,5%), ciprofloxacin (72,5%) hầu hết kháng với nhiều loại kháng sinh như: streptomycin, chloramphenicol (95%), florfenicol, enrofloxacin (77,5%), doxycycline (67,5%) Qua xác định giá trị MIC50%, chủng vi khuẩn kháng thuốc nồng độ cao: chloramphenicol (64 µg/ml), enrofloxacin (16 µg/ml), oxytetracycline (32 µg/ml) streptomycin (128 µg/ml) Đặc biệt, nghiên cứu xác định 97,5% chủng vi khuẩn biểu đa kháng thuốc (kháng loại thuốc kháng sinh), đồng thời tiến hành tiếp hợp chủng vi khuẩn E ictaluri E coli RC85 với tần suất chuyển gen kháng kháng sinh tetracycline 1,48x10 -3 Kết nghiên cứu cho thấy kháng kháng sinh vi khuẩn E ictaluri cao, việc áp dụng biện pháp phòng bệnh tích cực ao nuôi như: cải thiện môi trường ao nuôi, nâng cao sức đề kháng sử dụng vaccine,… cần thiết iv Phần GIỚI THIỆU Những năm vừa qua, nghề nuôi thủy sản Việt Nam có bước phát triển đáng kể Đồng sông Cửu Long vùng sản xuất thủy sản Việt Nam, cung cấp 80% tổng sản phẩm thủy sản nước cá tra trở thành đối tượng nuôi phổ biến, đem lại lợi nhuận cao Tính tháng 8/2009, sản phẩm xuất cá tra basa vào thị trường EU tăng 2,42% giá trị 8,75% lượng Tính chung tháng đầu năm 2009 sản lượng nuôi trồng đạt 1401,9 nghìn tấn, tăng 1,6% (www.gso.gov.vn) Tuy năm 2009, nghề nuôi cá tra gặp nhiều khó khăn nhìn chung cá tra đối tượng nuôi quan trọng đem lại giá trị kinh tế cao Trong nhiều năm qua, với hình thức nuôi công nghiệp mật độ cao, người nuôi cá tra bị thiệt hại lớn nhiều dịch bệnh nguy hiểm phát sinh như: gan thận mủ, trắng gan trắng mang, phù đầu,…(Từ Thanh Dung ctv, 2004) Trong số bệnh bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây phổ biến gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi Theo Crumlish et al (2006), tỉnh An Giang có đến 55% số hộ nuôi có cá tra bị nhiễm bệnh gan thận mủ với tỉ lệ hao hụt lên tới 60% (trích dẫn Tiết Ngọc Trân, 2007) Theo điều tra Châu Hồng Thúy (2008), Trà Vinh có đến 96% ao nuôi cá tra thâm canh bị bệnh gan thận mủ Bệnh nghiêm trọng phát ngày nhiều toàn trình nuôi diện tất lứa tuổi cá Chúng làm gia tăng tỉ lệ hao hụt cá chi phí cho việc điều trị Cho đến nay, kháng sinh biện pháp chữa trị hiệu cho bệnh vi khuẩn Nhiều loại kháng sinh sử dụng cách rộng rãi, phổ biến nuôi thủy sản Việt Nam Trong đa số trường hợp, lượng thuốc kháng sinh sử dụng ước lượng, không liều thời gian dài Và dùng kháng sinh thời gian dài, với liều thấp làm phát sinh tượng kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh, làm cho công tác trị bệnh trở nên khó khăn, tốn Sự kháng thuốc kháng sinh gián tiếp vi sinh vật hình thành thông qua gen nhiễm sắc thể thông qua plasmid (Prescott et al., 2000) Theo Bùi Kim Tùng (2004), kháng thuốc plasmid lan tràn nhanh (do tiếp hợp qua trung gian thực khuẩn thể) Sự đề kháng plasmid tạo chủng kháng với nhiều loại kháng sinh Và loại chiếm đa số khuẩn kháng thuốc (90%) Qua kết nghiên cứu Từ Thanh Dung (2008) cho thấy có đến 73% số chủng vi khuẩn E ictaluri có biểu đa kháng thuốc (kháng loại kháng sinh) Nghiên cứu Samira Sarter et al (2006), cho thấy có đến 73 chủng vi khuẩn (trong 92 chủng) phân lập từ cá tra khỏe môi trường có tượng đa kháng thuốc Theo Prescott et al (2000), gen kháng thuốc từ vi khuẩn có liên quan đến động vật nuôi truyền sang vi khuẩn có liên quan đến người qua chuỗi thức ăn qua tiếp xúc trực tiếp tác động đến khả kháng thuốc chủng vi khuẩn người Điều mối đe dọa lớn việc bảo vệ sức khỏe người tương lai Chính việc nghiên cứu kháng thuốc vi khuẩn cần thiết, đặc biệt đa kháng thuốc plasmid gây kháng thuốc Qua đây, nhằm cung cấp thông tin cho việc sử dụng kháng sinh có hiệu góp phần bảo vệ an toàn sức khỏe cho người