BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -  NGUYỄN KIM CHI Mã sinh viên: 1101050 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG TẠP CHẤT A CỦA CLOPIDOGREL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -  NGUYỄN KIM CHI Mã sinh viên: 1101050 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG TẠP CHẤT A CỦA CLOPIDOGREL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn Thạc sĩ: Đỗ Thị Thanh Thủy Nơi thực Bộ môn Hóa Dƣợc HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu, tìm hiểu thực đề tài với nhiều cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận lúc xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian qua Với lòng biết sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Đỗ Thị Thanh Thủy giảng viên Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn tận tình bảo thời gian thực khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực khóa luận tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị, bạn em nhóm kiểm nghiệm môn Hóa Dược động viên khích lệ giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Kim Chi MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………… Chƣơng TỔNG QUAN…………………….……………………………………….3 1.1 Clopidogrel 1.1.1 Một số thông tin chung Clopidogrel 1.1.2 Chỉ định 1.1.3 Các dạng bào chế clopidogrel thị trường 1.1.4 Các tạp chất clopidogrel 1.1.4.1 Các tạp chất clopidogrel 1.1.4.2 Phương pháp xác định tạp chất liên quan clopidogrel theo số dược điển 1.2 Tạp chất A clopidogrel 1.3 Tổng quan số phương pháp sử dụng nghiên cứu đề tài 1.3.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) 1.3.2 Phương pháp đo suất quay cực 1.3.3 Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) 1.3.4 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) 1.3.5 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( NMR) 1.3.6 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) 10 1.4 Một số phương pháp HPLC xác định tạp A clopidogrel 11 1.4.1 Phương pháp HPLC 11 1.4.2 Phương pháp HPLC/MS 13 1.5 Tình hình nghiên cứu nước 13 1.6 Tình hình nghiên cứu giới 14 Chƣơng NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………………………… …………15 2.1 Nguyên liệu 15 2.2 Thiết bị 15 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.3.1 Tổng hợp tinh chế 16 2.3.2 Xây dựng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng tạp A 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Tổng hợp tinh chế xác minh cấu trúc tạp A 17 2.4.1.1 Phương pháp tổng hợp tạp chất A 17 2.4.1.2 Phương pháp tinh chế sản phẩm thô 17 2.4.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết 17 2.4.1.4 Xác định dạng đồng phân sản phẩm 17 2.4.1.5 Xác định cấu trúc chất tổng hợp 17 2.4.2 Xác định hàm lượng sản phẩm phương pháp HPLC 18 Chƣơng 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………………19 3.1 Tổng hợp tạp chất A clopidogrel 19 3.1.1 Nguyên tắc phản ứng 19 3.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện tổng hợp 19 3.1.3 Quy trình tổng hợp IAC 20 3.2 Tinh chế IAC 21 3.3 Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm TLC nhiệt độ nóng chảy 22 3.3.1 Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm TLC 22 3.3.2 Xác định nhiệt độ nóng chảy 23 3.4 Xác định cấu trúc sản phẩm 23 3.4.1 Xác định dạng muối kết hợp 23 3.4.2 Đo suất quay cực 24 3.4.3 Đo phổ IR sản phẩm IAC 24 3.4.4 Đo phổ khối sản phẩm IAC 25 3.4.5 Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân sản phẩm IAC………… … 25 3.4.5.1 Kết phân tích phổ 1H-NMR 26 3.4.5.2 Kết phân tích phổ 13C-NMR 26 3.4.5.2 Kết phân tích phổ COSY 27 3.4.5.4 Kết phân tích phổ HSQC 28 3.5 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng sản phẩm IAC phương pháp HPLC 30 3.5.1 