BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN LÊ NHẬT MÃ SINH VIÊN: 1101377 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG LINCOMYCIN VÀ CLINDAMYCIN TRONG NƢỚC THẢI BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN LÊ NHẬT MÃ SINH VIÊN: 1101377 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG LINCOMYCIN VÀ CLINDAMYCIN TRONG NƢỚC THẢI BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: DS Lê Xuân Kỳ DS Trần Thị Linh Anh Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất Bộ môn Vật lý – Hóa lý HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực hiện, khóa luận “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng lincomycin clindamycin nƣớc thải phƣơng pháp LC-MS/MS” đƣợc hoàn thành Bên cạnh cố gắng thân, em nhận đƣợc nhiều khích lệ giúp đỡ từ phía nhà trƣờng, môn, gia đình bạn bè Trƣớc tiên, em xin bày tỏ kính trọng biết ơn sâu sắc tới DS Lê Xuân Kỳ, ngƣời thầy tận tình định hƣớng, bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em suốt trình thực hoàn thành khoá luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới DS Trần Thị Linh Anh, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ em suốt trình nghiên cứu, thực khoá luận Em xin gửi cảm ơn tới thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Hóa phân tích Độc chất, môn Vật lý - Hóa lý trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện cho em nhiều thời gian thực đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè ngƣời động viên, tạo động lực cho em suốt trình học tập thực khóa luận Trong trình thực hiện, nỗ lực cố gắng nhƣng không tránh khỏi thiếu sót sai sót, em mong nhận đƣợc ý kiến bảo, phê bình, góp ý từ phía thầy cô để khoá luận em tiếp tục đƣợc hoàn thiện Em xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Lê Nhật MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1 Tổng quan kháng sinh nhóm lincosamid 1.1.2 Một số đặc điểm lincomycin 1.1.3 Một số đặc điểm clindamycin 1.1.4 Tình trạng đề kháng vi khuẩn với kháng sinh 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 1.2.1 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ 1.2.3 Phƣơng pháp xử lý mẫu kỹ thuật chiết pha rắn 13 1.3 MỘT SỐ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG CLINDAMYCIN VÀ LINCOMYCIN TRÊN THẾ GIỚI 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 ĐỐI TƢỢNG & PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Hoá chất & thuốc thử 19 2.1.2 Thiết bị - dụng cụ 19 2.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Phƣơng pháp thu thập, xử lý mẫu thô trƣớc tiến hành chiết tách 20 2.2.2 Phƣơng pháp xử lý mẫu 20 2.2.3 Phƣơng pháp xây dựng quy trình định lƣợng lincosamid HPLC MS/MS 21 2.2.4 Phƣơng pháp thẩm định quy trình phân tích xây dựng 22 2.3 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 24 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 25 3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 25 3.