BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  MEAS PUTHEKA Mã sinh viên: 1101413 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID SHIKIMIC TRONG ĐẠI HỒI BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KẾT HỢP ĐO MẬT ĐỘ QUANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MEAS PUTHEKA Mã sinh viên: 1101413 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID SHIKIMIC TRONG ĐẠI HỒI BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KẾT HỢP ĐO MẬT ĐỘ QUANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hân ThS Ngô Quang Trung Nơi thực hiện: Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc gia Bộ Môn Công Nghiệp Dược Trường Đại Học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN ! Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Hân, ThS Ngô Quang Trung, DS Trần Trọng Biên người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tính giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Và em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo trường Đại Học Dược Hà Nội, người dạy dỗ bảo em tận tình suốt tháng năm học tập trường Cuối cùng, với long biết ơn vô hạn, em xin phép gửi lời cảm ơn tới giá đình, người thân, bạn bè động viên hỗ trợ em suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên: Meas Putheka MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hồi Vị trí phân loại phân bố Đặc điểm thực vật Bộ phận dùng, thu hái chế biến Thành phần hóa học công dụng 1.2 Tổng quan acid shikimic Công thức hóa học tính chất Nguồn gốc acid shikimic Vai trò acid shikimic Kỹ thuật phân tích acid shikimic Một số nghiên cứu định lượng acid shikimic TLC-scanning 1.3 Tổng quan sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning) Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning) 12 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu 14 2.1.1 Nguyên liệu 14 2.1.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng 16 2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng 18 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Khảo sát điều kiện triển khai sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Sanning) 22 3.1.1 Khảo sát phương pháp màu mỏng 22 3.1.2 Khảo sát nồng độ thuốc thử màu 23 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning) 25 3.2.1 Độ đặc hiệu 25 3.2.2 Độ thích hợp hệ thống 26 3.2.3 Độ tuyến tính 27 3.2.4 Độ lặp lại 28 3.2.5 Độ 28 3.3 Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang định lượng acid shikimic mẫu Đại hồi 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 Kết luận: 32 Đề nghị: 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Vị trí phân loại hồi (Illicium verum Hook f.) Bảng 1.2: Một số thuốc thử màu acid shikimic Bảng 2.1: Hóa chất…….…………………………………………………… 14 Bảng 3.1: Kết khảo sát độ thích hợp hệ thống 27 Bảng 3.2: Nồng độ acid shikimic chuẩn diện tích pic đáp ứng 27 Bảng 3.3: Kết khảo sát độ lặp lại 28 Bảng 3.4: Kết khảo sát độ 28 Bảng 3.5: Kết định lượng acid shikimic nguyên liệu Đại hồi 30 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Công thức hóa học acid shikimic Hình 2.1: Nguyên liệu Đại hồi 14 Hình 3.1: Hình ảnh mỏng sau màu cách nhúng phun thuốc thử Hình cách phun, hình cách nhúng 22 Hình 3.2: Hình ảnh mỏng màu thuốc thử KMnO4 nồng độ khác 23 Hình 3.3: Hình ảnh mỏng sau màu thời điểm khác 24 Hình 3.4: Bản mỏng sau màu ……………………………………….25 Hình 3.5:Sắc ký đồ (1.Mẫu chuẩn Mẫu thử) 26 Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích nồng độ acid shikimic 27 Hình 3.7: Bản mỏng xác định LOD………………………………………….29 Hình 3.8: Hình ảnh sắc ký đồ LOD.