Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 166-177 Trường Đại học Cần Thơ ẢNH HƯỞNG CỦA NITRITE LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG Đỗ Thị Thanh Hương1, Mai Diệu Quyên2, Sjannie Lefevre3, Tobias Wang3, Mark Bayley3 ABSTRACT The effect of nitrite on the physiology and hematology of stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) fingerlings (15-20 g/fish) was studied at the College of Aquaculture and Fisheries, Can Tho University The experiment to determine the acute toxicity of nitrite was randomly designed with treatments (including a control of non-nitrite) and replicates for each in 100-liter composite tanks The result shows the medium lethal concentration (96h LC50) of nitrite to the stripped catfish was 75,6 mg/L NO2-N The effects of nitrite on physiological, hematological changes of stripped catfish were conducted by exposing fish to various concentrations of nitrite including 59,1 mg/L (LC1096-hr); 66,4 mg/L (LC25-96-hr); 75,6 mg/L (LC50-96-hr) and control (0 mg/L) Three replicates for each treatment The results showed that the ecrythrocyte count and percentage of Hct, Hb, MCV, MCH in fish blood were reduced in higher concentrations of nitrite if compared to those of control treatment In contrast, the lymphocyte count, metHb and MCHC in fish blood increased in all nitrite contaminated treatments in comparasion with control treatment Thus, the high concentration nitrite in the water leading to the increase of metHb concentration in the blood causing a phenomenon “blood brown” of stripped catfish Keywords: Hematology, tripped catfish, nitrite, brown disease Tilte: Study on the physiological and hematological changes of stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) fingerling exposed to different nitrite concentrations TÓM TẮT Ảnh hưởng nitrite lên tiêu sinh lý cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai đoạn giống (15–20 g) thực Khoa Thủy sản, Đại học Cần thơ Thí nghiệm xác định giá trị LC50-96 bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nghiệm thức từ 50 đến 140 mg NO2-N/L đối Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Sở Nông nghiệp Phát triển nông thôn tỉnh Kiên Giang Bộ môn Sinh học, Đại học Aarhus, Đan Mạch 166 Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 166-177 Trường Đại học Cần Thơ chứng Kết cho thấy giá trị LC50-96 NO2-N 75,6 mg/L Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nitrite lên tiêu sinh lý, huyết học cá tra thực nồng độ gồm 59,1 mg/L (LC10-96 giờ); 66,4 mg/L (LC25-96 giờ); 75,6 mg/L (LC50-96 giờ) đối chứng Máu cá thu vào thời điểm 1, 6, 24, 48, 72 96 sau thí nghiệm bắt đầu Các tiêu huyết học số lượng hồng cầu, tỷ lệ Hct, Hb, MCV, MCH giảm tiếp xúc với nồng độ nitrite cao Ngược lại, số lượng bạch cầu, metHb MCHC tăng tiếp xúc với nitrite Như vậy, nitrite môi trường nước cao làm cho hàm lượng metHb máu cá tra tăng lên gây tượng máu cá có màu nâu Từ khóa: Huyết học, cá tra, nitrite, bệnh máu nâu GIỚI THIỆU Trong ao nuôi cá tra tiêu môi trường TAN, NO2- NO3- có xu hướng tăng cao cuối vụ Theo De Silva et al., (2010) nuôi cá tra thức ăn viên công nghiệp thải môi trường 46,0 kg nitơ 14,0 kg phospho Môi trường ao nuôi cá tra ô nhiễm nguyên nhân làm cho tỷ lệ cá chết hao hụt nhiều (Thich, 2008) Trong nuôi thủy sản nói chung ammonia thải vi khuẩn Nitrosomonas chuyển hóa ammonia thành nitrite (Huey Beitinger, 1980) Nitrite xem khí độc tồn môi trường ao làm ảnh hưởng đến sức khỏe cá hàm lượng tăng cao Ở cá nitrite tích trữ huyết tương nguyên nhân gây trình oxy hóa Hb (Hemoglobin) thành metHb (Methemoglobin) metHb không vận chuyển oxy nên nitrite trở thành độc chất mức thấp chất gây độc cho nhiều loài cá (Huertas et al., 2002) Trong ao nuôi cá tra thả mật độ cao lượng thức ăn sử dụng nhiều (Lam et al., 2009) nên chất thải từ phân cá thức ăn dư thừa nguồn hình thành lượng lớn khí ammonia ao nuôi trở thành yếu tố bất lợi cho cá Vì thế, nghiên