THƯ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ HUỆ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CUA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC GIỐNG ASPERGILLUS, TRICHODERMA VÀ ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS ĐỒNG THỊ THANH THU TP.HCM, 2010 MỞ ĐẦU Vi sinh vật nhóm sinh vật có số lượng nhiều có khả chuyển hóa vật chất thiên nhiên mạnh Hiện người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật ứng dụng nhiều đời sống, sản xuất So với nguồn khai thác enzyme từ động vật thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi sinh vật ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp Nhiều enzyme khai thác từ vi sinh vật tập trung nghiên cứu có nhiều ứng dụng thời gian qua protease, amylase, cellulase, pectinase … Những năm sau người ta ý nhiều loại enzyme khác chitinase, enzyme thủy phân chitin Chitin polymer sinh học so sánh với polysaccharide cellulose Chitin phân bố rộng rãi dạng cấu trúc thành tế bào nấm xương tôm cua côn trùng Đây polymer có trọng lượng phân tử cao, không tan nước, chứa đơn phân N-acetyl-glucosamine liên kết liên kết 1,4-β-glucoside Chitin có nhiều công dụng nhiều lĩnh vực y học công nghiệp… Những enzyme có liên quan đến chuyển hóa phân giải chitin nghiên cứu nhiều năm gần Chitin bị phân giải hệ enzyme có tên gọi chung chitinase Enzyme sản xuất tổ chức sống tế bào để phục vụ nhu cầu chức sinh lý chúng Sự phân giải chitin tác động enzyme phụ thuộc vào yếu tố hóa lý (tỉ lệ chất enzyme, pH, nhiệt độ…) Trong nguồn thu nhận chitinase chitinase từ vi sinh vật nguồn quan trọng Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể chủng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter Streptomyces, chủng nấm sợi thuộc chi Asperillus, Penicillium, Trichoderma, số động vật nguyên sinh Những năm gần có nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase tiềm ứng dụng to lớn enzyme nhiều lĩnh vực khác thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine N-acetyl glucosamine, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng y học, việc kiểm soát nấm kí sinh trồng…v.v… Vì ứng dụng rộng rãi chitinase trên, mục đích đề tài nhằm nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ số chủng nấm sợi bước đầu khảo sát số ứng dụng enzyme Chúng thực đề tài: Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng Mục tiêu đề tài: Lựa chọn chủng nấm sợi có khả tổng hợp chitinase cao, thu nhận chế phẩm chitinase từ canh trường bước đầu nghiên cứu số ứng dụng chitinase Nhiệm vụ đề tài - Khảo sát khả sinh tổng hợp chitinase vài chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma Chọn chủng nấm sợi sinh tổng hợp chitinase cao để nghiên cứu tiếp - Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng trình sinh tổng hợp chitinase chủng nấm sợi chọn tối ưu hóa phương pháp qui hoạch thực nghiệm - Thu nhận chế phẩm chitinase - Khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu chế phẩm chitinase: nhiệt độ, pH, nồng độ chất, thời gian thủy phân chất - Bước đầu thử nghiệm số ứng dụng chế phẩm chitinase từ nấm sợi Thời gian địa điểm nghiên cứu đề tài Thời gian : từ tháng 8/2009 – 7/2010 Địa điểm : Đề tài thực Phòng Thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HỆ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI 1.1.1 Khái quát enzyme 1.1.1.1 Cấu trúc [1, 23] Enzyme loại phân tử protein sinh vật tổng hợp nên tham gia xúc tác cho phản ứng sinh học Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, cấu tạo từ L-acid amin liên kết liên kết peptid Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi trung tâm hoạt động enzyme Enzyme gồm hai nhóm: nhóm enzyme cấu tử gồm enzyme có thành phần hóa học protein; nhóm enzyme hai cấu tử gồm enzyme có hai thành phần: phần protein gọi apoenzyme có vai trò xúc tác, phần thứ hai phi protein coenzyme chất hữu đặc hiệu có vai trò thúc