…………………………………………30 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN HPLC ( High-Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography) GLC ( Gas Liquid Chromatography) Sắc ký khí lỏng NMR (Nuclear Magnetic Resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân RP-HPLC (Reversed-Phase High- Sắc ký lỏng hiệu cao Performance Liquid Chromatography) pha đảo GC (Gas Chromatography) Sắc ký khí GC-MS (Gas Chromatography–Mass Sắc ký khí khối phổ Spectrometry) SIM (Selected Ion Monitoring) Giám sát ion chọn lọc HPTLC (High-Performance Thin Layer Sắc ký lớp mỏng hiệu Chromatography) cao TLC (Thin Layer Chromatography ) Sắc ký lớp mỏng TLC-Scanning (Thin Layer Chromatography- Sắc ký lớp mỏng kết hợp Scanning) đo mật độ quang LOD (Limit of Detection) Giới hạn phát LOQ (Limit of Quantitation) Giới hạn định lượng Rf (Retention Fector) Hệ số lưu giữ RSD (Relative Standard Deviation) Độ lệch chuẩn µL Micrlit µm Micromet ĐẶT VẤN ĐỀ Acid shikimic từ lâu biết đến hợp chất trung gian quan trọng trình sinh tổng hợp số acid amin thơm phenylalanin, tyrosin, tryptophan; số hợp chất alcaloid Acid shikimic phân lập từ vi khuẩn E coli hay từ số loài thực vật Trong năm gần đây, acid shikimic biết đến với vai trò quan trọng mới, nguyên liệu dùng để tổng hợp Oseltamivir – hoạt chất Tamiflu, thuốc có tác dụng điều trị bệnh cúm gia cầm H5N1 Hiện nay, acid shikimic dùng để tổng hợp Tamiflu chiết xuất chủ yếu từ Hồi - nguồn cung cấp nguyên liệu chủ yếu cho sản xuất thuốc phòng chống cúm gia cầm Có số nhà khoa học thực nghiên cứu định lượng acid shikimic loài thực vật Hồi phương pháp khác Vì tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng acid Shikimic Đại Hồi sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning )” nhằm đánh giá chất lượng phương pháp định lượng acid shikimic dược liệu có chứa acid shikimic Đề tài bao gồm nội dung sau: Khảo sát xây dựng phương pháp định lượng acid shikimic Đại Hồi sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLCScanning) Thẩm định phương pháp định lượng acid shikimic sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning) CHƯƠNG : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan hồi Vị trí phân loại phân bố Theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan, hồi (Illicium verum Hook f.) có vị trí phân loại khoa học thể bảng [3] Bảng 1.1: Vị trí phân loại hồi (Illicium verum Hook f.) Chi Hồi (Illicium) có khoảng 40 loài, phân bố chủ yếu Đông Nam Á, Đông Á Bắc Mỹ Giới Thực vật - Plantae Không phân hạng Nhóm thực vật có hoa - Angiospermae Bộ Mộc lan dây - Austrobaileyales Họ Hồi - Illiciaceae Chi Hồi - Illicium Loài I verum Ở Việt Nam chi Hồi có 16 loài [9] Cây hồi (Illicium verum Hook f.) loại xanh quanh năm, phần lớn Trung Quốc Đông Bắc Việt Nam Nó có tên gọi khác đại hồi, bát giác hồi hương, hồi hương, hồi sao, mác chác, mác hồi (Tày), pít cóc (Dao),….