Từ đề tài: “Nghiên cứu đa kháng thuốc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” thực Mục tiêu đề tài: • Đánh giá kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn E ictaluri gây bệnh, tìm hiểu khả đường truyền gen kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Nội dung đề tài: • Làm kháng sinh đồ xác định mức độ kháng thuốc 40 chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri với 11 loại thuốc kháng sinh • Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) loại thuốc kháng sinh dùng phổ biến lên vi khuẩn • Thực tiếp hợp vi khuẩn để xác định tần suất truyền gen kháng thuốc vi khuẩn E ictaluri kháng thuốc cho vi khuẩn E coli Phần LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.1.1 Đặc tính vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Theo Inglis et al (1993), giống vi khuẩn Edwardsiella ghi nhận vào năm 1962 Sanazaki mô tả Ewing et al (1965) Giống có loài gây bệnh cá là: Edwardsiella tarda Edwardsiella ictaluri Loài E ictaluri mô tả Hawke (1979) Loài vi khuẩn biết đến nguyên nhân gây bệnh nhiễm trùng máu (ESC) cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), tỉ lệ hao hụt khoảng 10% – 50% Đến năm 2001 2004 tác giả Ferguson Từ Thanh Dung nghiên cứu kết luận loài vi khuẩn nguyên nhân gây bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi Việt Nam Theo Inglis et al (1993), loài E ictaluri vi khuẩn Gram âm, hình que, di động yếu 25oC – 30oC, phát triển chậm, 36 – 48 môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) 28oC – 30oC, tạo thành khuẩn lạc nhỏ phát triển không phát triển 37 oC Không diện độ mặn lớn 1,5% Theo Shotts Waltman (1990) môi trường chọn lọc thích hợp cho vi khuẩn E ictaluri E ictaluri medium (EIM) thích hợp cho việc chọn lọc vi khuẩn EIM ức chế phát triển đa số vi khuẩn Gram âm, Gram dương nấm Trên môi trường EIM, E ictaluri cho khuẩn lạc màu xanh mờ, kích thước 0.5 – mm sau 48 30oC Tại Việt Nam, vi khuẩn E ictaluri phân lập từ cá tra Gram âm, hình que kích thước biến đổi So với E tarda phát triển tốt 37oC vi khuẩn E ictaluri phát triển tốt 28oC phát triển yếu 37 oC, chúng tạo thành khuẩn lạc nhỏ, có màu trắng đục, không nhân, rìa không đồng (Từ Thanh Dung ctv, 2004) Sau xác định mật số vi khuẩn tiến hành cho dung dịch vi khuẩn lên môi trường thạch Dùng tâm tiệt trùng nhúng vào dung dịch vi khuẩn, quét lên mặt môi trường thạch MHA Sau dùng pel tiệt trùng lấy đĩa thuốc kháng sinh đặt vào đĩa petri sau cho khoảng cách tâm đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm khoảng cách tâm đĩa kháng sinh với rìa đĩa petri là: 10-15 mm Mỗi đĩa petri (Ø: 100 mm) môi trường đặt tối đa đĩa kháng sinh Sau hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh, đặt đĩa petri vào tủ ấm điều kiện 28oC – 30oC Sau 24 tiến hành đọc kết Đọc kết Đo đường kính vòng vô trùng (mm) dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng theo tiêu chuẩn Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006 dùng chủng chuẩn E coli ATCC 25922 làm đối chứng, để xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình nhạy kháng 3.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration – MIC) Thí nghiệm thực 40 chủng vi khuẩn E ictaluri làm kháng sinh đồ để xác định giá trị MIC loại thuốc kháng sinh Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) vi khuẩn dựa phương pháp Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006  Các bước tiến hành:  Chuẩn bị môi trường-hóa chất Vi khuẩn lấy từ tủ đông -80 oC sau rã đông cấy lên môi trường TSA, ủ tủ ấm 28oC sau 48 Riêng với vi khuẩn đối chứng E coli ATCC 25922 ủ 37oC Kiểm tra ghi nhận đặc điểm hình thái vi khuẩn, hình