đẩy trình xúc tác Ngoài có số kim loại Zn, Cu, Mn, Fe đóng vai trò liên kết enzyme chất trình xúc tác phản ứng, liên kết apoenzyme coenzyme, tham gia trực tiếp vào trình vận chuyển điện tử 1.1.1.2 Cơ chế hoạt động [16, 23] Trung tâm hoạt động enzyme (E) có cấu trúc không gian tương ứng với chất mà chúng xúc tác, phản ứng hình thành trình enzyme tiếp xúc với chất “chìa khóa-ổ khóa“ tạo phức hợp enzyme-cơ chất Quá trình tác động enzyme vào chất để tạo sản phẩm trải qua ba giai đoạn: Giai đoạn 1: Enzyme (E) tương tác với chất (S) nhờ liên kết tạo phức E-S Giai đoạn 2: Khi chất (S) tạo phức với enzyme (E), chất bị thay đổi cấu hình không gian mức độ bền vững liên kết, liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm Giai đoạn 3: Enzyme tách ra, giải phóng nguyên vẹn Sản phẩm (P) tạo thành Sơ đồ chế tác động enzyme: E + S  E-S  E + P 1.1.1.3 Phân loại enzyme [16, 23] Có nhiều cách phân loại enzyme, đề cập đến cách phân loại dựa vào kiểu xúc tác enzyme Tại Hội nghị Sinh Hóa học năm 1961 họp Moscow đề bảng phân loại mới, enzyme chia làm lớp chính: - Oxydoreductase (lớp enzyme oxy hóa hoàn nguyên sinh học) - Transferase (lớp enzyme vận chuyển) - Hydrolase (lớp enzyme thủy phân) - Liase (lớp enzyme phân giải chất không theo đường thủy phân) - Ligase hay Synthetase (lớp enzyme tổng hợp chất) - Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hóa) 1.1.2 Enzyme chitinase [32] 1.1.2.1 Cấu trúc Chitinase [Poly- Beta- 1- – (2-acetalmido-2-deoxy) - D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác thủy giải liên kết 1,4 glucoside C1 C4 hai phân tử Nacetyl Glucosamine liên tiếp chitin Mã số enzyme chitinase EC 3.2.1.14 → Hydrolase → Glycosylase → Glycosidase 14 → Chitinase Chitinase có tên gọi khác (tùy theo xuất xứ enzyme) chitodextrinase, β-poly-Nacetyl glucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC (Streptomyces griceus) Căn vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18 Glycohydrolase 19 Glycohydrolase 20  Họ Glycohydrolase 18 Là họ lớn với khoảng 180 chi, tìm thấy hầu hết loài thuộc Eukaryote, Prokaryote virus Họ bao gồm chủ yếu enzyme chitinase, có enzyme khác chitodextrinase, chitobiase N-acetyl glucosaminidase Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm xoắn α/β cuộn tròn, chúng hoạt động thông qua chế kiểm soát mà đoạn β polymer bị phân cắt tạo sản phẩm β anomer [32] Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 tổng hợp từ giống Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens… Hình 1.1 Cấu trúc không gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 [68]  Họ Glycohydrolase 19 Họ gồm 130 chi, thường thấy chủ yếu thực vật, có xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với vòng xoắn hoạt động thông qua chế nghịch chuyển Họ Glycohydrolase 19 bao gồm chitinase thuộc nhóm I, II,IV Hình 1.2 Cấu trúc không gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 [69]  Họ Glycohydrolase 20 Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces người Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), định vị enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành nhóm: Nhóm I: đồng phân enzyme phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua đoạn giàu glycin prolin đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng gắn kết enzyme chất chitin không cần cho hoạt động xúc tác Nhóm II: đồng phân enzyme phân tử có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein đầu N peptid nhận biết đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase nhóm I Chitinase nhóm II có thực vật, nấm, vi khuẩn Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I II Nhóm IV: đồng phân enzyme chủ yếu có hai mầm, 41-47% trình tự amino acid tâm xúc tác chúng tương tự chitinase nhóm I, phân tử có đoạn giàu cystein kích thước phân tử nhỏ đáng kể so với chitinase nhóm I Nhóm V: dựa liệu trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) giảm nhiều lần trình tiến hóa thực vật bậc cao 1.1.2.2 Cơ chế hoạt động enzyme chitinase [11] Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-- chitobiosidase, N-acetyl- D-glucosaminidase (exochitinase) chitobiase Endochitinase enzyme phân cắt nội mạch chitin cách ngẫu nhiên tạo đoạn olygosaccharides, nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 (± 0,2) M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8) Chitin 1,4- - chitobiosidase enzyme phân cắt chitin tạo thành sản phẩm dimer chitobiose, cụ thể enzyme thu từ Trichoderma harzianum (M = 36kDa, pI = 4,4 ± 0,2) N-acetyl –  - D - glucosaminidase (exochitinase) enzyme phân cắt chitin từ đầu cho sản phẩm monomer N-acetyl-D-glucosamine Chitobiase enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamine Hình 1.3 Vị trí phân cắt enzyme chitinase [70] Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên nội mạch chitin chitooligomer, sản phẩm tạo thành hỗn hợp polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, chiếm đa số diacetylchitobiose (GlcNAc)2 hoạt tính endochitinase phân cắt thêm Hình 1.4 Cơ chế hoạt động enzyme chitinase Trichoderma [11] Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin chitooligomer mức trùng hợp lớn hay [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu không khử phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2 β –N- acetyl hexosaminidase phân cắt chitooligomer hay chitin cách liên tục từ đầu không khử phóng thích đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc) Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm chất Các oligsaccharide thường thủy phân bên vài vị trí xác định cách ngẫu nhiên Một số enyme chitinase có khả thủy phân trisaccharid, số khác không Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: phân cắt bên tạo disaccharid trisaccharid; phân cắt bên tạo monosaccharid tetrasaccharid Tóm lại chitinase thực chất enzyme cắt ngẫu nhiên Endochitinase, chitobiosidase β –N- acetylhexosaminidase hoạt động chất dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer hoạt động chitin thô thu từ vỏ tôm Chitin vách tế bào nấm chứa chitin chất thích hợp cho endochitinase chitobiosidase -N-acetylhexosaminidase Chitooligomer (GluNAc)3 cao sợi chitin chất loại enzyme -N-acetylhexosaminidase hoạt động chậm việc làm giảm độ đục huyền phù chitin (GlcNAc)2 chất tốt -Nacetylhexosaminidase không chất endochitinase hay chitobiosidase Chính sử dụng để phân biệt hoạt tính endochitinase, chitobiosidase -N- acetylhexosaminidase Sản phẩm sau phân cắt N-acetyl glucosamine 1.1.2.3 Các đặc tính hệ enzyme chitinase [11] * Trọng lượng phân tử Enzyme chitinase tìm thấy thực vật bậc cao tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30kDa (kilodalton) Ở loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú), số chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa cao khoảng 120kDa Trọng lượng phân tử enzyme chitinase thu nhận từ nấm vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa * Điểm đẳng điện, số Michaelis Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3- 10 thực vật bậc cao tảo; pI từ 4,7-9,3 côn trùng, giáp xác, thân mềm cá; pI từ 3,5 – 8,8 vi sinh vật Hằng số Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml) * Ảnh hưởng nhiệt độ [32, 63] Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động giới hạn nhiệt độ từ 20 – 500C (Frandberg Schnure, 1994; Huang cộng sự, 1996; Bhushan Hoondal, 1998; Wiwat cộng sự, 1999; Bendt cộng sự, 2001) Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase vi sinh vật hoạt động 400C, ngoại trừ chitinase Aspergillus niger hoạt động chất glycol chitin có nhiệt độ tối thích 50OC (Jeuniaux, 1963) Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà enzyme chitinase có giá trị nhiệt độ tối thích khác Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập suối nước nóng cho thấy khả chịu đựng nhiệt độ cao đến 800C Bendt cộng (2001) phát hoạt tính thủy phân chitin mạnh chitinase từ Vibrio sp Từ 30-450C chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus sp BG-11 hoạt tính cao 40-600C Lorito (1998) khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum Rifai nhận thấy enzyme có khả hoạt động khoảng nhiệt độ rộng từ 25-600C, nhiệt độ tối ưu 400C * Ảnh hưởng pH [32] Giá trị pH tối thích (pHop) hệ enzyme chitinase từ 4-9 enzyme chitinase thực vật bậc cao tảo; hệ enzyme chitinase động vật 4,8- 7,5 vi sinh vật 3,5- 8,0 Theo nhà khoa học, pHop enzyme chitinase có phụ thuộc vào chất sử dụng Đa số enzyme chitinase nghiên cứu có pHop khoảng 5,0 chất glycol chitin nằm khoảng pH kiềm yếu Các nghiên cứu chứng tỏ chitinase hoạt động khoảng pH từ 4,0-8,5 (Morrisey cộng sự, 1976; Wiwat cộng sự, 1999; Bendt cộng sự, 2001) Chitinase nấm hoạt tính cao pH = 5, vi khuẩn pH tối thích 8,0 Theo Bhushan Hoondal (1998), hoạt tính chitinase từ Bacillus sp BG-11 cao pH = 8,5 1.1.2.4 Các nguồn thu nhận enzyme chitinase [11, 27] Enzyme chitinase diện hầu hết sinh vật Enzyme chitinase tìm thấy vi khuẩn Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus đặc biệt nhóm Streptomycetes Vi khuẩn tổng hợp enzyme chitinase nhằm phân giải chitin môi trường nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sinh trưởng phát triển Chitinase tạo loài nấm sợi thuộc chi Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia nấm lớn Lycoperdon, Coprinus Enzyme chitinase thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại nấm kí sinh gây bệnh cho trồng Những thực vật bậc cao có khả tạo chitinase thuốc (Nicotiana sp.), cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) đặc biệt số loài tảo biển nguồn cung cấp enzyme chitinase Từ số động vật nguyên sinh, từ mô tuyến khác hệ tiêu hóa nhiều loài động vật không xương ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt thu nhận enzyme chitinase Đối với động vật có xương sống, enzyme chitinase tiết từ tuyến tụy dịch dày loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, dịch dày loài chim, thú ăn sâu bọ Ngoài ra, enzyme chitinase thu nhận từ dịch biểu bì giun tròn suốt trình phát triển dịch tiết biểu bì loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng (cuticun) chúng trình biến thái hay lột xác 1.1.3 Chitin (cơ chất chitinase) 1.1.3.1 Lịch sử nghiên cứu chitin [56] Chitin mô tả lần Braconnot vào năm 1811, nghiên cứu loài nấm Agaricus volvaceus vài loài nấm khác xử lý với dung dịch kiềm, ông thu sản phẩm đặt tên chitin (chitin có nguồn gốc từ Hy Lạp “tunnic” nghĩa lớp vỏ bọc) Hai năm sau Odier bắt đầu ý đến chất, cấu trúc chitin tính giá trị trung bình So sánh kết với mẫu đối chứng, đánh giá sơ khả diệt sâu CPE A B A-SÂU 1: Sâu gạo C B-SÂU 2: Sâu lạc tiên D C-Mẫu sâu làm thí nghiệm E D-Thí nghiệm đối chứng sâu F E-Xử lý sâu với dung dịch CPE 1% G F-Xử lý sâu với dung dịch CPE 2% H G-Thí nghiệm sâu H-Thí nghiệm đối chứng sâu Hình 3.8 Thử nghiệm tác dụng CPE chitinase Asp Awamori sâu Bảng 3.13 Khảo sát tác dụng diệt sâu CPE chitinase với nồng độ khác Loại sâu Nồng độ CPE (%) Thời gian tác động (phút) Tỉ lệ trung bình sâu chết (%/tổng số sâu TN) 0% 30 0,0 60 8,3 90 13,3 30 36,7 60 58,3 90 78,3 30 55,0 60 70,0 90 85,0 30 0,0 60 0,0 90 6,7 30 36,7 60 63,3 90 70,0 30 66,7 60 80,0 90 93,3 1% SÂU 2% 0% 1% SÂU 2%  Nhận xét Qua bảng số liệu 3.13 (trích dẫn từ phụ lục 5), nhận thấy CPE chitinase thu nhận từ Aspergillus awamori thể khả tác động mạnh lên lớp vỏ chitin sâu hại, côn trùng Sau khoảng thời gian 30 phút, trung bình có khoảng 36% sâu chết xử lý dung dịch chế phẩm nồng độ 1% 55% sâu chết xử lý dung dịch chế phẩm 2%, tỉ lệ sâu chết thí nghiệm đối chứng 0% Sau khoảng thời gian 60 phút, trung bình có khoảng 58% sâu chết xử lý dung dịch chế phẩm nồng độ 1% 70% sâu chết xử