BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HOA Mã sinh viên: 1101191 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID COROSOLIC TRONG CAO BẰNG LĂNG NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HOA Mã sinh viên: 1101191 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID COROSOLIC TRONG CAO BẰNG LĂNG NƯỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Kiều Anh DS Nguyễn Mai Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Phân Tích Độc Chất Trường Đại Học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng cảm ơn sâu sắc tới hai người thầy PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh DS Nguyễn Mai Hương người thầy tận tình hướng dẫn, động viên giúp đỡ nhiều trình thực hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn đến công ty Traphaco cung cấp mẫu hóa chất trình tiến hành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Phân tích Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội hỗ trợ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành khóa luận Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè khích lệ, động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 07 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Lê Thị Hoa MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY BẰNG LĂNG NƯỚC VÀ ACID COROSOLIC 1.1.1 Cây Bằng lăng nước 1.1.1.1 Đặc điểm Bằng lăng nước 1.1.1.2 Phân bố 1.1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.1.5 Công dụng 1.1.1.6 Các nghiên cứu tác dụng Bằng lăng nước .6 1.1.2 Acid corosolic 1.1.2.1 Công thức cấu tạo đặc tính hóa lý 1.1.2.2 Tác dụng acid corosolic 1.1.2.3 Một số phương pháp định lượng acid corosolic 1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO .10 1.2.1 Nguyên lý chung sắc ký lỏng hiệu cao 10 1.2.2 Một số thông số đặc trưng 12 1.2.3 Ứng dụng 13 1.2.3.1 Định tính 13 1.2.3.2 Định lượng 13 1.3 VÀI NÉT VỀ CAO THUỐC 14 1.3.1 Định nghĩa 14 1.3.2 Phương pháp điều chế 14 1.3.3 Yêu cầu chất lượng 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 17 2.1.1 Nguyên vật liệu .17 2.1.2 Thiết bị phân tích 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 18 2.2.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp 18 2.2.3 Thẩm định phương pháp nghiên cứu 18 2.2.4 Áp dụng phương pháp xây dựng định lượng acid corosolic số mẫu thực 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH .21 3.1.1 Chuẩn bị mẫu phân tích 21 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký .21 3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn tỷ lệ pha động 22 3.1.2.2 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng 23 3.1.2.3 Khảo sát lựa chọn nhiệt độ cột 23 3.1.2.4 Khảo sát lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 25 3.1.2.5 Điều kiện phân tích 26 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID COROSOLIC 27 3.2.1 Sự phù hợp hệ thống .27 3.2.2 Độ đặc hiệu .27 3.2.3 Độ tuyến tính 29 3.2.4 Độ lặp lại 31 3.2.5 Độ 32 3.3 ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÊN MỘT SỐ MẪU CAO BẰNG LĂNG NƯỚC 34 3.4 BÀN LUẬN 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 KẾT LUẬN ĐỀ XUẤT TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BLN Bằng lăng nước HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao ĐTĐ Đái tháo đường T.bình Trung bình RSD Độ lệch chuẩn tương đối SD Độ lệch chuẩn MeOH Methanol ACN Acetonitril LC- MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ EtOAc Ethylacetat CA Acid corosolic RP Sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo NP Sắc ký lỏng hiệu cao pha thuận ELSD Detector tán xạ bay RI Detector khúc xạ MC Sắc ký khối phổ PDA Detector UV Diode Array DANH MỤC BẢNG Bảng Nội dung Trang Mẫu cao Bằng lăng nước 18 Thiết bị phân tích 18 3.1 Kết phù hợp hệ thống 30 3.2 Kết khảo sát khoảng tuyến tính 33 3.3 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp với mẫu M01 35 3.4 Kết khảo sát độ phương pháp với mẫu M01 36 3.5 Hàm lượng acid corosolic mẫu cao Bằng lăng nước 38 DANH MỤC HÌNH VẼ Bảng Nội dung Trang 1.1 Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.) 1.2 Cấu trúc hóa học acid corosolic 1.3 Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu cao 12 3.1 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 25 3.2 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 26 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn khảo sát nhiệt độ cột 27 3.4 Kết khảo sát thời gian chiết mẫu M01 28 3.5 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp 31 3.6 Sắc ký đồ dung dịch acid corosolic chuẩn nồng độ từ 50-100 33 μg/ml 3.7 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ diện tích pic acid corosolic 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường (ĐTĐ) tình trạng tăng đường huyết mạn tính với tăng glucose huyết thiếu hụt tương đối tuyệt đối insulin [2] Dân số mắc đái tháo đường gia tăng với tốc độ ngày cao Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), số người bị bệnh ĐTĐ tăng từ 108 triệu người (1980) đến 422 triệu người (2014), tỷ lệ người lớn 18 tuổi mắc ĐTĐ tăng từ 4,7% (1980) lên 8,5% (2014) [29] Tại Việt Nam, theo nghiên cứu Bệnh viện Nội tiết Trung ương, năm 2002 nước có khoảng 2,7% dân số mắc bệnh ĐTĐ đến năm 2012 tỷ lệ tăng lên gần 5,7% (điều tra vùng nước) Cùng tốc độ phát triển nhanh chóng, với tính chất bệnh mạn tính kéo dài gây nhiều biến chứng, ĐTĐ gây gánh nặng sức khỏe kinh tế cho cá nhân người bệnh cho toàn xã hội Vì vậy, việc nghiên cứu thuốc điều trị ĐTĐ trọng tâm ý nhà khoa học Ở số nước châu Á (Ấn Độ, Philippin, Nhật Bản,…), Bằng lăng nước dùng làm trà chủ yếu để phòng điều trị ĐTĐ [21] Lá có chứa acid corosolic – hợp chất thuộc nhóm saponin triterpenoid với hàm lượng cao, có tác dụng hạ đường huyết thông qua chế gián tiếp tăng vận chuyển glucose vào tế bào [10], [16], [25], [26] Hàm lượng hoạt chất cao tiến hành thử nghiệm lâm sàng tác dụng hạ đường huyết người Ở Việt Nam, Bằng lăng nước phân bố rộng rãi khắp nước, đặc biệt tỉnh miền Bắc, phát triển tươi tốt – nguồn nguyên liệu sẵn có, thuận lợi cho việc nghiên cứu, phát triển sản phẩm thuốc từ dược liệu Trong sản xuất, dược liệu Bằng lăng nước bào chế thành cao thuốc Lá làm sạch, nghiền nhỏ, chiết cồn, sấy nhiệt độ thích hợp tạo thành cao khô Cao khô nghiền nhỏ tạo thành bột cao khô Dược liệu làm thuốc cần phải tiêu chuẩn hóa chất lượng, Dược điển Việt Nam IV lại chưa có chuyên luận BLN [3], nghiên cứu tác giả Trần Thị Hằng [7] bước đầu xác định acid corosolic Bằng lăng nước nhiều hạn chế Để góp phần tiêu chuẩn hóa 28 - Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 500 μg/ml - Mẫu thử: cân xác khoảng 0,10 g mẫu M01 vào bình định mức 25 ml, thêm 15 ml MeOH xử lý tương tự mục 3.1.2.5 Tiêm mẫu vào hệ thống HPLC, tiến hành phân tích điều kiện lựa chọn, thu sắc ký đồ Hình 3.5 DAD1 A, Sig=210,4 Ref=360,100 (CO153009.D) mAU a) 25 20 15 10 0 2.5 7.5 10 12.5 15 17.5 10 12 14 20 16 DAD1 A, Sig=210,4 Ref=360,100 (CO153002.D) Norm b) 120 14.876 100 80 60 40 20 0 29 DAD1 A, Sig=210,4 