dạng, kích thước màu sắc khuẩn lạc nhuộm Gram để xác định tính Nếu vi khuẩn chưa tiếp tục tách ròng đạt đĩa cấy Khi vi khuẩn thuần, lấy khuẩn lạc đĩa TSA cho vào ống nghiệm chứa ml BHB, ủ 28oC, 18-20  Chuẩn bị dung dịch thuốc Chuẩn bị dung dịch thuốc gốc: Chuẩn bị chai (50 ml) dung dịch thuốc gốc có nồng độ 1024 256 µg/ml dung môi thích hợp 14 Pha loãng lần nồng độ: 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024 µg/ml Pha loãng nước cất tiệt trùng Chú ý: Ống nghiệm có nồng độ thuốc 512 256 µg/ml pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 1024 µg/ml Những ống nghiệm thuốc lại 128; 64; 32;….0,25 µg/ml pha loãng từ dung dịch thuốc gốc 256 µg/ml Cần lắc dung dịch thuốc trước pha loãng dung dịch thuốc Nồng độ thuốc giảm nửa cho dung dịch vi khuẩn vào Ghi tên thuốc nồng độ trước bắt đầu thí nghiệm  Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn Xác định mật số vi khuẩn máy so màu quang phổ bước sóng 625 nm điều chỉnh mật độ vi khuẩn môi trường BHB Brain heart broth (BHB, Merck, Darmstadt, Germany) (không dùng nước cất) điểm OD = 0,08–0,13±0,02 (mật số vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml), sau pha loãng 105 CFU/ml , chủng vi khuẩn cấy môi trường TSA để kiểm tra chủng ủ điều kiện với ống MIC Cho ml dung dịch vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa ml dung dịch thuốc nồng độ khác nhau: 0,25; 0,5,…,1024 µg/ml (cần lắc đều) Thí nghiệm có đối chứng: + Đối chứng âm: ml BHB + ml nước muối sinh lý + Đối chứng dương: ml dung dịch vi khuẩn + ml nước muối sinh lý Tất ống nghiệm ủ 28oC, 20-24 Riêng với vi khuẩn đối chứng E coli ATCC 25922 ủ 37oC  Đọc kết Kiểm tra chủng vi khuẩn, có tạp khuẩn loại bỏ kết loạt ống nghiệm chủng vi khuẩn phát triển không liên tục làm lại thí nghiệm Đọc kết cách so sánh độ đục ống MIC với ống đối chứng âm dương Giá trị MIC xác định nồng độ thấp thuốc kháng sinh mà vi khuẩn phát triển 15 3.2.3 Phương pháp khảo sát khả tiếp hợp vi khuẩn Khảo sát khả tiếp hợp vi khuẩn thực theo phương pháp Sorum et al (2003) Khuẩn lạc dòng vi khuẩn mang gen kháng thuốc kháng sinh (vi khuẩn cho plasmid) trộn với dòng vi khuẩn E coli RC85 (vi khuẩn nhận plasmid) nhạy với loại thuốc kháng sinh mà dòng vi khuẩn cho mang plasmid kháng Trộn hai loại vi khuẩn cho nhận plasmid với thể tích gần môi trường LB ủ nhiệt độ phòng thời gian đến ngày Sau cho hỗn hợp vi khuẩn lên đĩa MHA ủ qua đêm nhiệt độ 37 C thích hợp cho phát triển vi khuẩn E coli RC85 mà nhiệt độ vi khuẩn E ictaluri không phát triển, thu dòng vi khuẩn E coli phát triển môi trường MHA o Kiểm tra khả nhận plasmid kháng thuốc E coli từ dòng vi khuẩn cho plasmid, cách cho chúng phát triển đĩa MHA có pha thuốc kháng sinh tetracycline (16 µg/ml) với nồng độ mà trước chúng nhạy ủ nhiệt độ Vi khuẩn sau thí nghiệm nhuộm gram để kiểm tra tính nhiễm tạp trình tiến hành thí nghiệm Tần số chuyển gen kháng thuốc đánh giá dựa mật độ vi khuẩn E ictaluri (cho plasmid) mật độ vi khuẩn E coli sau tiếp hợp (thu đĩa MHA có kháng sinh) Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn: Xác định mật độ vi khuẩn dựa vào số khuẩn lạc đếm đĩa agar qua công thức: Mật độ vi khuẩn (CFU/ml) = Số khuẩn lạc x Độ pha loãng x 10 (nhỏ giọt 100 µl) = Số khuẩn lạc x Độ pha loãng x 50 (nhỏ giọt 20 µl) 3.2.5 Phương pháp tính toán xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Excel 16 Phần KẾT QUẢ 4.1 Kết kháng sinh đồ Kết kháng sinh đồ cho thấy chủng vi khuẩn nhạy với ampicillin (82,5%) ciprofloxacin (72,5%) Đa số chủng E ictaluri kháng với: norfloxacin (40%), tetracycline (60%), doxycycline (67,5%), enrofloxacin, florfenicol (77,5%) kháng cao với