lý dung dịch chế phẩm 2%, cao nhiều so với tỉ lệ chết thí nghiệm đối chứng (khoảng 0-8,3%) Sau khoảng thời gian 90 phút, trung bình có khoảng 70% sâu chết xử lý dung dịch chế phẩm nồng độ 1% 85% sâu chết xử lý dung dịch chế phẩm 2%, cao nhiều so với tỉ lệ chết thí nghiệm đối chứng (khoảng 6-13%) Kết mở hướng ứng dụng sâu CPE chitinase thu nhận từ nấm Aspergillus awamori sản xuất thuốc trừ sâu sinh học 3.6.2 Ứng dụng bước đầu thu nhận glucosamine Glucosamine sản phẩm thuỷ phân chitin, chất kết tinh có màu trắng, vị ngọt, dễ hoà tan nước Glucosamine chất có nhiều ứng dụng y học đóng vai trò quan trọng trình sinh lý sinh hóa thể người, tham gia vào chức giải độc gan thận Glucosamine có khả chống viêm gan, chống dị ứng chống thiếu oxi máu; nguyên liệu chủ yếu để tổng hợp chất nhờn sụn khớp thể Khi khớp bị tổn thương, glucosamine nguyên liệu để thể sản xuất chất cần thiết như: collagen, proteoglycan, glucosaminglycan để phục hồi sụn khớp tái cung cấp chất nhờn giúp khớp linh động trở lại Ngoài ra, glucosamine có tác dụng chống ung thư, chữa tổn thương dường ruột, dày [70] Chúng sử dụng hai loại nguyên liệu khác chitin dạng bột chitin huyền phù để thử nghiệm ứng dụng bước đầu chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ nấm sợi Aspergillus awamori để thu nhận glucosamine, đặt sở cho việc sản xuất glucosamine với lượng lớn sau Điều kiện hoạt động chế phẩm điều kiện tối ưu thu từ kết nghiên cứu mục 3.5 (pH = 4, nhiệt độ ủ 500C, thời gian thủy phân 60 phút), nồng độ CPE 0,2%, bột chitin 1,6g/10ml (16%) nước cất, chitin huyền phù 1% Tỉ lệ trộn dung dịch CPE hai loại nguyên liệu chitin dạng bột chitin huyền phù : Kết thu nhận thể bảng 3.13 Bảng 3.14 Hàm lượng glucosamine thu từ phản ứng thủy phân chitin CPE chitinase thu nhận từ chủng Aspergillus awamori Lượng Nguyên liệu ∆OD glucosamine (535nm) tạo thành Hiệu suất (%) (µg/ml) Chitin dạng bột Chitin phù huyền 0,041 11,79 11,8 0,123 35,55 35,5%  Nhận xét Số liệu bảng 3.13 rằng, hiệu suất thủy phân chitin chitinase nồng độ CPE 2%, nhiệt độ phản ứng 500C thời gian phản ứng 60 phút cho hàm lượng glucosamine đạt 11,79µg/ml từ nguyên liệu chitin dạng bột 35,55 µg/ml sử dụng nguyên liệu chitin dạng huyền phù Hiệu suất thủy phân CPE thấp (trung bình 11,79% nguyên liệu chitin dạng bột 35,55% nguyên liệu chitin huyền phù) nguồn enzyme chitinase từ nấm sợi dễ thu nhận, chi phí thấp, đáng để nghiên cứu sử dụng Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Trong trình làm thí nghiệm rút số kết luận sau: - Đã nghiên cứu điều kiện môi trường nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp chitinase ba chủng nấm sợi là: Aspergillus awamori: nhiệt độ thích hợp 350C; thời gian thu enzyme tốt 36-40 Aspergillus sp.: nhiệt độ thích hợp 400C; thời gian thu enzyme tốt 72 Trichoderma harzianum: nhiệt độ thích hợp nhất: 300C; thời gian thu enzyme tốt 60 - Chitin chất cảm ứng tốt để nuôi cấy nấm sợi nhằm thu nhận chitinase - Đã tiến hành qui hoạch thực nghiệm, phương trình hồi qui thu tương thích với thực nghiệm: ŷ=0.82 + 0.11x1 - 0.08x2 + 0.35x3 + 0.30x1x2+0.14x1x3 Từ suy điều kiện tối ưu cho trình sinh tổng hợp chitinase chủng Aspergillus awamori thời gian nuôi cấy 42 giờ, nhiệt độ nuôi 320C, lượng chitin bổ sung thích hợp 16% - Đã nghiên cứu điều kiện tối ưu cho hoạt động chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ chủng nấm sợi Aspergillus awamori nhiệt độ 500C, pH = 4,0 - Đã bước đầu thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme thu nhận từ Aspergillus awamori diệt trừ sâu hại thu nhận glucosamine từ chitin 4.