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 28 3.1.3 Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 33 3.2 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 34 3.2.1 Độ thích hợp hệ thống 34 3.2.2 Độ đặc hiệu, độ chọn lọc phƣơng pháp 35 3.2.3 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn 37 3.2.4 Độ độ độ lặp lại 39 3.2.5 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng 40 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 42 4.1 VỀ LỰA CHỌN KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU 42 4.2 VỀ PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU 42 4.3 VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 43 4.4 VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu AOAC Tiếng Việt Hiệp hội nhà hoá phân tích thống Ion hoá học áp suất khí API Tiếng Anh Association of Official Analytical Chemists Atmospheric Pressure Chemical Ionization Atmospheric Pressure Photoionization Atmospheric Pressure Ionization LIN Lincomycin Lincomycin CLI 13 C3 TRI DAD ESI IS KS HPLC Clindamycin 13 C3Trimethoprim Diode array detector Electrospray Ionizaton Internal standard Clindamycin 13 C3Trimethoprim Detector chuỗi diod Ion hoá phun điện tử Chuẩn nội Kháng sinh Sắc ký lỏng hiệu cao APCI APPI HQC LC MS/MS MS tR Speak MeOH MQC LOD LOQ LQC PA TB TCCS SPE R(%) SD RSD High performance liquid chromatography High quality control Liquid chromatography Tandem Mass Spectrometry Mass Spectrometry Retention time Area under the peak Methanol Middle quality control Limit of Detection Limit of Quantitation Low quality control Pure analysis Solid Phase Extraction Recovery Standard Deviation Relative Standard Deviation Ion hoá photon áp suất khí Ion hoá áp suất khí Kiểm soát mức độ cao Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần Khối phổ Thời gian lƣu Diện tích peak Methanol Kiểm soát mức độ Giới hạn phát Giới hạn định lƣợng Kiểm soát mức độ thấp Tinh khiết phân tích Trung bình Tiêu chuẩn sở Chiết pha rắn Hiệu suất thu hồi Độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn tƣơng đối DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lƣợng kháng sinh lincomycin clindamycin sử dụng LC-MS/MS giới .15 Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng nghiên cứu .19 Bảng 3.1 Các thông số hoạt động nguồn ion hoá 27 Bảng 3.2 Điều kiện phân mảnh kháng sinh chuẩn nội 27 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ thích hợp hệ thống 34 Bảng 3.4 Kết khảo sát khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn .37 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ phƣơng pháp (mức MQC) 39 Bảng 3.6 Kết giá trị LOD, LOQ phƣơng pháp 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Công thức phân tử lincomycin hydroclorid Hình 1.2 Công thức phân tử clindamycin hydroclorid Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống thiết bị khối phổ Hình 1.4 Sơ đồ tạo ion dƣơng nguồn ESI .10 Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba .11 Hình 3.1 Kết khảo sát ion hóa tạo ion mẹ LIN CLI .26 Hình 3.2 Phổ đồ khảo sát ion kháng sinh LIN, CLI 13C3TRI 27 Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn pha động 29 Hình 3.4 Sắc ký đồ phân tích kháng sinh khảo sát thể tích tiêm mẫu 31 Hình 3.5 Sắc ký đồ phân tích kháng sinh khảo sát tốc độ dòng 33 Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu chọn lọc phƣơng pháp 36 Hình 3.7 Đƣờng chuẩn tỉ lệ SKS/SIS