[4] Đặc điểm thực vật Cây gỗ nhỏ, cao - 8m, đến 10m hay Cành thẳng, nhẵn, lúc non màu lục nhạt, sau chuyển sang màu nâu xám Lá mọc so le, thường tụ tập mấu trông mọc vòng, hình mác hình trứng thuôn, dài 8-12cm, rộng 3-4cm, đầu nhọn, mặt màu lục sẫm, mặt nhạt, gân mờ, cuống ngắn [3], [4], [5] 23 Nhận xét: Khi màu mỏng theo cách 1, vết acid shikimic không màu trình phun không Ngược lại, màu mỏng theo cách cho vết acid shikimic tròn, gọn, màu vàng Do lựa chọn màu mỏng cách nhúng mỏng vào dung dịch thuốc thử màu 3.1.2 Khảo sát nồng độ thuốc thử màu Nồng độ thuốc thử màu yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tính xác phương pháp TLC-Scanning Tiến hành màu mỏng dung dịch KMnO4 0,25 %, 0,5 % % So sánh màu sắc, hình dạng vết acid shikimic mỏng Kết thể hình 3.2 KMnO41 % KMnO40.5 % KMnO4 0.25% Hình 3.2 Hình ảnh mỏng với thuốc thử KMnO4 nồng độ khác Nhận xét: Dung dịch KMnO4 0,5 % cho hình ảnh vết acid shikimic tròn đẹp, rõ nét Do nồng độ thuốc thử màu KMnO4 lựa chọn 0,5 % 24 3.1.3 Khảo sát giới hạn thời gian phân tích sau màu mỏng Sản phẩm oxy hóa acid shikimic KMnO4 không bền màu nhanh Do đó, thí nghiệm thực nhằm tìm giới hạn thời gian phân tích thích hợp sau màu mỏng Thực hiện: Bản mỏng sau màu thuốc thử KMnO4 0,5 % để tự nhiên điều kiện phòng phân tích Quan sát màu sắc vết acid shikimic mỏng sau khoảng thời gian khác Kết thể hình 3.3 Hình 3.3 Hình ảnh mỏng sau màu thời điểm khác Ngay sau màu phút sau màu Nhận xét: Hình ảnh mỏng cho thấy, vết acid shikimic nhạt màu nhanh theo thời gian Chỉ phút sau màu, vết sắc ký không rõ nét, 25 màu sắc loang lổ Do đó, để hạn chế sai số đo mật độ quang vết sắc ký, cần tiến hành chụp ảnh mỏng sau màu thuốc thử KMnO4 Kết luận: Sau khảo sát lựa chọn điều kiện TLCScanning sau: - Phương pháp màu mỏng: Nhúng mỏng vào dung dịch thuốc thử màu - Thuốc thử màu: Dung dịch KMnO4 0,5 % nước - Giới hạn thời gian phân tích sau màu: Cần chụp ảnh mỏng sau màu 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning) 3.2.1 Độ đặc hiệu Triển khai sắc ký mẫu trắng, thử chuẩn thu kết sau: Hình 3.4 Bản mỏng sau màu (1 Mẫu trắng, Mẫu chuẩn, Mẫu thử) 26 (2) Hình 3.5 Hình ảnh sắc ký đồ (1:Mẫu chuẩn, 2: Mẫu thử) - Sắc ký đồ mẫu thử cho vết acid shikimic có hình dạng, màu sắc với vết acid shikimic sắc ký đồ mẫu chuẩn - Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất vết tương ứng với vết acid shikimic sắc ký đồ mẫu chuẩn - Sắc ký đồ mẫu chuẩn cho vết acid shikimic có Rf = 0,65 sắc ký đồ mẫu thử cho vết acid shikimic có Rf = 0,62 Giá trị RSD trị số Rf 3,34% 0,9, nhận thấy khoảng nồng độ khảo sát có tương quan tuyến tính nồng độ acid shikimic diện tích pic sắc ký 3.2.4 Độ lặp lại Chấm lặp lại lần mẫu thử acid shikimic chuẩn bị mục 2.3.1 thu kết giá trị Rf diện tích pic đáp ứng bảng 3.3 Bảng 3.3: Kết khảo sát độ lặp lại Lần Lần Lần Lần RSD (%) Lần Lần TB Diện 5552,4 5657,8 5394,1 5104,71 5867,5 tích pic 5419,3 5499,29 4,72 6346 0,6057 3,33 Rf 0,625 0,6058 0,5865 0,5865 0,5962 Nhận xét: Giá trị RSD Rf 3,33% < 5% diện tích pic 4,72% < 10% cho thấy phương pháp xây dựng đạt yêu cầu lặp lại 3.2.5 Độ Đường chuẩn để tính toán độ là: y=296,42x + 1050,7 (r2=0,9957) Tiến hành theo mục 2.3.2 Từ thông số diện tích pic đo được, tính toán hàm lượng acid shikimic mẫu sau thêm chuẩn sau: Bảng 3.4: Kết khảo sát độ STT Đã có (mg) Thêm chuẩn (mg) 70 14,1 14,5 14,1 Diện tích pic Tổng lượng thu lại (mg) Tỷ lệ thu hồi (%) 6103,7 85,2338 108,04 6023,9 83,8877 95,777 5956,2 82,7458 90,396 RSD (%) Tỷ lệ thu hồi trung bình (%) 9,22 98,07 29 35,5 7344,3 106,16 101,86 35,4 7173,4 103,277 94,004 35,2 7391,6 106,958 104,99 RSD trung bình (%) Tỷ lệ thu hồi trung bình chung 5,65 100,29 7,43 99,18 Nhận xét: Kết độ thu hồi acid shikimic cao đạt 99,18% Giá trị RSD trung bình độ 7,43%, nằm giới hạn cho phép phân tích dược liệu 3.2.