Ref=360,100 (CO153010.D) mAU c) 120 100 14.754 80 60 40 20 0 2.5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp a) Sắc ký đồ mẫu trắng b) Sắc ký đồ mẫu chuẩn c) Sắc ký đồ mẫu M01 Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất pic chất phân tích thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử xuất pic chất tương ứng với pic chất nghiên cứu sắc ký đồ mẫu chuẩn Do phương pháp đạt độ đặc hiệu Dựa vào thời gian lưu pic chất phân tích sắc ký đồ mẫu thử trùng với thời gian lưu pic acid corosolic sắc ký đồ mẫu chuẩn, định tính chất phân tích mẫu thử 3.2.3 Độ tuyến tính Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 500 μg/ml, pha loãng xác để dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ từ 50 μg/ml - 400 μg/ml MeOH Lọc qua màng lọc 0,45 m Tiến hành sắc ký theo điều kiện lựa chọn mục 3.1.2.5 Kết khảo sát khoảng tuyến tính trình bày Bảng 3.2, Hình 3.6, Hình 3.7 30 Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch acid corosolic chuẩn nồng độ từ 50-100 μg/ml Bảng 3.2 Kết khảo sát độ tuyến tính STT Nồng độ hoạt chất (µg/ml) Diện tích pic (mAu.s) 400 3082,1 300 2341,5 200 1578,1 100 794,2 50 389,7 Hệ số tương quan: r ≥ 0,998 r = 0,9998 Phương trình hồi quy y = 7,6932x + 21,557 31 3500 y = 7.6932x + 21.557 R² = 0.9998 diện tích pic (mAU.s) 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 100 200 300 400 500 nồng độ (μg/ml) Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ diện tích pic acid corosolic Nhận xét: Kết khảo sát tính tuyến tính cho thấy khoảng nồng độ từ 50-400 μg/ml có tương quan chặt chẽ nồng độ diện tích pic (hệ số tương quan r = 0,9998) 3.2.4 Độ lặp lại Độ lặp lại phương pháp đánh giá dựa kết phân tích mẫu độc lập điều kiện phân tích Tiến hành định lượng lần độc lập mẫu thử M01 (độ ẩm: 7,18%) theo điều kiện xử lý mẫu sắc ký lựa chọn mục 3.1.2.5 Tính hàm lượng acid corosolic theo dược liệu khô mẫu thử, độ lệch chuẩn tương đối, kết trình bày Bảng 3.3 32 Bảng 3.3 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp với mẫu M01 STT Khối lượng Diện tích Hàm lượng acid Thống kê độ lặp lại cân (g) pic corosolic tính theo RSD ≤ 2,7% (mAu.s) cao khô (mg/100mg) 0,10377 712,3 2,328 Hàm lượng trung bình: 0,10476 716,8 2,321 2,34% 0,10209 705,8 2,345 0,10956 769,2 2,381 0,10871 748,5 2,335 0,10476 719,2 2,327 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = 0,94% Nhận xét: Theo AOAC, hàm lượng chất phân tích ≥ < 10%, độ lặp lại phương pháp RSD (%) phải đạt < 2,7 % Kết phân tích cho thấy độ lặp lại phương pháp acid corosolic đạt yêu cầu (RSD = 0,94%) Như vậy, phương pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu AOAC [19] 3.2.5 Độ Độ xác định phương pháp thêm chuẩn: thêm lượng xác chất chuẩn acid corosolic vào mẫu thử cho nồng độ hoạt chất nằm khoảng tuyến tính khảo sát Tiến hành định lượng dung dịch thử phương pháp lựa chọn mục 3.1.2.5 Dựa vào hàm lượng acid corosolic biết mẫu thử, diện tích pic thu dung dịch chuẩn dung dịch thử thêm chuẩn, xác định giá trị phần trăm tìm lại chuẩn Kết khảo sát độ trình bày bảng sau: 33 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ phương pháp với mẫu M01 STT Diện tích pic (mAU.s) Cm+c Cm Cc Độ tìm lại (%) 97 – 103% 1455,67 0,186 0,0781 0,106 101,79 1404,40 0,180 0,0765 0,106 97,45 1433,26 0,183 0,0776 0,106 99,43 1436,74 0,184 0,0769 0,106 101,04 1418,33 0,182 0,0776 0,106 98,49 1414,46 0,181 0,0770 0,106 98,11 T.bình 99,39 RSD(%) 1,73 Trong đó: Cm+c: Nồng độ acid corosolic dung dịch mẫu thử thêm chuẩn (mg/ml) Cm: Nồng độ acid corosolic từ mẫu thử có dung dịch mẫu thử thêm chuẩn (mg/ml) Cc: Nồng độ acid corosolic từ chuẩn thêm vào dung dịch mẫu thử thêm chuẩn (mg/ml) Nhận xét: Với quy trình lựa chọn, định lượng chất nghiên cứu có độ thu hồi nằm khoảng đáp ứng yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích mẫu AOAC: Mẫu M01 có độ thu hồi acid corosolic 97,5 – 101,8% (nằm khoảng 97 – 103% với hàm lượng mẫu ≥ < 10% theo AOAC) 34 3.3 ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÊN MỘT SỐ MẪU CAO BẰNG LĂNG NƯỚC Xác định độ ẩm mẫu cao BLN theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 12.16 Cân nhanh 0,50 g mẫu thử nghiền thành bột mịn vào cốc đáy có đường kính khoảng 50 mm chiều cao khoảng 30 mm Sấy 100 – 105 0C Lấy để nguội bình hút ẩm có chất hút ẩm phosphor pentoxyd silica gel cân Tính toán kết theo phần trăm khối lượng Chuẩn bị dung dịch mẫu thử dung dịch mẫu chuẩn, tiến hành phân tích với điều kiện mục 3.1.2.5 Xác định hàm lượng acid corosolic mẫu thử cao BLN dựa vào diện tích pic acid corosolic sắc ký đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn, nồng độ acid corosolic dung dịch chuẩn, khối lượng, độ pha loãng độ ẩm mẫu thử cao dược liệu Sử dụng số liệu dung dịch chuẩn có đáp ứng phân tích (diện tích pic) tương đương với dung dịch mẫu thử để tính kết Hàm lượng hoạt chất mẫu thử tính theo cao khô tính theo công thức: ST Cc 10-6 HSPLT Hàm lượng (%) =  x 100 SC mT (1-H%) Trong đó: ST SC: Diện tích pic acid corosolic sắc ký đồ dung dịch mẫu thử mẫu chuẩn Cc : Nồng độ acid corosolic dung dịch chuẩn (µg/ml) mT: Khối lượng mẫu thử (g) HSPLT: Hệ số pha loãng dung dịch thử H: Độ ẩm mẫu thử Kết trình bày Bảng 3.5 35 Bảng 3.5 Hàm lượng acid corosolic mẫu cao Bằng lăng nước STT Mẫu thử Độ ẩm Khối Diện tích Hàm lượng acid (%) lượng pic corosolic tính theo (g) (mAU.s) cao khô (%) BLN M02 2,10 0,10501 452,65 1,41(a) BLN 01-16 (1) 4,07 0,10490 587,89 1,78(a) BLN 01-16 (2) 4,81 0,10380 494,73 1,61(a) BLNL Mẻ 39 6,25 0,20387 866,54 1,43(b) Chuẩn acid corosolic: (a) kết tính theo nồng độ: 50 µg/ml, diện tích pic: 389,73 mAU.s (b) kết tính theo nồng độ: 100 µg/ml, diện tích pic: 794,22 mAU.s Như vậy, hàm lượng acid corosolic mẫu cao Bằng lăng nước định lượng cho kết từ 1,41-1,78% 3.4 BÀN LUẬN Về lựa chọn phương pháp phân tích Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp phân tích đại định tính, định lượng, phân tích nhiều hợp chất khác hỗn hợp mà không cần phân tách trước Phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, độ độ xác cao nên sử dụng nhiều phòng thí nghiệm Tác giả Katta Vijaykumar [21] sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) định lượng acid corosolic cao Bằng lăng nước Phương pháp có ưu điểm tiến hành đơn giản, không cần quan tâm đến ảnh hưởng mẫu, trình tiến hành chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố xác thể tích chấm sắc ký, cách chấm, thiết bị hay chương trình xử lý số liệu, yếu tố làm ảnh hưởng đến kết phân tích So với HPTLC, phương 36 pháp HPLC có hiệu tách cao hơn, phân tích xác hơn, thường quy phòng thí nghiệm, góp phần tiêu chuẩn hóa cao dược liệu phục vụ sản xuất Về lựa chọn xử lý mẫu Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu dựa vào độ tan hoạt chất dung môi thông thường Acid corosolic triterpenoid, dễ tan methanol [24] lựa chọn methanol để chiết hoạt chất cao phương pháp siêu âm Phương pháp siêu âm phương pháp thường dùng để chiết hoạt chất từ dược liệu, phương pháp làm tăng mạnh tính thẩm