với nồng độ dung dịch lincomycin 38 Hình 3.8 Đƣờng chuẩn tỉ lệ SKS/SIS với nồng độ dung dịch clindamycin .38 Hình 3.9 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ phƣơng pháp 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Tình trạng kháng kháng sinh gia tăng nghiêm trọng đe doạ lớn đến sức khoẻ ngƣời toàn giới Các phƣơng pháp điều trị trƣớc không hiệu kháng sinh không hiệu lực, cần vết thƣơng nhỏ bị nhiễm trùng khiến ngƣời bệnh tử vong Việc sử dụng kháng sinh cách ạt, thiếu kiểm soát dẫn tới tình trạng vi khuẩn kháng lại kháng sinh với mức độ ngày trầm trọng Dƣ lƣợng kháng sinh môi trƣờng nguyên nhân tình trạng kháng thuốc Để giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn đồng nghĩa với việc giảm thiểu việc đƣa kháng sinh môi trƣờng, giảm tiếp xúc vi khuẩn với kháng sinh Do vậy, bên cạnh việc kiểm soát sử dụng kháng sinh chặt chẽ, cách, lƣợng kháng sinh thải môi trƣờng từ nƣớc thải y tế công nghiệp dƣợc phẩm cần phải đƣợc kiểm soát hạn chế Trong năm gần Việt Nam, số lƣợng chủng loại kháng sinh đƣợc sản xuất ngày nhiều, nhóm kháng sinh lincosamid nhóm có số lƣợng sản xuất sử dụng tƣơng đối phổ biến Vì trình sản xuất sử dụng nhóm kháng sinh này, cần kiểm soát đƣợc dƣ lƣợng kháng sinh thải môi trƣờng Điều đòi hỏi cần thiết phải xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng có độ tin cậy để làm công cụ đánh giá Xuất phát từ yêu cầu trên, tiến hành lựa chọn đề tài: “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng kháng sinh lincomycin clindamycin nƣớc thải phƣơng pháp LC-MS/MS” Đề tài đƣợc thực với mục tiêu: Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu, điều kiện sắc ký lỏng khối phổ xây dựng quy trình định lượng đồng thời hai kháng sinh lincomycin clindamycin nước thải phương pháp LC-MS/MS Thẩm định quy trình định lượng xây dựng CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1 Tổng quan kháng sinh nhóm lincosamid Kháng sinh nhóm lincosamid bao gồm lincomycin, kháng sinh thiên nhiên phân lập từ môi trƣờng nuôi cấy Streptomyces lincolensis dẫn xuất bán tổng hợp gồm clindamycin pirlimycin Thế hệ kháng sinh lần đƣợc định hình năm 1960 đƣợc sử dụng để điều trị loạt bệnh nhiễm trùng Phổ tác dụng lincosamid chủ yếu vi khuẩn gram dƣơng, nhiên đƣợc sử dụng để chống lại vi khuẩn kỵ khí gram âm sinh vật đơn bào Cơ chế tác dụng lincosamid ngăn chặn sử tổng hợp protein vi sinh vật thông qua liên kết với 23S rRNA tiểu đơn vị 50S bắt chƣớc trung gian đƣợc hình thành giai đoạn đầu chu kỳ kéo dài Các lincosamid thƣờng đƣợc sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn Streptococcus tụ cầu đặc biệt hữu ích việc điều trị nhiễm khuẩn mô liên kết da, xƣơng khả hấp thu tác dụng chống lại chủng sản xuất độc tố hoại tử [25] 1.1.1.1 Cấu trúc nhóm lincosamid Lincomycin có cấu trúc amid, tạo acid 4-n-propyl hygric (acid 1- methyl -4-propyl-2-pyrolidincarboxylic) với đƣờng amin có nhóm -SCH3 (methylthio) Amino acid đóng vòng có tính base, tạo đƣợc muối với acid Clindamycin đƣợc tạo thành thay nhóm OH (7) đƣờng amin lincomycin Cl, kèm theo quay ngƣợc cấu hình C(7), có tính base nhƣ lincomycin [8] 1.1.1.2 Phổ tác dụng Kháng sinh lincosamid nhạy cảm