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase số chủng nấm mốc khác - Tiếp tục nghiên cứu khả ứng dụng rộng rãi enzyme lĩnh vực sản xuất thuốc trừ sâu sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh [2] Nguyễn Cảnh (2004), Quy hoạch thực nghiệm NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [3] Tạ Kim Chỉnh (1996), Tuyển chọn số chủng vi nấm diệt côn trùng gây hại Việt Nam khả ứng dụng Luận án Phó Tiến sĩ Khoa học Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học [4] Nguyễn Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm vi nấm NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học NXB Giáo dục [6] Nguyễn Lân Dũng tác giả khác (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập 2, tập 3) NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [7] Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [8] Bùi Xuân Đồng (1982), Nhóm nấm Hyphomycetes Việt Nam (tập1) NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [9] Bùi Xuân Đồng (1997), Vi nấm dùng công nghệ sinh học NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [10] Đinh Minh Hiệp (2004), Nghiên cứu quy trình tách chiết ứng dụng nguồn enzyme chitinase từ nấm mật (coprinus fimentarius) Báo cáo tổng kết nghiệm thu Đề tài Nghiên cứu Khoa Học, Sở Khoa học Công nghệ TP HCM, tr153-160 [11] Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase Trichoderma vai trò kiểm soát sinh học Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh [12] Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát hoạt tính số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ loại đất khác thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh [13] Tô Duy Khương (2004), Khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp khả đối kháng với số nấm gây bệnh thực vật Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh [14] Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh (tập 2) NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [15] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học (tập 2- thí nghiệm vi sinh vật học) NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [16] Nguyễn Đức Lượng tác giả (2004), Công nghệ enzym NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [17] Trần Thạnh Phong (2004), Khảo sát khả sinh tổng hợp enzym cellulase từ Trichoderma reesei Aspergillus niger môi trường lên men bán rắn Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh [18] Trần Thị Thanh (2000), Công nghệ vi sinh NXB Giáo dục [19] Đặng Trung Thành (2008), Bước đầu nghiên cứu thu nhận enzym chitinase khoai lang (Ipomoea batatas) Khánh Hòa Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thủy sản – số 03/2008 [20] Đồng Thị Thanh Thu (2008), Sinh hóa ứng dụng NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [21] Trần Thị Thuần, Lê Minh Thi, Dương Thị Hồng, (1990-1995) Kết nghiên cứu bước đầu nấm Trichoderma, Tuyển tập công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật, tr 202- 210 [22] Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học NXB Giáo dục [23] Lê Ngọc Tú tác giả khác (1982), Enzym vi sinh vật (tập 1, tập 2) NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [24] Nguyễn Văn Tuân (2009), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp Endo-β-1,4-Glucanase đánh giá tính chất lý hóa Endo-β-1,4-Glucanase Luận văn Thạc sĩ khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên [25] Nguyễn Minh Tuyển (2004), Quy hoạch thực nghiệm NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu tiếng Anh [26] A Kapat, T Panda, S.K Rakshit (1996), Parameters optimization of chitin hydrolysis by Trichoderma harzianum chitinase under assay conditions Bioprocess Engineering 14, p.275279 [27] A A Shubakov and P S Kucheryavykh (2004), Chitinolytic Activity of Filamentous Fungi Applied Biochemistry and Microbiology Vol 40 No 5, p.445-447 [28] Azaliza Safarida Wasli, madihah Md Salleh, Suraini Abd-Aziz, Osman Hassan and Nor Muhammad Mahadi (2009), Medium Optimization for Chitinase Production from Trichoderma virens using Central Composite Design Biotechnology and Bioprocess Engineering Vol 14, No 6, p 781-787 [29] Brinda Mahadevan and Don L