thấu, khuếch tán nhờ tác dụng sóng siêu âm: tăng diện tích tiếp xúc hai pha cách phân tán chúng thành hạt nhỏ, tăng cường xáo trộn hỗn hợp Từ kết nghiên cứu cho thấy thời gian chiết mẫu ảnh hưởng đến đáp ứng phân tích hoạt chất chiết Cụ thể chiết mẫu thời gian 15, 30, 60 phút đáp ứng phân tích tăng, tăng thời gian chiết lên 70 phút đáp ứng phân tích thay đổi không đáng kể Sắc ký đồ dịch chiết mẫu thử 60 phút cho pic chất phân tích gọn, cân đối, thời gian lưu phù hợp Tăng thời gian chiết hàm lượng hoạt chất tăng không đáng kể, mặt khác làm tăng khả hòa tan tạp, ảnh hưởng đến kết phân tích Về điều kiện sắc ký Sắc ký lỏng pha đảo sử dụng rộng rãi khả tách phân tích nhiều hợp chất có độ phân cực đa dạng, từ phân cực đến phân cực không phân cực Pha tĩnh không phân cực với cột (C18) loại pha tĩnh có hiệu tách tốt, sử dụng phổ biến Nhiệt độ cột ảnh hưởng đến khả phân tích ảnh hưởng đến rửa giải hoạt chất Khi tăng nhiệt độ, độ nhớt dung môi pha động giảm, chất phân tích rửa giải nhanh Khảo sát nhiệt độ cột 30°C cho thời gian lưu chất phân tích (14,733 phút) giảm khoảng phút so với nhiệt độ phòng (19,571 phút), lựa chọn nhiệt độ cột 30°C làm giảm đáng kể thời gian lưu chất phân tích Nhiệt độ cột tương đồng với nghiên cứu tác giả Trần Thị Hằng [7] 37 Với điều kiện sắc ký lựa chọn, thời gian lưu chất phân tích sắc ký đồ 14,70 – 14,74 phút (giảm khoảng 1⁄5 so với nghiên cứu tác giả Trần Thị Hằng [7] (tR = 19,10 – 19,30 phút) nghiên cứu tác giả W Zong [28] (tR = 19,05 phút)), pic chất phân tích gọn, cân đối, tách khỏi mẫu, đạt độ phân giải đường Thẩm định phương pháp Các phương pháp định lượng acid corosolic lá, cao Bằng lăng nước nước chủ yếu dùng phương pháp HPLC với detector UV-VIS Tác giả Trần Thị Hằng [7] nghiên cứu định tính, định lượng acid corosolic Bằng lăng nước HPLC chưa thẩm định phương pháp chưa đạt độ phân giải đường Trong nghiên cứu này, thẩm định phương pháp phân tích với tiêu: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ Kết cho thấy phương pháp đạt độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính có hệ số tương quan chặt chẽ nồng độ hoạt chất đáp ứng phân tích (diện tích pic sắc ký) (r = 0,9998) tương tự nghiên cứu Neeshad P Joshi [24] W Zong [28], tốt nghiên cứu tác giả Trần Thị Hằng [7] (r = 0,9959) Độ tính toán dựa vào phần trăm tìm lại chuẩn, kết thu có RSD: 97,5-101,8% đạt yêu cầu theo AOAC, phù hợp với nghiên cứu Katta Vijaykumar [21] (RSD: 95,98-100,16%) Độ lặp lại phương pháp diễn tả độ xác quy trình phân tích điều kiện thí nghiệm khoảng thời gian ngắn Kết độ lặp lại phương pháp phù hợp với tiêu chuẩn AOAC (RSD = 0,94% < 2,7%) Ứng dụng phương pháp Hàm lượng hoạt chất cao BLN: 1,41-2,34% tính theo cao khô Phương pháp tiến hành nhanh, đơn giản, tổng thời gian phân tích xử lý mẫu khoảng đáp ứng nhu cầu phục vụ sản xuất KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu thu số kết sau: Đã xây dựng phương pháp định lượng acid corosolic cao BLN sắc ký lỏng hiệu cao Mẫu thử cao Bằng lăng nước chiết với methanol siêu âm 60 phút, dịch chiết ly tâm tiến hành sắc ký với cột pha đảo Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6 mm, 5μm), nhiệt độ cột 30°C, pha động: acetonitril: dung dịch H3PO4 0,1% 90:10 (tt/tt) Tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 μl, detector PDA bước sóng 210 nm Định tính acid corosolic mẫu thử vào thời gian lưu dung dịch mẫu thử trùng với thời gian lưu tương ứng với dung dịch mẫu chuẩn Xác định hàm lượng acid corosolic mẫu thử dựa