Xây dựng phương pháp 30 3.5.2 Thẩm định phương pháp xác định hàm lượng sản phẩm IAC 31 3.5.2.1 Tính thích hợp hệ thống sắc ký 31 3.5.2.2 Độ đặc hiệu 32 3.5.2.3 Độ tuyến tính 33 3.5.2.4 Độ xác 34 3.5.2.5 Độ 35 3.5.3 Kết xác định hàm lượng sản phẩm IAC 36 3.6 Bàn luận 36 3.6.1 Tính hiệu kinh tế 36 3.6.2 Về quy trình tổng hợp 36 3.6.3 Về quy trình tinh chế 37 3.6.4 Về việc xác minh cấu trúc IAC tinh chế 38 3.6.5 Về xác định hàm lượng IAC tinh chế HPLC 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………40 KẾT LUẬN 40 KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………… 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Clopidogrel bisulfat : CLS EtOH : Ethanol EP (European pharmacopoeia) : Dược điển Châu Âu EPRS (European pharmacopoeia reference standard) : Chất chuẩn đối chiếu dược điển Châu Âu GC (Gas chromatography) : Sắc ký khí HPLC (High performance liquid chromatography) : Sắc ký lỏng hiệu cao IR (Infranred) : Hồng ngoại IAC (Impurity A of clopidogrel) : Tạp chất A clopidogrel KP (Korean pharmacopoeia) : Dược điển Hàn Quốc KTCL : Kiểm tra chất lượng MS (Mas spectrum) : Phổ khối NMR (Nulear magnetic resonance) : Cộng hưởng từ hạt nhân PA (Pure analysis) : Tinh khiết phân tích PTN : Phòng thí nghiệm RSD (Relative standard deviation) : Độ lệch chuẩn tương đối TLC : Sắc ký lớp mỏng TLTK : Tài liệu tham khảo TƯ : Trung ương USP (United State pharmacopoeia) : Dược điển Mỹ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết giá trị Rf khảo sát thời gian phản ứng TLC 20 Bảng 3.2 Hiệu suất toàn trình bán tổng hợp tinh chế IAC 22 Bảng 3.3 Kết kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm IAC TLC 23 Bảng 3.4 Kết đo NSQC sản phẩm IAC 24 Bảng 3.5 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký 31 Bảng 3.6 Kết khảo sát tuyến tính 33 Bảng 3.7 Kết thẩm định độ xác phương pháp 35 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ phương pháp 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Công thức cấu tạo clopidogrel Hình 1.2 Một số sản phẩm chứa clopidogrel thị trường Hình 1.3 Một số sản phẩm phối hợp clopidogrel với hoạt chất khác Hình 1.4 Công thức cấu tạo tạp chất A clopidogrel Hình 2.1 Tạp chuẩn A clopidogrel EPRS 15 Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp tạp A clopidogrel dự kiến 19 Hình 3.2 Kết khảo sát thời gian phản ứng TLC 20 Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp IAC 21 Hình 3.4 Sắc ký lớp mỏng sản phẩm IAC với hệ dung môi 23 Hình 3.5 Phổ IR sản phẩm IAC mẫu chuẩn 25 Hình 3.6 Phổ khối sản phẩm IAC 25 Hình 3.7 Cấu trúc sản phẩm IAC xác định phương pháp phổ 26 Hình 3.8 Phổ 1H NMR sản phẩm IAC 26 Hình 3.9 Phổ 13C NMR sản phẩm IAC 27 Hình 3.10 Tương tác COSY 28 Hình 3.11 Phổ COSY sản phẩm IAC 29 Hình 3.12 Phổ HSQC sản phẩm IAC 30 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng 32 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 32 Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu thử 33 Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn phục thuộc nồng độ diện tích pic IAC [...]... dung nghiên cứu 2.3.1 Tổng hợp và tinh chế - Tổng hợp tạp A c a clopidogrel Acid (+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7dihydrothieno[3,2-c]pyridin-5(4H)-acetic - Tinh chế tạp A - Kiểm tra độ tinh khiết - Xác định cấu trúc c a sản phẩm tổng hợp được 2.3.2 Xây dựng phƣơng pháp HPLC để xác định hàm lƣợng c a tạp A - Xây dựng phương pháp HPLC - Thẩm định phương pháp 17 - Xác định hàm lượng c a tạp A 2.4 Phƣơng pháp. .. clopidogel (acid (+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c] pyridin-5(4H)-acetic), để tiến tới thiết lập tạp chuẩn góp phần chủ động trong công tác kiểm tra chất lượng thuốc Đề tài “ Nghiên cứu tổng hợp và xây dựng phương pháp xác định hàm lượng tạp A c a clopidogrel được thực hiện với 3 mục tiêu sau: 1 Nghiên cứu được phương pháp tổng hợp tạp chất A c a clopidogrel 2 Tinh chế tạp A đạt hàm lượng. .. xác định là cơ sở cho phép định lượng + Xác định tạp liên quan: tính % tạp d a vào tạp chuẩn, hoặc đối với phép thử tạp chất liên quan khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp chuẩn thì có thể tính % tạp chất d a vào % diện tích pic c a tạp đó so với tổng diện tích các pic (gồm các pic tạp và pic chính) 1.4 Một số phƣơng pháp HPLC xác định tạp A c a clopidogrel 1.4.1 Phƣơng pháp HPLC  Phương pháp. .. Clopidogrel bisulfat do Viện Dược liệu sản xuất, lô B 21, hàm lượng 98,0% - Chất đối chiếu: Chất chuẩn Clopidogrel impurity A (Chất chuẩn dược điển châu âu EPRS, lô 2, code Y0001335) Hình 2.1: Tạp chuẩn A c a clopidogrel EPRS - H a chất, dung môi: + Ethanol PA + Ethyl acetat PA + Natri hydroxyd P + Aceton PA + Lithi hydroxyd PA + Acid acetic băng PA + Acid hydrocloric PA + Natri dihydro phosphat PA + Acetonitril... tra chất lượng sản phẩm clopidogrel bisufat tổng hợp được tác giả phải sử dụng các tạp chuẩn được đặt mua ở nước ngoài 1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thị trường đã có tạp chuẩn A do USP và EP sản xuất được bán với giá thành khá cao, tuy nhiên thời gian đặt mua lâu Hiện ch a có công bố nào về quy trình tổng hợp và thiết lập các tạp chuẩn c a clopidogrel Một số phương pháp xác định tạp chất. .. phổ khối để xác định các chất phân tích 1.5 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Hiện tại ở Việt Nam ch a có nghiên cứu về tổng hợp và tinh chế các tạp chất c a clopidogrel để sử dụng làm nguyên liệu thiết lập các tạp chuẩn dùng trong công tác kiểm tra chất lượng clopidogrel Mới chỉ có đề tài Nghiên cứu quy trình công nghệ tổng hợp Clopidogrel bisulfat làm thuốc điều trị các bệnh tim mạch” c a TS.Nguyễn Văn... tổng hợp IAC d a vào phản ứng thủy phân clopidogrel trong môi trường kiềm Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp tạp A c a clopidogrel dự kiến 3.1.2 Khảo sát l a chọn các điều kiện tổng hợp Tiến hành khảo sát l a chọn dung môi h a tan, chất thủy phân và điều kiện nhiệt độ tiến hành - Khảo sát dung môi h a tan: l a chọn ethanol 96o vì đây là dung môi rẻ tiền, không độc hại và h a tan dễ dàng nguyên liệu clopidogrel. .. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Tổng hợp tinh chế và xác minh cấu trúc tạp A 2.4.1.1 Phƣơng pháp tổng hợp tạp chất A - D a trên nguyên tắc tổng hợp tạp chất A từ clopidogrel sulfat bằng phản ứng thủy phân trong môi trường kiềm 2.4.1.2 Phƣơng pháp tinh chế sản phẩm thô - Sử dụng các dung môi và điều kiện phù hợp để tinh chế sản phẩm thô 2.4.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết - Kiểm tra độ tinh khiết c a sản phẩm... phối bởi các công ty trong nước và nước ngoài như: công ty cổ phần dược phẩm GLOMED, công ty cổ phần Dược phẩm Hà Tây, công ty NAVANA PHARMACEUTICALS LTD… Hình 1.2 Một số sản phẩm ch a clopidogrel trên thị trường Hình 1.3 Một số sản phẩm phối hợp c a clopidogrel với hoạt chất khác 5 1.1.4 Các tạp chất c a clopidogrel 1.1.4.1 Các tạp chất c a clopidogrel - Tạp chất A: Acid (+)-(S)-α-(2-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c]... dụng: + Định tính: Với một chất ở điều kiện đo nhất định (về nhiệt độ và bước sóng) thì [α] c a nó là một hằng số Vì thế việc xác định [α] giúp nhận biết được chất đó cũng như mức độ tinh khiết c a nó + Định lượng: d a vào định luật Bio, khi đã biết chiều d c a ống đo và năng xuất quay cực [α], đo góc quay cực φ c a dung dịch Từ đó sẽ xác định được nồng độ c a dung dịch + Ngoài ra trong h a học hữu