Crawford (1997), Properties of the chitinase of the antifugal biocontrol agent Streptomyces lydicus WYEC108 Enzyme and Microbial Technology 20, p.489-493 [30] Crispinus A Omumasaba, Naoto Yoshida, and Kihachiro Ogawa (2001), Purification and characterization of a chitinase from Trichoderma viride The Journal of Genaral anh Applied Microbiology Vol 47 No 2, p.53-61 [31] Daizo Koga (2005), Application of Chitinase in Agriculture Journal of Metals, Materials anh Minerals Vol 15 No 1, p.33-36 [32] Jennifer L Guthrie, Sagal Khalif, Alan J Castle (2005), An improved method for detection anh quantification of chitinase activities Canadian Journal of Microbiology Vol 51 Iss 6, p.491-495 [33] Maria Swiontek-Brzezinska, Elzbieta Lalke-Porczyk, Wojciech Donderski (2007), Chitinolytic activity of bacteria and fungi isolated from shrimp exoskeletons International Journal of Oceanography and Hydrobiology Vol XXXVI, No.3, p.101-111 [34] Neetu Dahiya, Rupinder Tewari, Gurinder Singh Hoodal (2006), Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review Applied Microbiology Biotechnology, p.773-782 [35] N.N Nawani, B.P Kapadnis (2005), Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs Process Biochemistry 40, p.651-660 [36] Nopakarn Rattanakit, Abhinya Plikomol, Shigekazu Yano, Mamoru Wakayama, and TakashiTachiki (2002), Ultilization of Shrimp Shellfish Waste as a Substrate for Solid-State Cultivation of Aspergillus sp S1-13: Evaluation of a Culture Based on Chitinase Formation Which is Necessary for Chitin-Assimilation Journal of Bioscience and Bioengineering Vol 93, No 6, p 550-556 [37] P Arthur Felse, T Panda (1999), Self-directing optimization of parameters for extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in batch mode Process Biochemistry 34, p.563-566 [38] Phakapob Setthakaset, Rath Pichyangkura, Anawat Atavakom and Mongkol Sukwattanasinitt (2008), Preparation of N-acetyl-D-Glucosamine Using Enzyme from Aspergillus sp Journal of Metals, Materials and Minerals, Vol 18, No 2, p 53-57 [39] Reetarani S.Patil, Vandana ghormade, mukund V Deshpande (1999), chitinolitic enzymes an exploration [40] Sahai and Manocha, (1993), Chitinase of fungi and plants their in morphogenesis and host parasite interattion FEMS microbiol rev 11, p 317-338 [41] S.M Akhir, S Abd-Aziz, M.M Salleh, R.A Rahman, R.M Ilias and M.A Hassan (2009), Medium Optimisation of Chitinase Enzyme Production from Shrimp Waste Using Bacillus licheniformis TH-1 by Responnse Surface Methods Biotechnology (1), p 120-1205 [42] Takuya Koseki, Shinji Furuse, Kimio Iwano, Hiroshi Sakai and Hiroshi Matsuzawa (1997), An Aspergillus awamori acetylesterase: purification of the enzyme, and cloning and sequencing of the gene.Bio chem J 326, p.485-490 [43] Zofia Olempska-Beer (2008), Asparaginase from Aspergillus niger expressed in A Niger Chemical and Technical Assessment Internet [44] www.coe.drexel.edu/ /researchfocus.html [45] http://www.yduocngaynay.com/8-8TK_TrVHung_cua.htm [46] http://www.moit.gov.vn/vsi_portlets/UserFiles/File/Danhsachtuyenchon.doc [47] http://www.lboro.ac.uk/departments/cg/Projects/2001/clarke/introduction.html [48] http://www.vnn.vn/khoahoc/suckhoe/2005/01/370883/ [49] .http://www.fistenet.gov.vn [50] http://www.nutrifood.com.vn [51] http://www.vnexpress.net [52] http://www.webtretho.com/forum/register.php [53] http://Psre.usm.edu [54] http://www.meronbiopolymers.com [55] http://www.oligophar.ru [56] http://www.ozemail.com.au/zadco/trichoderma.htm [57] http://www.moi.gov.vn [58] http://www.Roorthing-biochem.com/default.htlm [59] http://hoahocvietnam.com.vn [60] http://vietnam.net [61] http://wdcm.nig.ac.jp/catalogue/ncim/document/Ncim_s_fungi.pdf [62] http://www.ecfg10.info/images/Asperfest7Program.pdf [63] http://www.igb.fraunhofer.de/www/gf/molbiotech/weissebiotech/en/Chitin.en.html [64] http://www.palaeos.com/Eukarya/Units/StemMetazoa/Microsporidia.html [65] http://www.moldbacteria.com/Aspergillus_niger.gif [66] http://www.pf.chiba-u.ac.jp/gallery/fungi/a/Aspergillus_niger_colony.htm [67] http://www.mold.ph/trichoderma.htm [68] http://delloyd.50megs.com/moreinfo/buffers2.html#buffer [69] http://www.spices.res.in/spicebioinfo/project/chitinase/result.php [70] http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/learningcenter/carbohydrate-analysis/carbohydrate-analysis-ii.html [71] http://www.thuocbietduoc.com.vn/thuoc/thuoc-goc945.aspx 1.1 PHỤ LỤC 1.2 PHỤ LỤC - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE Bảng P.1 Đường chuẩn Glucosamine có nồng độ từ 0-70µg/ml Ống số 10 20 30 40 50 60 70 OD535nm 0,115 0,148 0,165 0,216 0,561 0,297 0,325 0,340 ∆OD 0,000 0,033 0,054 0,101 0,146 0,182 0,210 0,225 Nồng độ Glucosamine (µg/ml) 1.3 0.30 DeltaOD y = 0.0344x - 0.0359 R = 0.9873 0.20 0.10 0.00 10 20 30 40 50 60 70 Nồng độ Glucosamine (micromol/ml) 1.4 1.5 Đồ THị P.1-ĐƯờNG CHUẩN GLUCOSAMINE BIểU DIễN MốI TƯƠNG QUAN GIữA ∆OD VÀ HÀM LƯợNG GLUCOSAMINE PHỤ LỤC - THU NHẬN CHITIN TỪ VỎ TÔM Khối lượng vỏ tôm ban đầu 100 gam, xay nhỏ tiến hành thu nhận chitin theo bước 2.4.5 Cân khối lượng chitin, xác định tỉ lệ chitin có vỏ tôm Bảng P.2- Khối lượng chitin thu từ vỏ tôm Số lần thí nghiệm Khối lượng chitin thu (g/100g nguyên liệu) 18,65 19,25 18,95 Trung bình 18,95 Hình P.2 Chitin từ vỏ tôm  Nhận xét kết Khối lượng chitin thu 18,95/100 g vỏ tôm, tỷ lệ thấp thực tế (khoảng 30%) kỹ thuật tách chiết hạn chế, có mát trình lọc, rửa…; nguyên liệu lẫn tạp chất… Chitin vỏ tôm 18,95 %, khoảng 81 % thành phần lại chủ yếu khoáng protein PHỤ LỤC Hình P.3 - Huyền phù chitin ống thử thật ống thử không Hình P.3 - Hiện màu thuốc thử DNS ống nghiệm thử thật ống thử không enzyme chitinase từ chủng Aspergillus awamori PHỤ LỤC – PHA DUNG DỊCH ĐỆM [67] 4a Dung dịch đệm acetate( pH= 3,6-5,6) a Dung dịch acid acetic 0,2 M: 11,55 ml CH3COOH đặc, dẫn nước đến 1000ml b Dung dịch Natriacetate 0,2 M: 16,4g CH3 COONa 27,2g CH3 COONa.3H2O hòa tan dẫn nước đến 1000ml nước cất Giá trị pH dung dịch đệm phụ thuộc vào số ml dung dịch a số ml dung dịch (b) dẫn đến 100ml a (ml) b (ml) pH a (ml) b (ml) pH 46,3 3,7 3,6 25,5 24,5 4,6 44 3,8 20 30 4,8 4b Dung dịch đệm Cacbonat (pH = 9,2- 10,7) a Dung dịch Natricacbonate 0,2M: 21,2 g Na2CO3 hòa tan dẫn nước cất đến 1000ml b Dung dịch Natrihydrocacbonat 0,2M: 16,8 g NaHCO3 hòa tan dẫn nước đến 1000 ml Dung dịch đệm cacbonat có pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) số ml dung dịch (b) dẫn nước đến 200ml a (ml) b (ml) pH a (ml) b (ml) pH 46 9,2 27,5 22,5 10 7,5 42,5 9,3 30 20 10,1 9,5 40,5 9,4 33 17 10,2 13 37 9,5 35,5 14,5 10,3 16 34 9,6 38,5 11,5 10,4 19,5 30,5 9,7 40,5 9,5 10,5 22 28 9,8 42,5 7,5 10,6 25 25 9,9 45 10,7 PHỤ LỤC Bảng P.5 - KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM CHITINASE TRÊN SÂU SỐ LOẠI LƯỢNG SÂU SÂU TN (CON) SÂU SÂU 20 10 CON/TN NỒNG ĐỘ CPE (%) 0 0 1 1 2 2 0 0 1 1 2 2 THỜI GIAN (PHÚ T) 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 30 60 90 120 150 TN1 SL 3 12 16 17 18 10 14 18 20 20 0 7 9 10 10 % 10 15 15 25 40,0 60,0 80,0 85,0 90,0 50,0 70,0 90,0 100 100 0 10 20 40 30,0 60,0 70,0 70,0 90,0 60,0 70,0 90,0 100 100 TỈ LỆ SÂU CHẾT TN2 TN3 SL 2 4 12 15 16 16 12 14 17 20 20 0 4 6 10 10 10 10 % 10 10 20 20 35,0 60,0 75,0 80,0 80,0 60,0 70,0 85,0 100 100 0 30 40 40,0 60,0 60,0 80,0 100 70,0 80,0 100 100 100 SL 4 11 16 16 17 11 14 16 19 20 0 1 8 9 10 10 % 15 20 20 35 55 80 80 85 55 70 80 95 100 0 10 10 30 40 70 80 80 90 70 90 90 100 100 TB SL 0,0 1,7 2,7 3,7 4,3 7,3 11,7 15,7 16,3 17,0 11,0 14,0 17,0 19,7 20,0 0,0 0,0 0,7 2,0 3,7 3,7 6,3 7,0 7,7 9,3 6,7 8,0 9,3 10,0 10,0 % 8,3 13,3 18,3 21,7 36,7 58,3 78,3 81,7 85,0 55,0 70,0 85,0 98,3 100 0 6,7 20 36,7 36,7 63,3 70,0 76,7 93,3 66,7 80,0 93,3 100 100