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Thực theo mô tả mục 2.3.2 Mẫu thử có nồng độ xác định 14 mg/ml (tính theo đường chuẩn) Tiến hành pha loãng mẫu thử với EtOH 96o dung dịch thử có nồng độ mg/ml, 3,5 mg/ml, 1,75 mg/ml, 0,875 mg/ml Triển khai TLC-Scanning với dung dịch mẫu thử đến không phát acid shikimic sắc ký đồ Nhân xét: Khi pha loãng tới nồng độ 0,875 mg/ml không phát pic sắc ký đồ Mẫu thử nồng độ 1,75 mg/ml phát pic sắc ký đồ với cường độ tín hiệu lớn lần so với độ nhiễu đường nên lấy 1,75 mg/ml giá trị LOD 5mg/ml LOQ (thực tế điều kiện khảo sát chưa đầy đủ nên chưa khảo sát nồng độ 1,5 mg/ml nhiên pic acid shikimic nồng độ 1,75 mg/ml so với có độ lớn xấp xỉ 4-5 lần) Hình 3.7 Bản mỏng xác định LOD 30 3.3 Hình 3.8 Hình ảnh sắc ký đồ LOD Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang định lượng acid shikimic mẫu Đại hồi Áp dụng quy trình xây dựng để định lượng acid shikimic mẫu nguyên liệu Đại hồi Hàm lượng acid shikimic A(%) mẫu nguyên liệu tính theo công thức : A (%) = 𝑪×𝟐𝟓×𝑽×𝟏𝟎𝟎 𝒎×𝟏𝟎𝟎𝟎 Trong đó: A: Hàm lượng acid shikimic đại hồi (%) C: Nồng độ acid shikimic dung dịch thử tính theo phương trình hồi quy (mg/ml) V: Hệ số pha loãng dung dịch thử m: khối lượng Đại hồi đem chiết (g) Kết thu sau: Bảng 3.5 Kết định lượng acid shikimic nguyên liệu Đại hồi Hàm lượng Khối lượng STT dược liệu Diện tích pic Đường chuẩn (g) Lần 5,01 Acid shikimic (%) 4786,43 y=269,29x+857,95 7,29 31 (r2=0,9957) Lần 5,02 4998,911 Lần 5,05 5875,455 Trung bình y=229,19x+1732,9 (r2=0,9974) y=369,11x+940,32 (r2=0,9923) 7,12 6,68 7,03 Nhân xét: Kết đối chiếu định lượng acid shikimic từ mẫu nguyên liệu Đại hồi phương pháp HPLC 6,3 % (RSD = 7,74%) [15] Kết cho thấy phù hợp với kết định lượng TLC – Scanning xây dựng 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận: Sau thời gian thực hiện, đề tài đạt mục tiêu đề ra: Đã xây dựng phương pháp định lượng acid shikimic Đại hồi phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC – Scanning) Các điều kiện cụ thể: - Bản mỏng: mỏng silica gel 60 F254 (Merck), hoạt hóa 110oC 30 phút Kích thước mỏng 10x10 (cm) 10x20 (cm) tùy thí nghiệm cụ thể - Đưa mẫu lên mỏng: Chấm thủ công tay, phương chấm vuông góc với mỏng, thể tích chấm µl Vị trí chấm cách mép mỏng 1,5 cm, cách mép dung môi từ 0,8 – cm Khoảng cách vết mép mỏng 1,5 cm Khoảng cách vết kề cm - Hệ dung môi khai triển: n-BuOH : Acid acetic : nước ( 6:1:2) Bản mỏng triển khai bình thủy tinh ngăn, kích thước 8x12x14 (cm) Thời gian bão hòa pha động: 15 phút - Hiện màu: Sau triển khai sắc ký, mỏng để khô tự nhiên nhiệt độ phòng Sau màu cách nhúng mỏng vào dung dịch KMnO4 0,5% nước - Phát vết: Chụp ảnh mỏng sau màu Đo TLC Scanning, sử dụng ánh sáng trắng Đã thẩm định phương pháp TLC – Scanning tiêu: Độ đặc hiệu: Phương pháp đặc hiệu với định lượng acid shikimic Đại hồi Độ tuyến tính khoảng 5-25 mg/ml, hệ số tương quan r2=0,9988 Độ thích hợp hệ thống: RSD = 2,86% Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi trung bình đạt 99,18% Độ lặp lại: RSD =4,72% 33 Giới hạn phát giới hạn định lượng là: 1,75 mg/ml Đề nghị: Trên sở kết đạt được, đề tài xin đưa số đề nghị sau: - Thẩm định phương pháp TLC-Scanning xây dựng nhiều tiêu nữa: Độ lặp lại ngày, độ lặp lại khác ngày, độ ổn định mẫu, khảo sát lại