chloramphenicol, streptomycin (95%), flumequine (87,5%) trimethoprim+sulfamethoxazol (80%) Độ nhạy chủng vi khuẩn E ictaluri với loại kháng sinh trình bày chi tiết Bảng 4.1 Bảng 4.1: Tỉ lệ phần trăm chủng vi khuẩn kháng, nhạy nhạy trung bình STT Kháng sinh 10 11 Ampicillin Streptomycin Chloramphenicol Florfenicol Tetracycline Doxycycline Ciprofloxacin Enrofloxacin Norfloxacin Flumequine Trimethoprime+sulfamethoxazol Số chủng kháng 38 38 31 24 27 31 16 35 32 Kháng (%) 10 95 95 77,5 60 67,5 15 77,5 40 87,5 80 Nhạy (%) 82,5 5 22,5 27,5 72,5 37,5 10 15 Nhạy TB (%) 17,5 0 17,5 17,5 12,5 22,5 22,5 2,5 4.2 Kết MIC Nồng độ ức chế tối thiểu loại kháng sinh: ampicillin, chloramphenicol, enrofloxacin, oxytetracycline, streptomycin 40 chủng vi khuẩn trình bày Bảng 4.2 Tương tự kết kháng sinh đồ, chủng thể tính nhạy với ampicillin (25% chủng kháng) với mức MIC 50% MIC 90% thấp (16 32 µg/ml), đối loại kháng sinh lại chủng thể tính kháng cao Đặc biệt streptomycin mức độ kháng cao, với giá trị MIC 50% MIC 90% 128 µg/ml 256 µg/ml 17 Bảng 4.2: Giá trị MIC 40 chủng vi khuẩn E ictaluri Giá trị MIC số chủng vi khuẩn 0,5 32 128 Ampicillin 0 Chloramphenicol 1 1 16 Enrofloxacin 0 Oxytetracycline 1 Streptomycin 0 0 0 19 Kháng sinh 256 Số chủng MIC MIC % kháng kháng 50% 90% 10 25 16 32 13 10 15 36 36 29 34 90 90 72,5 85 64 16 32 128 256 128 256 256 (theo tiêu chuẩn CLSI (2006) chủng in đậm thể tính kháng đáp ứng) Hình 4.1: Kết MIC oxytetracycline chủng E ictaluri (giá trị MIC 32 µg/ml) 4.3 Hiện tượng đa kháng Điểm bật nghiên cứu tìm thấy có đến 97,5% số chủng vi khuẩn E ictaluri thể tính đa kháng thuốc kháng sinh (kháng loại kháng sinh) Đặc biệt, vi khuẩn kháng với – 10 loại kháng sinh chiếm tỉ lệ cao, 25% số chủng kháng với loại thuốc kháng sinh, 20% số chủng kháng với loại kháng sinh có 10% số chủng kháng với 10 loại kháng sinh 18 Hình 4.2: Tỉ lệ phần trăm số chủng vi khuẩn đa kháng kháng sinh Bảng 4.3: Một số kiểu hình đa kháng chủng vi khuẩn E ictaluri Kiểu hình đa kháng SM-FFC-CHL SM-FFC-SXT-CHL SM-FM-DO-SXT-ENR SM-TE-FFC-DO-CHL-ENR SM-FM-FFC-DO-SXT-CHL-ENR NOR-SM-TE-FM-FFC-DO-SXT-CHL SM-TE-FM-FFC-DO-SXT-CHL-ENR NOR-SM-TE-FM-FFC-DO-SXT-CHL-ENR NOR-SM-TE-AM-FM-FFC-DO-SXT-CHL-ENR NOR-SM-TE-FM-FFC-DO-SXT-CHL-ENR-CIP Số chủng vi khuẩn 1 3 2 4.4 Kết khảo sát khả tiếp hợp vi khuẩn E ictaluri Thí nghiệm thực chủng E ictaluri, chủng kháng cao với kháng sinh tetracycline Kết cho thấy, 100% chủng vi khuẩn thực tiếp hợp, truyền gen kháng tetracycline cho vi khuẩn E coli RC85 với tần số tiếp hợp trung bình là: 1,48x10-3 Tần số tiếp hợp chủng trình bày Bảng 4.4 19 Bảng 4.4: Tần số tiếp hợp chủng E ictaluri với E coli RC85 Chủng vi khuẩn Địa điểm thu mẫu E56 An Giang E64 An Giang E77 Cần Thơ E87 Cần Thơ E1.12 Cần Thơ E2.1 Cần Thơ E3.18 Đồng Tháp Tấn số tiếp hợp trung bình 20 Tần số tiếp hợp 5,17x10-5 2,06x10-4 1,68x10-4 8,40x10-4 5,05x10-3 3,89x10-3 1,77x10-4 1,48x10-3 Phần THẢO LUẬN Các kết kháng sinh đồ giá trị MIC chủng chuẩn E coli ATCC 25922 khác biệt so với kết ghi nhận tài liệu CLSI (2006) Qua đó, khẳng định xác kết kháng sinh đồ giá trị MIC 40 chủng E ictaluri Chloramphenicol loại kháng sinh quan trọng y học (Heuer et al., 2009), nhiên chúng có tác dụng phụ không mong muốn như: rối loạn tiêu hóa, ảnh hưởng đến hệ tuần hoàn, … (Bùi Kim Tùng, 2001) Vì chloramphenicol bị cấm sử dụng nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, nghiên cứu chủng E ictaluri kháng cao, giá trị MIC 90% 256 µg/ml, chứng tỏ việc sử dụng loại kháng sinh diễn Không lâu sau đó, dẫn xuất khác chloramphenicol florfenicol sản xuất cho phép sử dụng Kháng sinh nhanh chóng sử dụng rộng khắp nhiều nước giới