vào đáp ứng phân tích mẫu thử, mẫu chuẩn, nồng độ dung dịch chuẩn, khối lượng độ pha loãng mẫu thử Đã thẩm định phương pháp phân tích acid corosolic cao Bằng lăng nước theo hướng dẫn AOAC 2012 Kết thu cho thấy tiêu thẩm định: độ chọn lọc đảm bảo, độ tuyến tính có tương quan chặt chẽ diện tích pic với nồng độ khoảng 50 - 400 μg/ml (r = 0,9998), độ lặp lại tốt (RSD = 0,936%), độ từ 97,5 - 101,8% nằm khoảng giới hạn 97 - 103% hàm lượng mẫu ≥ 1% < 10% theo AOAC Đã áp dụng phương pháp để định lượng acid corosolic mẫu cao nghiên cứu Dựa vào phương pháp chuẩn ngoại điểm xác định hàm lượng acid corosolic cao BLN từ 1,4 - 2,34% tính theo cao khô Phương pháp tiến hành nhanh, đơn giản với tổng thời gian xử lý mẫu phân tích khoảng giờ, đáp ứng yêu cầu phục vụ sản xuất ĐỀ XUẤT Ứng dụng phương pháp phân tích acid corosolic xây dựng, định lượng acid corosolic mẫu cao phục vụ sản xuất làm sở để xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Bằng lăng nước TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An cộng (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, tr 84-111 Bộ Y Tế (2011), Hướng dẫn chẩn đoán điều trị bệnh đái tháo đường týp Bộ Y Tế (2010), Dược điển Việt Nam IV Bộ Y Tế (2007), Hóa phân tích NXB Y Học, Hà Nội Võ Văn Chi (1996), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr 76 Võ Văn Chi, Trần Hợp (2002), Cây cỏ có ích Việt Nam, NXB Giáo dục, Hà Nội, tr 1025-1026 Trần Thị Hằng (2015), Nghiên cứu định tính, định lượng acid corosolic số mẫu thuộc chi Lagerstroemia Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ, Đại Học Dược Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh, tr 29 Phùng Thanh Hương (2010), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết ảnh hưởng chuyển hóa dịch chiết Bằng lăng nước (Langerstroemia speciosa (L.) Pers.) Việt Nam, Luận án tiến sỹ dược học, Đại Học Dược Hà Nội 10 Phùng Thanh Hương, Nguyễn Thị Thu Hiền (2009), "Tác dụng dịch chiết Bằng lăng nước (Lagerstroemia Speciosa (L.) Pers.) chuột cống đái tháo đường typ 2", Tạp chí khoa học, (401) 11 Phùng Thanh Hương, Nguyễn Xuân Thắng (2009), "Phân lập acid corosolic vad acid ursolic từ Bằng lăng nước (Langerstroemia speciosa (L.) Pers.) thu hái Tây Ninh", tr 32- 36 12 Nguyễn Thị Quế Mai (2015), Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin cordycepin chế phấm chứa đông trùng hạ thảo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, Luận văn thạc sỹ dược học, Đại Học Dược Hà Nội 13 Nguyễn Quyết Tiến, Phạm Thị Hồng Minh (2011), "Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) Việt Nam" Tiếng Anh 14 Bokyung Sung Yong Jung Kang, Dong Hwan Kim, Seong Yeon Hwang, Yujin Lee, Minjeong Kim, Jeong Hyun Yoon, Cheol Min Kim, Hae Young Chung, Nam Deuk Kim (2014), "Corosolic acid induces apoptotic cell death in HCT116 human colon cancer cells through a caspase-dependent pathway", International Journal of Molecular Medicine, pp 943-949 15 Eric Wei Chiang Chan Lea Ngar Tan, Siu Kuin Wong (2014), "Phytochemistry and Pharmacology of Lagerstroemia speciosa: A Natural Remedy for Diabetes ", International Journal of Herbal Medicine, 2(2), pp 100-105 16 Guy Klein Jaekyung Kim, Klaus Himmeldirk, Yanyan Cao, Xiaozhuo Chen, (2007), "Antidiabetes and Anti-obesity Activity of Lagerstroemia speciosa", Evid Based Complement Alternat Med, 4(4), pp 401-407 17 Hou W1 Li Y, Zhang Q, Wei X, Peng A, Chen L, Wei Y (2009), "Triterpene acids isolated from Lagerstroemia speciosa leaves as alpha-glucosidase