BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH *************** BÙI HỮU DŨNG BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH NHIỄM CIRCOVIRUS TRÊN VỊT VÀ KHẢ NĂNG NHIỄM GHÉP GIỮA CIRCOVIRUS VÀ RIEMERELLA ANATIPESTIFER TRÊN VỊT SIÊU THỊT NHẬP NGOẠI Ở TỈNH ĐỒNG NAI ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH *************** BÙI HỮU DŨNG BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH NHIỄM CIRCOVIRUS TRÊN VỊT VÀ KHẢ NĂNG NHIỄM GHÉP GIỮA CIRCOVIRUS VÀ RIEMERELLA ANATIPESTIFER TRÊN VỊT SIÊU THỊT NHẬP NGOẠI Ở TỈNH ĐỒNG NAI Chuyên ngành: Thú Y Mã số: ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: PGS.TS NGUYỄN TẤT TOÀN TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng /2015 MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AGP Agar Gel Pricipitin AT Achilles Tedon BFDV Beat feather disease virus CAD Chick Edema Disease DBH Dot-blot Hybridization dNTP .deoxyribonucleoside triphosphate DHV Duck Hepatitis Virus DNA Deoxyribo nucleotid acid DuCV Duck circovrius ELISA .Enzyme linked immunosorbent Assay GoCV Goose circovirus HS Heart Sac ISH .In situ Hybridization LAMP Loop-mediated isothermal amplification M Meninges OD Odd density ORF Open reading Frame pb Base pair PBS .Phosphate Bufferd Saline PCV Porcine circovirus PCR Polymera chain reaction PiCV Piegon circovirus PK15 Pig kiney 15 RA Riemerella anatipestifer SC Subcutis TBE Tris Borate EDTA DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Các hạt phân tử DuCV túi bursa fabricius vịt Mulard chụp kính hiển vi điện tử Hình 2.2 Cấu trúc gien DuCV Hình 2.1 Vịt hư hại lông, chảy nước mắt, nước mũi Hình 2.4 Vịt bị thất điều vận động, nằm ngửa bơi chèo Hình 2.5 Các bệnh tích đại thể phổ biến vịt nhiễm RA Hình 2.6 Các bệnh tích vi thể phổ biến vịt nhiễm RA DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Một số kháng sinh sulfamides sử dụng điều trị bệnh RA Bảng 3.1 Số lượng trại khảo sát số mẫu dự kiến Bảng 3.2 Mẫu thu thập cho nghiên cứu xét nghiệm bệnh Bảng Trình tự đoạn mồi dùng phản ứng PCR chẩn đoán RA Bảng Thành phần phản ứng PCR chẩn đoán DuCV Bảng Chu trình luân nhiệt phản ứng PCR phát RA Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Bệnh Circovirus vịt có tỷ lệ lưu hành cao nhiều giống vịt nuôi nhà (Zhang cs, 2012) như: Mulard, Super meat, Grimaud star 53 đặc trưng tình trạng còi cọc bất thường trình phát triển lông DuCV mô tả trại vịt Mulard Đức năm 2003 (Hattermann cs, 2003) Sau đó, lây nhiễm DuCV nhanh chóng báo cáo nhiều quốc gia giới như: Hungary, Mỹ, Đài Loan Trung Quốc (trích dẫn Cha cs, 2013) DuCV nguyên nhân gây suy giảm khả sinh sản hiệu kinh tế chăn nuôi (Cha cs, 2013) Đây mối quan tâm lớn cho người chăn nuôi gia cầm Rõ ràng, năm gần đây, chăn nuôi gia cầm chiếm vị trí ngày quan trọng sản xuất nông nghiệp Trong đó, chăn nuôi vịt siêu thịt nhập ngoại hướng phát triển cho người chăn nuôi Một số giống vịt siêu thịt nuôi nhiều tỉnh Đồng Nai như: Grimaud star 53, Super meat phát triển cách nhanh chóng Tuy nhiên, vấn đề quản lý vệ sinh trại chăn nuôi vịt nghèo nàn so với trại gà Hơn nữa, khả phổ cập kiến thức chăn nuôi hệ thống sở trang trại nuôi