Florfenicol tỏ nhạy với chủng vi khuẩn Loại kháng sinh nhanh chóng ứng dụng rộng rãi điều trị bệnh gan thận mủ cá tra (Trần Duy Phương, 2009) Một vài nghiên cứu trước không tìm thấy kháng E ictaluri với florfenicol, giá trị MIC 90% thấp (0,25 µg/ml) (Dung et al., 2008) Tuy nhiên, nghiên cứu tìm thấy có đến 77,5% chủng E ictaluri kháng với florfenicol Vì cần thận trọng sử dụng loại kháng sinh Ngoài nghiên cứu tìm thấy có đến 95% số chủng vi khuẩn kháng với streptomycin, với giá trị MIC cao (MIC 90% 256 µg/ml) Trong đó, vài nghiên cứu trước cho thấy E ictaluri nhạy với streptomycin (giá trị MIC < µg/ml) (Stock and Wiedemann, 2001); nhiên đến năm 2008, tác giả Từ Thanh Dung tìm thấy có đến 83% chủng vi khuẩn kháng với loại kháng sinh Streptomycin không hấp thụ qua ruột không sử dụng nhiều thủy sản, nhiên streptomycin sử dụng rộng rãi y học thú y Đây loại thuốc xuất qua thận với 50% hoạt tính Điều giả thích chủng E ictaluri lại kháng cao với kháng sinh Đối với tetracycline kháng sinh sử dụng từ lâu nuôi trồng thủy sản doxycycline kháng sinh hệ nhóm tetracyclines, chủng E ictaluri kháng cao (> 60% số chủng vi khuẩn), bên cạnh giá trị MIC 90% oxytetracycline cao (256 µg/ml) Nhóm thuốc tạo chủng kháng chậm sử dụng với thời 21 gian dài với nồng độ thấp dễ tạo chủng kháng thuốc thông qua thể R – plasmid Đã có nhiều nghiên cứu tìm thấy plasmid kháng tetracycline vi khuẩn (Schmidt et al., 2001; Furushita et al., 2003) Gần nhất, plasmid kháng tetracycline vi khuẩn E ictaluri phân lập, với kích thước lên đến 140 kbp plasmid không tương hợp (Inc-K plasmid) (Dung et al., 2009) Điều chứng tỏ, tính kháng tetracycline chủng E ictaluri không bền vững, thay đổi theo thời gian điều kiện môi trường Điều đặc biệt nhóm kháng sinh có tượng lờn thuốc chéo, vi khuẩn kháng với tetracycline kháng với loại tetracycline khác chúng có nhân hóa học Chính điều góp phần giúp khả kháng thuốc vi khuẩn lan tràn nhanh với nhiều loại kháng sinh, gây tượng đa kháng kháng sinh Đối với nhóm fluoroquinolones, kết thí nghiệm cho thấy, đa số chủng E ictaluri kháng với enrofloxacin (77,5%) với giá trị MIC cao (MIC 90% 128 µg/ml) so với vài kết nghiên cứu trước với MIC 90% µg/ml (Dung et al., 2008) Tuy nhiên, ciprofloxacin norfloxacin lại nhạy với 72,5% 37,5% chủng E ictaluri Một khảo sát trước cho thấy chủng E ictaluri nhạy cao với ciprofloxacin norfloxacin nhiên nghiên cứu norfloxacin giảm tính nhạy với 40% số chủng kháng Cần lưu ý rằng, ciprofloxacin norfloxacin thuốc kháng sinh bị cấm sử dụng nuôi trồng thủy sản Đây kháng sinh quan trọng y học Vì tuyệt đối không sử dụng loại thuốc để điều trị nhằm đảm bảo an toàn sức khỏe cho người Ngoài ra, ampicillin nhạy với chủng E ictaluri, với số chủng nhạy 82,5% Giá trị MIC 90% ampicillin tương đối thấp (32 µg/ml) Một vài khảo sát trước cho thấy chủng E ictaluri nhạy cao với ampicillin nhiên với giá trị MIC thấp (< 0,5 µg/ml) (Stock and Wiedemann, 2001) Điểm bật nghiên cứu phát có đến 97,5% số chủng E ictaluri biểu đa kháng thuốc (kháng loại kháng sinh trở lên) Kiểu hình đa kháng biến đổi đa dạng từ – 10 loại kháng sinh, kiểu hình kháng với loại kháng sinh chiếm tỉ lệ cao (25%) đến kiểu hình loại kháng sinh với 20% số chủng Hiện tượng đa kháng nhiều nghiên cứu ghi nhận (Prescott et al., 2000; Miranda and Zemelman, 2002; Alcaide et al., 2004; Dung et al., 2008, 2009) Năm 2005, Akinbowale 22 ghi nhận có 74,4% chủng vi khuẩn gây bệnh thủy sản Úc biểu đa kháng Tuy nhiên vi khuẩn cá tra môi trường nước ao nuôi Việt Nam có đến 78% số chủng thể đa kháng với – loại kháng sinh (Sarter et al., 2006) Riêng vi khuẩn E ictaluri, gần ghi nhận có đến 86% chủng vi