inhibitors", Phytother Research, 23(5), p 2661 18 Huang GH Zhan Q, Li JL, Chen C, Huang DD, Chen WS et al (2013), "Chemical constituents from leaves of Lagerstroemia speciosa L", Biochemical Systematics and Ecology, 51, pp 109-112 19 International AOAC (2012), AOAC official methods of analysis Appendix K: Guidelines for dietary supplements and botanicals, Part 1: AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals 2012 20 Kakuda T., Sakane I (1996), "Hypoglycemic effect of extracts from Lagerstroemia speciosa L leaves in genetically diabetic KK-AY mice", Biosci Biotechnol Biochem, 60(2), pp 204-208 21 Katta Vijaykumar Papolu B Murthy, Sukala Kannababu, B Syamasundar, Gottumukkala V Subbaraju, (2007), "Quantitative determination of corosolic acid in Lagerstroemia speciosa leaves, extracts and dosage forms ", International Journal of Applied Science and Engineering 4(2), pp 103-114 22 Miura T., Ueda N (2006), "Antidiabetic effects of corosolic acid in KK-Ay diabetic mice", Biol Pharm Bull, 29(3), pp 585-587 23 Neeshad P Joshi Vas V Vaidya, Siddeshwar V Patankar, Maharudra B Kenkare (2013), "A rapid bioanalytical method for simultaneous determination of coroslic acid and asiatic acid in human plasma by soild phase extraction and direct injection into liquid Chromatrography mass spectrometry ", International Journal of Bioassays, 02 (12), pp 1585-1591 24 Neeshad P Joshi Vikas V Vaidya, Sachin S Pawar, Jaydeep N Gadgil (2013), "Development and validation of hplc method for simultaneous determination of bio-active markers corosolic acid, asiatic acid and βsitosterol from leaves of Lagerstroemia speciosa linn and from marketed formulation ", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5(4), pp 223-226 25 Shi L., Zhang W., et al (2008), "Corosolic acid stimulates glucose uptake via enhancing insulin receptor phosphorylation", Eur J Pharmacol, 584(1), pp 21-29 26 Sidney J.stohs Howard Miller, Gilbert R kaats (2012), "A review of the efficacy and safety of Banaba (Lagerstroemia speciosa L.) and corosolic acid", Phytotherapy research, 26(3), pp 3664 27 Unno T Sakane I, Masumizu T, KohnoM, Kakuda T (1997), "Antioxidant activity of water extracts of Lagerstroemia speciosa leaves", Biosci Biotechnol Biochem, pp 1772–1774 28 W Zong W Xia, B Cui (2007), "Determination of corosolic acid and maslinic acids in Lagerstroemia speciosa leaves by TLC/HPLC method", Pharmaceutical Chemistry Journal, 41(4), pp 43-45 29 World Health Organization (2016), Global report on diabetes 30 Yamada K "Dietary corosolic acid ameliorates obesity and hepatic steatosis in KK-Ay mice", Biological Pharmaceutical Bulletin, 31(4), pp 651-655 [...]...2 cao dược liệu phục vụ sản xuất chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu định lượng acid corosolic trong cao Bằng lăng nước với 2 mục tiêu sau: 1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid corosolic trong cao Bằng lăng nước 2 Ứng dụng phương pháp mới xây dựng, định lượng acid corosolic trong một số mẫu cao Bằng lăng nước 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY BẰNG LĂNG NƯỚC... 1 TỔNG QUAN 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY BẰNG LĂNG NƯỚC VÀ ACID COROSOLIC 1.1.1 Cây Bằng lăng nước 1.1.1.1 Đặc điểm của cây Bằng lăng nước Bằng lăng nước (BLN) tên khoa học là Lagerstroemia speciosa (L.) Pers., là một trong số 50 loài thuộc chi Tử vi (Lagerstroemia), họ Lythroideae Bằng lăng nước là cây lá rụng, thân gỗ, kích thước trung bình, cao