với Clostridium perfringens, Staphylococus aureus nhƣng không nhạy cảm với vi khuẩn ruột Clostriduim difficile, nhạy cảm với chủng vi khuẩn yếm khí nói chung, loại nguồn gốc ruột sinh dục nói riêng, thuận lợi dùng lincosamid điều trị nhiễm khuẩn vùng bụng chậu [7],[8] 1.1.1.3 Sự kháng thuốc vi khuẩn 41 Nhận xét Với clindamycin: phân tích với mẫu có nồng độ 0,1 ng/ml cho đáp ứng S/N = 13,7 xấp xỉ 10 nên xác định LOQ lincomycin khoảng 0,1 ng/ml Với lincomycin: phân tích với mẫu có nồng độ 0,1 ng/ml cho đáp ứng S/N = 15,8 nên xác định LOQ clindamycin khoảng 0,06 ng/ml LOD LOQ đƣợc tính theo công thức LOD = LOQ/3,3 Nhƣ kết giá trị LOD LOQ kháng sinh là: ảng 3.6 Kết giá trị LOD, LOQ phương pháp Kháng sinh LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) Clindamycin 0,03 0,1 Lindamycin 0,018 0,06 42 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 VỀ LỰA CHỌN KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU Hai kháng sinh đƣợc lựa chọn nghiên cứu lincomycin clindamycin thuộc nhóm kháng sinh lincosamid Nhìn chung hai kháng sinh chƣa đƣợc sản xuất nhiều Việt Nam khiến cho việc tìm kiếm nguồn nƣớc thải nhà máy có sản xuất hai kháng sinh gặp nhiều khó khăn nhu cầu cần có phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng hai kháng sinh nƣớc thải chƣa lớn Tuy nhiên nƣớc giới có nghiên cứu định lƣợng đồng thời hai kháng sinh nƣớc thải công nghiệp, lựa chọn hai kháng sinh đƣa vào nghiên cứu Trong tƣơng lai hai kháng sinh đƣợc sản xuất nhiều tiếp tục phát triển phƣơng pháp để làm sở cho việc quản lý xử lý chất thải Trong thời gian thực nghiên cứu này, nhà máy có đăng kí sản xuất hai kháng sinh lincomycin clindamycin lại kế hoạch sản xuất hai kháng sinh này, chƣa thể thu thập đƣợc mẫu nƣớc thải nhà máy có sản xuất kháng sinh để tiến hành phân tích đƣợc kháng sinh mẫu thử nhƣ ứng dụng phƣơng pháp để thử định lƣợng mẫu nƣớc thải thực tế 4.2 VỀ PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU Trong số nhiều phƣơng pháp xử lý mẫu, lựa chọn phƣơng pháp chiết pha rắn để xử lý mẫu Đây phƣơng pháp xử lý loại bỏ đƣợc nhiều loại tạp chất làm giàu mẫu mẫu nƣớc thải phức tạp với hàm lƣợng chất phân tích thấp hiệu suất thu hồi kháng sinh cao (64,94 - 85,3%) Đối với phƣơng pháp chiết pha rắn, thể tích mẫu chiết loại dung môi rửa giải, thể tích dung môi rửa giải thông số quan trọng cần khảo sát yếu tố định đến hiệu suất chiết Tuy nhiên cột chiết pha rắn có giá thành cao, nhƣ mong muốn xây dựng đƣợc quy trình chung để định lƣợng đồng thời nhiều loại kháng sinh nƣớc thải công nghiệp nên qua tham khảo lựa chọn quy trình chiết pha rắn nghiên cứu Trần Thị Linh Anh 43 [1] sử dụng SPE LC-MS/MS để định lƣợng đồng thời kháng sinh azithromycin, clarithromycin, sulphamethoxazol trimethoprim Kết cho thấy quy trình đáp ứng đƣợc yêu cầu xử lý mẫu thu đƣợc hiệu suất chiết cao 4.3 VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Chúng lựa chọn phƣơng pháp phân tích LC-MS/MS phƣơng pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao, phù hợp để phân tích mẫu dƣ lƣợng môi trƣờng Bên cạnh phƣơng pháp phân tích đồng thời nhiều chất, đảm bảo phân tách tốt kháng sinh chọn Trong LC-MS/MS có