khuẩn đa kháng với – loại kháng sinh (Từ Thanh Dung ctv, 2009) Từ kết trên, khẳng định rằng, tượng kháng thuốc vi khuẩn ngày diễn biến phức tạp hơn, đa kháng ngày tăng số chủng số lượng kháng sinh Nghiêm trọng hơn, chủng đa kháng hình thành thông qua thể R – plasmid Các thể R – plasmid mã hóa kháng hay nhiều loại kháng sinh truyền sang vi khuẩn khác nhờ vào tiếp hợp vi khuẩn (Prescott et al., 2000; Nguyễn Lân Dũng, 2007) Nhiều công trình nghiên cứu phát thể R – plasmid Vibrio, Pseudomonas (Furushita et al., 2003); Aeromonas hydrophila Edwardsiella tard (Akinbowale et al., 2005); E ictaluri (Dung et al., 2009) Nghiên cứu thực thí nghiệm khảo sát khả tiếp hợp truyền gen kháng kháng sinh chủng E ictaluri cho vi khuẩn chuẩn E coli RC85, với tần suất chuyển trung bình 1,48x10 -3 Một số nghiên cứu trước ghi nhận tần số tiếp hợp khoảng 3x10-6 - 8x10-3 Aeromonas salmonicica với Vibrio cholerae E coli J5 nhiều dạng môi trường khác (Kruse and Sorum, 1994) Tuy nhiên, đến năm 2003, khả tiếp hợp chuyển plasmid kháng tetracycline vi khuẩn A salmonicica gây bệnh cá với vi khuẩn E coli cao 6,5x10-3 (Sorum et al., 2003) Tuy nhiên, chủng E ictaluri Việt Nam tần số tiếp hợp thấp, trung bình khoảng 2,54x10-6 (Dung et al., 2009) Đối với nhóm vi khuẩn Gram âm, tiếp hợp xảy với khả cao môi trường lỏng (Andrup and Andersen, 1999) Vì thế, đối vi khuẩn E ictaluri xuất phổ biến môi trường ao nuôi kháng thuốc khả truyền gen kháng thuốc chúng vấn đề đáng lo ngại gen kháng thuốc truyền cho chủng vi khuẩn gây bệnh người động vật, đe dọa đến sức khỏe cộng đồng Do việc đưa biện pháp nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh cần thiết Để thực điều đó, đòi hỏi người nuôi thủy sản phải có hiểu biết định nhà khoa học cần có nghiên cứu sâu để xác định chất chế kháng thuốc, từ đưa giải pháp sử dụng kháng sinh có hiệu quả, hạn chế tình trạng kháng kháng sinh, nhằm hướng đến thủy sản phát triển bền vững 23 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 6.1 Kết luận Kết kháng sinh đồ cho thấy ampicillin ciprofloxacin nhạy với chủng E ictaluri, với số chủng nhạy chiếm 82,5% 72,5% Giá trị MIC 90% ampicillin tương đối thấp (32 µg/ml) Đa số chủng E ictaluri kháng với: norfloxacin (40%), tetracycline (60%), doxycycline (67,5%), enrofloxacin, florfenicol (77,5%) kháng cao với chloramphenicol, streptomycin (95%) Giá trị MIC 90% chloramphenicol streptomycin cao (256 µg/ml) Đặc biệt, nghiên cứu phát có đến 97,5% chủng vi khuẩn E ictaluri có biểu đa kháng thuốc kháng sinh Ngoài ra, qua thí nghiệm khảo sát khả tiếp hợp truyền gen kháng kháng sinh chủng E ictaluri cho vi khuẩn chuẩn E coli RC85 cho thấy tần suất chuyển trung bình 1,48x10 -3 6.2 Đề xuất Đối với ciprofloxacin nhạy với chủng E ictaluri loại thuốc bị cấm sử dụng thị trường châu Âu Bắc Mỹ Đặc biệt nhóm kháng sinh fluoroquinolones, nhóm kháng sinh ứng dụng quan trọng y học việc lạm dụng kháng sinh tạo chủng vi khuẩn kháng thuốc vĩnh viễn Vì tuyệt đối không sử dụng loại kháng sinh loại kháng sinh bị cấm khác nuôi trồng thủy sản Cần có nghiên cứu sâu chế kháng kháng sinh vi khuẩn để từ có biện pháp hạn chế quản lí tốt 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO Akinbowale, L.O., H Peng and D.M Barton, 2006 Antimicrobial resistance in bacteria isolated from aquaculture sources in Australia Journal of Applied Microbiology p.1364 – 5072 Alcaide, E., M.D Blasco and C Esteve, 2004 Occurrence of drugresistant bacteria in two European eel farms Applied and environmental microbiology 71: 3348-3350 Andrup, L and K Andersen, 1999 A comparison of the kinetics of plasmid transfer in the conjugation systems encoded by