LOD, LOQ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: Trần Tử An(2010), “Kiểm nghiệm dược phẩm”, NXB Y học, Hà Nội Trần Tử An(2007), “Hóa phân tích-tập 2” , NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Tiến Bân (1997), “Cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật hạt kín Việt Nam”, Nxb Nông nghiệp, tr Đỗ huy Bích, Nguyễn Thượng Dong cs (2004), “Cấy thuốc động vật làm thuốc Việt Nam”, Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tâp I, tr 986-990 Đỗ huy Bích, Nguyễn Thượng Dong cs (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr.534-535 Bộ Y tế (2007), Dược liệu học Nxb.Y học,tâp II,tr.234 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr.748-749 Bộ Y Tế (2009), Hướng dẫn Asean thẩm định quy trình phân tích –phụ lục 7-thông tư 22/2009/TT-BYT Quy định đăng ký thuốc Nguyễn Thượng Dong, Nguyễn Thị Bích Thu (2010), “Nghiên cứu phát triển hồi làm nguyên liệu sản xuất acid shikimic khai thác tinh dầu”, Đề tài khoa học Công nghệ cấp Bộ y tế, Viện Dược liệu 10.Lê Minh Hà, Ngọ Thị Phương, Nguyễn Văn Dư, Trần Văn Tiến, Nguyễn Công Sỹ, Vũ Đức Thắng, Nguyễn Thị Phương, Bùi Đình Thạch, Nguyễn Văn Minh Khôi, Đỗ Trường Thiện (2014), “ Xây dựng phương pháp định lượng rotundin củ bình vôi tươi sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning)”, Tạp chí Dược Liệu, 6, tr 378-379 11.Nguyễn Văn Hân, Phùng Thị Mỹ Hạnh (2016), “Phân lập acid shikimic từ phế phẩm trình sản xuất tinh dầu đại hồi”, Tạp chí Dược Học, 478, tr 45-47 12.Đặng Văn Hòa, Vĩnh Định (2011), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Giáo dục Việt Nam 35 13.Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 524-525 14.Nguyễn Đình Luyện, Hà Mai Trang (2008), “Nghiên cứu định lượng acid shikimic đại hồi (Illicium verum Hook.f) phương pháp HPLC”, Tạp chí Dược học, 386, tr 28-30 15.Nguyễn Thị Thảo My (2016), “Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng nhựa trao đổi ion phân lập acid shikimic từ Đại hồi”, Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ 2011 - 2016, Trường Đại học Dược Hà Nội 16.Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2012), khóa đào tạo thẩm định quy trình phân tích SKLM HPLC thuốc đông dược TÀI LIỆU TIẾNG ANH: 17.Ajaz Ahmad, M Mujeeb, Bibhu Prash Panda (2010), “An HPTLC Method for Simultaneous Analysis of Compactin in Penicillium citrinum Fermentation Broth”, Journal pf planar Chromatographymodern TLC, 23(4), pp 282-285 18.Amalia M Estévez and Ramón J Estévez (2012), “ A Short Overview on the Medicinal Chemistry of ( -)-Shikimic Acid”, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 12, pp 1443-1454 19.Ambhaikar N (2005), Shikimic acid, The Baran laboratory Group Meeting, The Scripps Research Institute 20.Berezkin V (1995), “The discovery of thin layer chromatography”, J PlanarChro-matogr,-Mod, TLC 8, pp 401-405 21.Bernard Fried, Joseph Sherma (2007),Thin-Layer Chromatography pp 22.Camag laboratory (2009), General methodology for HPTLC, version 23.Denis V Bochkov et al (2012),”Shikimic acid: review of its analytical, isolation, and purification techniques from plant and microbial sources”, J Chem Biol., 5(1),pp 5-17 36 24.Eike Reich, Anne Schilbili (2007), “ High-Performance ThinLayer Chromatography for the Analysis of Medicinal Plants”, Thieme Medical Publisher, Inc, US ISBN 1-58890-409-1 25.Merk & Co., Inc (2001), The Merk Index 13th edition, phương pháp 1457-1458 