cứu ảnh hưởng nitrite lên sức khỏe cá tra thông qua tiêu sinh lý sinh hóa cần thiết để biết giá mức độ ảnh hưởng đến sức khỏe cá nuôi PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thực môn Dinh dưỡng Chế biến Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Nghiên cứu gồm thí nghệm là: 2.1 Xác định giá trị LC50-96 nitrite lên cá tra Thí nghiệm tiến hành theo phương pháp nước tỉnh không thay nước 96 với nồng độ nitrite gồm 50, 65, 80, 95, 110, 125, 140 mg NO2N/L đối chứng (0 mg/L) Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại bể composit tích 100 lít Nồng độ nitrite pha 167 Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 166-177 Trường Đại học Cần Thơ phương pháp hòa tan NaNO2 vào môi trường nước theo phương trình phân ly (NaNO2 Æ Na + NO2-) Mỗi nghiệm thức lặp lại với 10 cá tra khỏe mạnh giữ bể từ 15-20 ngày trước tiến hành thí nghiệm Trong suốt thời gian thí nghiệm cá không cho ăn Theo dõi hoạt động cá ghi nhận số cá chết thời điểm gồm 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72 96 sau bố trí Giá trị LC50-96 tính phương pháp Probit (Finney, 1971) sử dụng phần mềm SPSS 16.0 2.2 Ảnh hưởng nitrite nồng độ khác lên tiêu hao oxy ngưỡng oxy cá tra Thí nghiệm tiến hành với nồng độ nitrite gồm 59,1 mg/L (LC10-96 giờ); 66,4 mg/L (LC25-96 giờ); 75,6 mg/L (LC50-96 giờ) đối chứng (0 mg/L NO2N/L) Mỗi nồng độ thí nghiệm bố trí sáu lần lập lại Cá thí nghiệm không cho ăn ngày nước thí nghiệm sục khí ngày trước sử dụng cho thí nghiệm Cho cá vào bình kín L (1 thí nghiệm tiêu hao oxy đối vơi thí nghiệm ngưỡng oxy) Nước cho chảy tuần hoàn bình 30 phút để cá quen với môi trường Sau 30 phút nitrite cho vào bể tiếp tục cho chảy tuần hoàn 30 phút tiến hành thu mẫu xác định hàm lượng oxy đầu thí nghiệm để yên 15 phút thu mẫu xác định oxy cuối để tính toán tiêu hao oxy cá Thí nghiệm ngưỡng oxy tiến hành tương tự đến cá bình chết 50% (chết con) thu mẫu nước thu để phân tích hàm lượng oxy hòa tan nước 2.3 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng nitrite lên tiêu huyết học cá tra Cá từ ao nuôi chuyển phòng thí nghiệm hóa từ 15–20 ngày trước thí nghiệm Cá chọn thí nghiệm có kích cỡ đồng đều, không bị dị tật hay xây xát Thí nghiệm gồm nghiệm thức gồm nồng độ thí nghiệm xác định ngưỡng tiêu hao oxy (thí nghiệm thứ 2) nghiệm thức lặp lại lần Mỗi nghiệm thức bao gồm 24 bể (100 L/bể) bể có cá Thời gian thu mẫu máu sau g, g, 24 g, 48 g, 72 g 96 g sau cá tiếp xúc với nitrite Cá thu vợt lưới, thu hết tất bể Cá sau thu cân khối lượng đo chiều dài Máu cá thu động mạch đuôi ống tiêm mL để phân tích tiêu huyết học (hồng cầu, bạch cầu, hemoglobin, methemoglobin, hematorit) Các yếu tố môi trường đo vào thời điểm lúc thu tiêu huyết học Hồng cầu bạch cầu đếm buồng đếm Neurbar theo phương pháp thông thường cách nhuộm mẫu dung dịch Natt – Herrick Wright’s & Giemsa Phương pháp đo Hemoglobin thuốc thử Drabkin (Đỗ Thị Thanh Hương Nguyễn văn Tư, 2010) Met-hemoglobin đo theo phương pháp dùng ống tiêm lấy 0,5 mL máu cá, máu trữ ống eppenndorf, sau lấy 10 µL máu cho vào ống eppenndorf khác có chứa mL 168 Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 166-177 Trường Đại học Cần Thơ phosphate buffer (pH=7,3) ly tâm 18.000 vòng phút Lấy mL sau ly tâm cho vào cuvette đo bước sóng từ 480–700 nm Sử dụng phần mềm Sigma plot 10.0 để tính toán kết Dung dịch phosphate buffer (pH=7,3) chuẩn bị cách pha dung dịch A (hòa tan 1,38 g NaH2PO4 với nước cất thành 500 mL) dung dịch B (hòa tan 1,78 g Na2HPO4 với nước cất thành 500 mL) theo tỉ lệ 30 mL 70 mL sau điều chỉnh pH đạt đến 7,3 Các yếu tố môi trường NO2-N hàm lượng oxy nước phân tích theo phương pháp thông thường Số liệu phân tích giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (std) phần mềm Excel; so sánh khác biệt nghiệm thức dựa vào phân tích ANOVA DUNCAN phần mềm SPSS 11.5 (mức ý nghĩa p 0,05) so với nghiệm thức 59,1 mg/L NO2-N (67 mgO2/kg/giờ) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p