the F plasmid from Escherichia coli and plasmid pCF10 f rom Enterococcus faecalk Microbiology.145: 2001-2009 Bùi Kim Tùng, Bùi Kim Hoàng Bùi Kim Tân, 2001 Thuốc kháng sinh Sở khoa học công nghệ môi trường tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu 255 trang Châu Hồng Thuý, 2008 Khảo sát tình hình xuất bệnh mủ gan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra nuôi thâm canh tỉnh Trà Vinh Luận văn cao học Khoa thuỷ sản Trường Đại Học Cần Thơ 75 trang Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006 Methods for broth dilution susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals; informational supplement, M49-A, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne Crumlish, M., T.T Dung, J.F Turnbull, N.T.N Ngọc and H.W Ferguson, 2002 Indentification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), culture in the Mekong Delta, Viet Nam Journal of fish disease 25: 733-736 Đặng Thị Hoàng Oanh, 2005 Xác định tính kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ hệ thống nuôi thủy sản Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam Tạp chí Nghiên Cứu Khoa Học Đang Thi Hoang Oanh Indentification and characterization of vibrio bacteria isolated from fish and shellfish in Vietnam University of Aarhus, Denmark 29 pp 10 Đỗ Tiến Hảo, 2009 Tình hình xuất bệnh mủ gan cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thân canh môt số tỉnh Đồng sông Cửu Long Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Thủy sản, trường đại học Cần Thơ 34 trang 25 11 Dung, T.T., F Haesebrrouck, N.A Tuan, P Sorgeloos, M Baele and A Decostere, 2008 Antimicrobial Susceptibility Pattenrn of Edwardsiella ictaluri Isolates from natural Outbreaks of Bacillary Necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Vietnam Microbial Drug Resistance 14: 311-316 12 Dung, T.T., F Haesebrouck, P Sorgeloos, N.A Tuan, M Baelem, A Smet and A Decostere, 2009 IncK plasmid-mediated tetracycline resistance in Edwardsiella ictaluri isolates from diseased freshwater catfish in Vietnam Aquaculture 295: 157-159 13 Frerichs, G.N and S.D Millar 1993 Mannual for the isolate and indentification of fish bacterial pathogens Institute of Aquaculture, University of Stirling, Scotland 107pp 14 Fugerson, H.W., J F Turnbull, A Shinn, K Thompson, T.T Dung and M Crumlish, 2001 Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthamus (Sauvage) from the Mekong Delta, VietNam Journal of Fish Disease 24: 509-513 15 Furushita, M., T Shiba, T Maeda, M Yahata, A Kaneoka, Y Takahashi, K Torri, T Hasegawa and M Ohta, 2003 Similarity or tetracycline resistance genes isolated from fish farm bacteria to those from clinical isolates Applied and Environmental Microbiology 69: 5336-5342 16 Hawke, J.P., 1979 A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish, Ictalurus punctatus Journal of the Fisheries Research Board of Canada 36:1508–1512 17 Heuer, O.E., H Kruse, K Grave, P Collignon, I Karunasagar, and F.J Angulo, 2009 Human Health Consequences of Use of Antimicrobial Agents in Aquaculture Clinical Infectious Diseases 49:1248–1253 18 Hồ Thị Kiều Nga, 2009 Nghiên cứu kiểu plasmid tính kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Thủy sản, trường đại học Cần Thơ 31 trang 19 Inglis, V, R.J Roberts and N.R Bromage, 1994 Bacterial disease of fish Institte of aquaculture, The university Press, Cambrige p 5979 20 Kruse, H and H Sorum Transfer of multiple drug resistance plasmids between bacterial of diverse origin in Natrual Microenvironments Applied and Environment Microbiology 60: 4015-4021 26 21 Lê Thị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, Nguyễn