nhiều kĩ thuật ion hoá, qua tham khảo tài liệu, chọn kĩ thuật phun sƣơng tĩnh điện tạo ion dƣơng (ESI+) ƣu điểm dùng cho hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lƣợng phân tử lớn đƣợc xem kỹ thuật ion hóa “êm dịu” APCI, thích hợp cho phân tích hợp chất sinh học nhƣ protein polyme công nghiệp Số lƣợng ion mẹ ion đáp ứng đƣợc yêu cầu AOAC (IP = 4) Với chế độ pha động đẳng dòng MeOH : H2O 90 : 10 nhƣ lựa chọn, kháng sinh chuẩn nội có thời gian lƣu gần nhau, nhiên với việc sử dụng detector MS, phƣơng pháp xây dựng không yêu cầu chất phân tích phải tách hoàn toàn sắc ký lỏng nhƣ sử dụng detector khác nhƣ DAD hay RF Các kháng sinh tách hoàn toàn ion phân tử ion đặc trƣng Do lựa chọn pha động với mục đích ƣu tiên lựa chọn peak sắc ký đẹp cân đối, tách chất phân tích khỏi chất có mẫu Phổ khối kháng sinh nghiên cứu điều kiện phân tích sắc ký đồ ion chất đƣợc phân tách rõ rang thời gian lƣu gần Quá trình tách sắc ký lỏng có vai trò phân tách loại bỏ ảnh hƣởng mẫu tạp chất mẫu trình ion hoá chất Ngoài nguồn nạp mẫu cho đầu dò MS Trong nghiên cứu này, lựa chọn sử dụng chuẩn nội đồng vị 13 C3 trimethoprim Chất chuẩn nội đáp ứng đƣợc yêu cầu phân tích bị ảnh hƣởng mẫu (không có tự nhiên) có tính chất tƣơng tự chất phân 44 tích Đây chuẩn nội chƣa đƣợc sử dụng phổ biến có giá thành cao, nhiên lại chất đƣợc khuyến cáo nên sử dụng nghiên cứu dƣ lƣợng môi trƣờng sử dụng LC-MS/MS 4.4 VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP Chúng tiến hành thẩm định phƣơng pháp theo hƣớng dẫn AOAC, độ đặc hiệu phƣơng pháp phân tích LC-MS/MS đƣợc đánh giá số điểm nhận dạng (IP) chất phân tích Trong đó, ion phân tử đƣợc tính điểm ion đƣợc tính 1,5 điểm, số điểm IP tối thiểu phải đạt đƣợc để khẳng định chất phân tích Kết nghiên cứu thu đƣợc cho thấy chất có ion mẹ hai ion con, đạt số điểm IP Nhƣ vậy, phƣơng pháp xây dựng đáp ứng đƣợc yêu cầu số điểm nhận dạng Kết trình thẩm định cho thấy: có mối tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ tỉ số diện tích pic kháng sinh so với chuẩn nội nồng độ khoảng khảo sát 0,5 – 50ng/ml với r > 0,995 Phƣơng pháp có độ cao (phần trăm tìm lại nằm khoảng 64,94 - 85,3 %) Hệ thống có tính thích hợp tốt (RSD thời gian lƣu < 2%; diện tích pic kháng sinh chuẩn nội nhỏ < 5%) hoàn toàn thích hợp ứng dụng xác định dƣ lƣợng kháng sinh lincomycin clindamycin Phƣơng pháp có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng đến nồng độ ng/ml (từ 0,018ng/ml - 0,1ng/ml), nhƣ giới hạn thấp so với nhiều nghiên cứu trƣớc giới xác định nồng độ lincomycin clindamycin Trong khuôn khổ đề tài, tiến hành thẩm định phƣơng pháp xây dựng đƣợc cho kết tốt Chúng chứng minh đƣợc phƣơng pháp có tính chọn lọc cao với độ độ xác tốt (so với tiêu chuẩn AOAC) Ngoài ra, khoảng tuyến tính xây dựng đƣợc nồng độ thấp (từ 0,5 đến 50ng/ml) thích hợp để xác định dƣ lƣợng kháng sinh nƣớc thải nồng độ kháng sinh khảo sát thƣờng nhỏ 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ trình thực nghiệm, thu đƣợc kết hoàn thành mục tiêu đề nhƣ sau: 1.1 Đã lựa chọn đƣợc điều kiện sắc ký lỏng khối phổ xây dựng đƣợc quy trình định lƣợng đồng thời hai kháng sinh lincomycin clindamycin nƣớc thải