26.Mokina Wasmundzka-Hajino, Joseph Sherma, Teres Kowalska (2008), Thin Layer Chromatography in Phytochemistry 27.Ohira H., Torii N., Aida M T., Watanabe M., Smith L R (2009), “Rapid separation of shikimic acid from Chinese star anise (Illicium verum Hook f.) with hot water extraction”, Separation and Purification Tech., 69, pp 102-108 28.Payne R., Edmonds M (2005), “Isolation of Shikimic Acid from Star Aniseed”, J Chem Edu., 82(4), pp 599-600 29.S A Borman (1982), “ HPTLC: taking of”, Anal Chem, 54, pp 790A794A 30.Sakaguchi I et al (2004), “The water soluble extract of Illicium anisatum stimulas mouse vibrissae follicles in organs culture”, Exp Dermatol, 13(8), pp 449-504 31.Saraswathy Ariamuthu et al (2013), “Estimation of Shikimic acid from fruits of Illicium griffithii Hook.f & Thoms and Illicium verum Hook.f.”, International Journal of Advances in Pharmaceutical Research Vol /Issue / 1418 – 1425 32.Shingh G., Jiang S (1998), “Chemical synthesis of shikimic acid and its analogues”, Tetrahedron,54, pp 4697-4753 33.Shyluk J P et Al (1967), “Gas chromatography of the trimethylsilyl derivatives shikimic acid and biochemically related compounds”, j Chroma, 26, pp 268 37 34.Stavic B., Stoltz D R (1976), “Shikimic acid”, Food Cosmet Toxicol., 14(2), pp 141-145 [...]... thiết bị này cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi dưới đèn UV-VIS Chất phân tích hấp phụ bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký [20], [21], [29]  Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng trong phân tích kiểm nghiệm - Phân tích định tính - Thử tính khiết - Bán định lượng - Định lượng [2], [24] 12 Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning) Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning)... ích trong nhân biệt và thẩm định của cả hai loài Illicium Hàm lượng acid shikimic có trong Illicium griffithi và Illicium verum lần lượt là 1,66 %và 5,48% 1.3 Tổng quan về sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning) Sắc ký lớp mỏng Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng đã được xây dựng, phát triển và ứng dụng từ lâu Tuy nhiên hiện nay sắc ký giấy ít được sử dụng Phổ biến nhất hiện nay là sắc ký lớp. .. TLC-Scanning: Phương pháp hiện màu bản mỏng, nồng độ thuốc thử hiện màu và giới hạn thời gian phân tích thích hợp cho phương pháp định lượng - Đánh giá độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp  Ứng dụng phương pháp đã xây dựng đánh giá hàm lượng acid shikimic trong mẫu nguyên liệu quả Đại hồi thu mua được 2.3 Phương pháp. .. Bình định mức 5 ml,10 ml, 25 ml,50 ml  Pipet chính xác 1 ml, 2 ml,5 ml,10 ml  Ống nghiệm thủy tinh 10 ml  Phễu lọc, giấy lọc và màng lọc mẫu cellulose acetat 0,45 µm (Satorius)  Mao quản Camag để chấm sắc ký thể tích 1 µl  Bình chạy sắc ký 16 2.2 Nội dung nghiên cứu  Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid shikimic trong quả Đại hồi bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang. .. dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ acid shikimic của các mẫu chuẩn Xác định nồng độ acid shikimic trong mẫu thử tính theo phương trình hồi quy Từ đó tính hàm lượng acid shikimic trong dược liệu theo công thức sau: A (%) = 𝑪×𝟐𝟓×𝑽×𝟏𝟎𝟎 𝒎×𝟏𝟎𝟎𝟎 Trong đó: A: hàm lượng acid shikimic trong đại hồi (%) C: Nồng độ acid shikimic trong dung dịch thử tính theo phương trình hồi quy (mg/ml)... hydroxycitric