khoảng 5-20 m, mọc nhiều ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt... pháp định lượng acid corosolic Neeshad P Joshi và cộng sự [23] sử dụng sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS) để định lượng acid corosolic trong huyết tương người Điều kiện phân tích là cột Kromasil C18, rửa giải isocratic Kết quả thu được: khoảng tuyến tính của acid corosolic: 5-1000 ng/mL, độ chính xác 85-115% Tổng thời gian rửa giải khoảng 5 phút 9 Nghiên cứu của tác giả Trần Thị Hằng [7] sử dụng HPLC nghiên. .. acid oleanolic, acid arjunolic, acid asiatic, acid maslinic, acid corosolic và acid 2, 3-hydroxy ursolic [17] Ở Việt Nam, Phùng Thanh Hương và cộng sự đã phân lập được 2 acid là acid corosolic và acid urosolic từ phân đoạn n- hexan của dịch chiết methanol (MeOH) lá BLN [11] Công thức phân tử của một vài triterpen như sau: 5 Triterpen R1 = H, R2 = H (acid ursolic) R1 = OH, R2 = H (acid corosolic) R1 =... tiến hành bằng phương pháp thêm chuẩn, thêm một lượng chính xác chất chuẩn thích hợp vào trong mẫu thử sao cho tổng hàm lượng chất phân tích trong dung dịch nằm trong khoảng tuyến tính Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Dựa vào hàm lượng corosolic đã biết trong mẫu thử, lượng chất chuẩn thêm vào và diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn và dung dịch thử thêm chuẩn, tính được lượng acid corosolic. .. Đối với cao khô có thể sử dụng các bột trơ thích hợp để điều chỉnh nồng độ hoạt chất đến tỷ lệ quy định 1.3.3 Yêu cầu chất lượng Cao thuốc phải đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và đạt các yêu cầu chung sau đây: - Độ tan: cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi được sử dụng để điều chế cao - Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong chuyên... được vào trong dịch chiết đầu đậm đặc và nếu cần, thêm dung môi vào để thu được cao lỏng đạt tỷ lệ quy định Cao lỏng có khuynh hướng bị lắng cặn vì vậy để cao lỏng ở chỗ mát trong thời gian ít nhất 3 ngày, rồi lọc Cao đặc và cao khô: dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại không quá 20% Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy khô để độ ẩm còn lại không quá 5% Để đạt đến thể chất quy định, ... được dùng trong Y học Đến nay hơn 40 hợp chất bao gồm triterpen, tannin, acid ellagic, glycosid và flavon đã xác định từ lá của L speciosa [15] Trong đó có 4 triterpen (acid ursolic, acid corosolic, acid asiatic và acid alphitolic), 8 acid ellagic, 1 coumarin và 1 neolignan [18] + Triterpenoid: Năm 2009, Hou W và cộng sự đã phân lập 6 triterpenoid từ dịch chiết ethylacetat (EtOAc) của lá BLN: acid oleanolic,... với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn hợp cồn - nước thì phải xác định dư lượng dung môi sử dụng và đáp ứng yêu cầu qui định trong Dược điển - Giới hạn nhiễm khuẩn: đáp ứng yêu cầu qui định về tổng số vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn gây bệnh và nấm men, nấm mốc - Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: đáp ứng yêu cầu quy định 17 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT... nghiên cứu định lượng acid corosolic trong lá một số mẫu thuộc chi Lagerstroemia ở Việt Nam với điều kiện sắc ký: cột RP 18 (240 x 4 mm, 5μm), pha động là acetonitril : acid formic 0,1% (80:20, tt/tt), detector UV bước sóng 205 nm Kết quả thu được: thời gian xuất hiện chất phân tích từ 19,1-19,3 phút, độ tuyến tính có hệ số tương quan là 0,9959 W Zong và cộng sự [28] sử dụng HPLC để định lượng acid corosolic