Thị Như Ngọc, Phạm Thanh Liêm, 2008 Giáo trình Thuôc hóa chất nuôi trồng thủy sản, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ, 79 trang 22 Miranda, C.D and R Zemelman, 2002 Antimicrobial multiresistance in bacteria isolated from freshwater Chilean salmon farms The Science of the Total Environment 293: 207 - 218 23 Nguyễn Chính Đánh giá tình hình sử dụng thuốc, hóa chất nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh An Giang Cần Thơ Luạn văn cao học Khoa Thủy Sản, trường đại học Cần Thơ 24 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2007 Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục 519 trang 25 Nguyễn Thị Thuý Hằng, 2008 Tiêu chuẩn hoá phương pháp lập kháng sinh đồ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila khoa thuỷ sản Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Thuỷ Sản, trường đại học Cần Thơ 56 trang 26 Olsen, E.J An improved method for rapid isolation of plasmid DNA from wild-tyde Gram-negative bacteria for plasdmid restriction profile analysis Letters in Applies Microbiology 10: 209-212 27 Phuong, N.T., D.T.H Oanh, T.T Dung and L.X Sinh, 2005 Bacterial resistance to antimicrobials use in shrimp and fish farms in the Mekong Delta, Viet Nam 28 Prescott, J.F., J.D Baggot and R.D Walker, 2000 Antimicrobial therapy in veterinary medicine Iowa State University Press/Ames 795 pp 29 Sarter, S., H.N.K Nguyen, L.T Hung, J Lazard and D Montet Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria isolated from farmed catfish Food Control 18: 1391-1396 30 Schmidt, A.S., Bruun M.S., Dalsgaard I and Larsen J.L., 2001 Incidence, distribution and spread of tetracycline resistance determinants and integron-associated antibiotic resistance genes motile Aeromonads from a fish farming environment Applied and Environmental Microbiology 67: 5675-5682 31 Shotts, E.B and W.D Waltman, 1990 A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri Journal of wildlife disease 26: 214-218 32 Shu-Peng Ho, T.Y Hsu, M.H Chen and W.S Wang, 2000 Antibacterial effect of Chloramphenicol, Thiamphenicol and 27 33 34 35 36 37 38 39 40 41 Florphenicol against aquatic animal bacteria Journal Veterinary Medicine Science 62: 479-485 Sorum, H, T M L’Abee-Lund, A.Solberg, and Anette Wold 2003 Integron-Containing IncU R Plasmids pRAS1 and pAr-32 from the Fish Pathogen Aeromonas salmonicida Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47: 1285-1290 Stock, I and B Wiedemann, 2001 Natural antibiotic susceptibilities of Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella hoshinae, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45: 2245-2255 Stoskopf, M.K., 1993 Fish medicine W B Saunders Company p 832-839 Tiết Ngọc Trân, 2007 So sánh khả gây bệnh hai dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus), Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Thủy sản, trường đại học Cần Thơ 37 trang Trần Lê Triệu Tú, 2007 Ảnh hưởng nhiệt độ lên nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra giống (Pangasianodon hypophthalmus) Luận văn tốt nghiệp đại học, khoa Thủy sản, trường đại học Cần Thơ 37 trang Treves-Brown, K.M., 2000 Applied fish pharmacology Kluwer Academic publishers 309 pp Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh Đặng Thụy Mai Thy, 2004 Xác định vi khuẩn trắng gan cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 137-142 Từ Thanh Dung, Phạm Thanh Hương, Nguyễn Anh Tuấn, 2009 Hiện trạng đa kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đồng sông Cửu Long Hội nghị khoa học thủy sản toàn quốc Đại học Nông Lâm Wedsite: Tổng cục thống kê www.gso.gov.vn 28