LC-MS/MS a) Quy trình xử lý mẫu Xử lý sơ bộ: lọc nƣớc thải qua giấy lọc nhiều lần ước 1: Hoạt hóa cột Cho qua cột lần lƣợt 6ml methanol, 6ml nƣớc ml nƣớc đƣợc acid hóa tới pH dung dịch HCl 10% ước 2: Đƣa mẫu lên cột Thể tích mẫu đƣa lên cột 200ml Mẫu tự tạo đƣợc điều chỉnh đến pH 2,0 dung dịch HCl 10% Để mẫu chảy qua cột với tốc độ 0,6 ml/phút ước 3: Rửa cột Dùng 6ml nƣớc cất Thổi khô cột khí N2 10 phút ước 4: Rửa giải Dung môi rửa giải MeOH với thể tích 10ml Rửa giải với tốc độ 0,6ml/phút Dịch rửa giải đƣợc thổi khô dƣới dòng khí N2 nhiệt độ phòng hòa tan cắn 1ml hỗn hợp methanol – nƣớc (1 : 1), lọc qua màng 0,2m đem tiến hành sắc ký b) Lựa chọn chất chuẩn nội Lựa chọn đƣợc 13 C3 trimethoprim chất chuẩn nội, đảm bảo tính đặc hiệu không bị ảnh hƣởng mẫu c) Điều kiện sắc ký - Sử dụng cột Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (150mm x 3mm; 3,5µm) - Thể tích tiêm 5l - Tốc độ dòng pha động 5ml/phút - Tỉ lệ pha động MeOH (0,1% acid formic) H2O (0,1% acid formic) tỉ lệ 90:10 46 - Thời gian phân tích phút d) Điều kiện khối phổ Đã xác định đƣợc điều kiện MS phù hợp để phân tích đồng thời kháng sinh với kĩ thuật ESI chế độ ion dƣơng Các ion điều kiện bắn phá đƣợc lựa chọn nhƣ sau: Ion (m/z) Điều kiện bắn phá Ion mẹ (m/z) Định lƣợng Định tính CE (V) Frag (V) Lincomycin 407,1 126,1 359,1 20 135 Clindamycin 425,1 126,1 377,0 20 135 13 293,9 232,9 125,8 23 154 Tên chất C3Trimethoprim 1.2 Đã thẩm định đƣợc quy trình định lƣợng theo hƣớng dẫn AOAC - Phƣơng pháp có tính đặc hiệu, chọn lọc, phân tích đồng thời loại kháng sinh nƣớc thải - Hệ thống có độ thích hợp cao, phù hợp để tiến hành định lƣợng - Đã xây dựng đƣợc khoảng tuyến tính tỉ lệ SKS/SIS với nồng độ kháng sinh từ 0,5ng/ml - 50ng/ml với hệ số tƣơng quan chặt chẽ r > 0,995 chất - Phƣơng pháp có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng đến nồng độ ng/ml (LODCLI = 0,03ng/ml; LODLIN = 0,018 /ml; LOQCLI = 0,1ng/ml; LOQLIN = 0,06ng/ml) - Phƣơng pháp đạt yêu cầu độ Độ kháng sinh nằm khoảng 60% - 115% với RSD [...]... thời nên chúng tôi tham khảo và lựa chọn quy trình tối ƣu để chiết tách và làm giàu mẫu từ các nghiên cứu đã có trƣớc đó Loại cột chiết sử dụng là cột chiết pha rắn OASIS HLB Cartridge 6ml, 200mg (Waters – Mỹ) 21 2.2.3 Phƣơng pháp xây dựng quy trình định lƣợng lincosamid bằng HPLC MS/ MS Xây dựng quy trình phân tích sao cho có thể sử dụng định lƣợng đồng lincomycin và clindamycin Tiến hành khảo sát... nghiên cứu định lƣợng 2 kháng sinh này trong nƣớc thải công nghiệp, y tế hoặc nƣớc thải sinh hoạt - Chƣa có nghiên cứu định lƣợng đồng thời cả 2 loại kháng sinh này Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mong muốn xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng đồng thời cả hai kháng sinh lincomycin và clindamycin trong nền mẫu nƣớc thải 19 2 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG & PHƢƠNG... quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đƣa vào đầu dò để phát hiện [2], [11] 1.2.2.3 Một số ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ LC- MS có tính chọn lọc và độ nhạy cao, thƣờng đƣợc sử dụng để xác định lƣợng siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp nhƣ định tính, định lƣợng thuốc và các dạng chuyển hóa trong dịch sinh học, độc chất học, định lƣợng dƣ lƣợng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm,... = 232,9 cho tín hiệu lớn nhất đƣợc lựa chọn làm ion định lƣợng Nhƣ vậy, mỗi chất đƣợc xác định bằng một ion mẹ và hai ion con dùng để định lƣợng và định tính Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phƣơng pháp phân tích bằng LC- MS/ MS của các tổ chức quốc tế với số điểm nhận dạng (IP) là 4 Kết quả này cũng trùng khớp với hƣớng dẫn của EPA [34] và các nghiên cứu trƣớc đây, do vậy chúng tôi lựa chọn... rộng, LOD và LOQ thấp, độ nhạy cao - Các nghiên cứu đều xác định lincomycin có 1 ion mẹ có m/z ~ 407 và 2 ion con có m/z ~126 và ~359 còn clindamycin có 1 ion mẹ có m/z ~425 và 2 ion con có m/z~ 126 và và 377 - Lincomycin và clindamycin đƣợc nghiên cứu xác định hàm lƣợng trên rất nhiều nền mẫu phong phú (thực phẩm, huyết tƣơng, các cơ quan của ngƣời hoặc động vật), tuy nhiên chƣa có các nghiên cứu định. .. khi chiết (dựa vào đƣờng chuẩn) để xác định độ thu hồi - Tính RSD để xác định độ lặp lại của phƣơng pháp Tính tỉ lệ chuẩn thu hồi lại đƣợc và lƣợng chuẩn thêm vào để có đƣợc độ đúng của phƣơng pháp Yêu cầu: Với nồng độ kháng sinh từ 10 - 100 ng/ml thì phƣơng pháp cần có: - Độ thu hồi từ 60% - 115% - RSD của độ thu hồi ≤ 21 % 2.2.4.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Giới hạn định lƣợng (LOQ)... xác định đƣợc ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) Với kỹ thuật ion hóa ESI, chế độ ion dƣơng, các ion phân tử thƣờng đƣợc tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+, một số trƣờng hợp thêm hai proton [M-2H]++ Tuy nhiên để định tính và định lƣợng thì cần phải xác định đƣợc ít nhất 2 ion sản phẩm, trong đó có một ion sản phẩm dùng để định lƣợng và một ion sản phẩm dùng để định tính Để xác định. .. sử dụng phổ biến trong kỹ thuật LCMS /MS và đây cũng là kỹ thuật đƣợc chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này Bộ phận phân tích khối tứ cực có 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau Khi một trƣờng điện từ đƣợc tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số (RF) cao, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số m/z và trƣờng RF Chỉ... độ 0,3; 0,5; 0,6 ml/phút để xác định tốc độ phù hợp Chọn tốc độ cho peak cân đối, ít doãng và thời gian lƣu vừa đủ - Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm 3; 5;10l để xác định đƣợc thể tích tiêm phù hợp cho sắc ký đồ cân đối, diện tích peak và độ đáp ứng cao 2.2.4 Phƣơng pháp thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng Xử lí các mẫu nghiên cứu theo phƣơng pháp đã xây dựng, tiến hành sắc ký các dung... ở quy mô rộng 15 1.3 MỘT SỐ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG CLINDAMYCIN VÀ LINCOMYCIN TRÊN THẾ GIỚI ảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng kháng sinh lincomycin và clindamycin sử dụng LC- S/ S trên thế giới Tài liệu [28] [21] Hoạt chất/nền mẫu CLI/ huyết tƣơng ngƣời CLI/ huyết tƣơng động vật Điều kiện LC Điều kiện MS Khoảng tuyến tính LOD LOQ - Cột Agilent LC- 18 (33x4,6mm; 3µm) - Pha động: hỗn hợp methanol/nƣớc/acid