vịt đáp ứng kịp thời đầy đủ so với tốc độ phát triển đầu Đây cho nguyên nhân làm cho tình hình dịch bệnh sở chăn nuôi vịt ngày diễn tiến phức tạp Trong đó, bệnh Circovrus vịt (DuCV) nguy đáng lưu tâm Hầu hết, nghiên cứu DuCV thường tập trung vào dấu hiệu lâm sàng, bệnh tích vi thể ứng dụng số phương pháp phân tử để chẩn đoán DuCV Trong đó, khả nhiễm ghép DuCV tác nhân khác vấn đề đáng quan tâm người chăn nuôi Sự tổn thương mô lympho nguyên nhân gây suy giảm đáp ứng miễn dịch làm tăng nguy nhiễm ghép (Soike cs, 2004) Ở Việt Nam, chưa có nhiều báo cáo thống tình hình lây nhiễm Circovirus vịt khả nhiễm ghép với số tác nhân khác như: E.coli, Salmonella, DHV Riemeralla anatipestifer Mặc dù, số lượng trại nuôi vịt siêu thịt nhập ngoại tăng lên cách nhanh chóng, tình hình dịch bệnh loài ngày phức tạp Xuất phát từ vấn đề thực tiễn sản xuất đặt ra, đề tài: “Bước đầu đánh giá tình hình nhiễm Circovirus vịt khả nhiễm ghép Circovirus Riemerella anatipestifer vịt siêu thịt nhập ngoại tỉnh Đồng Nai” thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Tất Toàn TS Nguyễn Thị Phước Ninh 1.2 Mục tiêu đề tài - Đánh giá tình hình nhiễm Circovirus đàn vịt nuôi - Đánh giá khả nhiễm ghép Circovirus RA vịt 1.3 Yêu cầu đề tài - Tỷ lệ nhiễm DuCV tổng đàn/ vịt khảo sát - Tỷ lệ nhiễm DuCV đàn/ vịt khảo sát theo lứa tuổi - Tỷ lệ nhiễm RA vịt dương tính với Circovirus - Tỷ lệ nhiễm RA vịt âm tính với Circovirus - So sánh tỷ lệ nhiễm RA vịt dương tính âm tính với Circovirus Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu bệnh circovirus vịt 2.1.1 Lịch sử bệnh Circovirus vịt (DuCV) thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae mô tả hai vịt mái Mulard tuần tuổi Đức, năm 2003 (Hattermann cs, 2003) Bệnh gây tác hại chủ yếu như: rối loạn tình trạng mọc lông, chậm tăng trưởng gầy ốm (Hattermann cs, 2003; Soike cs, 2004) Sau đó, DuCV phân lập Hungary (Fringuell cs, 2005) Năm 2006, Chen cs mô tả DuCV vịt Muscovy, Pekin Mule với triệu chứng còi cọc, bất bình thường trình phát triển lông vịt nuôi Đài Loan Các phát bệnh Circovirus vịt mô tả Mỹ (Banda cs, 2007) Trung Quốc (Zhang cs, 2009) Tháng năm 2011, DuCV phân lập đàn vịt Pockmuark thương phẩm Guangxi, Trung Quốc có dấu hiệu lâm sàng bệnh với suy giảm đáp ứng miễn dịch (Liji Xie cs, 2012) Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu DuCV công bố thức 2.1.2 Căn nguyên Họ Circovirus gồm giống: Gyrovirus Circovirus Trong Gyrovirus gây bệnh thiếu máu gà - CAD (Hailemariam H., 2008), Circovirus có thành viên: Circovirus heo - PCV1, PCV2 (Allan Ellis, 2000; Mankertz cs, 2000), vi-rút gây bệnh mỏ lông - BFDV (Bassami cs, 2001), Circovirus bồ câu - PiCV (Mankertz cs, 2000; Soike cs, 2001; Todd cs, 2002), Circovirus ngỗng - GoCV (Chen cs, 2003; Soike cs, 2004), Circovirus canary (Phenix cs, 2001; Pringle, 1999) Circovirus vịt - DuCV (Hattermann cs, 2003) DuCV có 20 mặt, không vỏ, dạng tròn, DNA sợi đơn, độ dài khoảng 1,99 kb (nucleotide 1988-1996), kích thước nhỏ, đường kính từ 15-16 nm (Hattermann cs, 2003; Wang cs, 2011) DuCV chia thành genotype: DuCV1, DuCV2 subtype gồm: 1a,1b,1c 2a, 2b, 2c (Zhilong cs, 2013) Hình 2.1 Các hạt phân tử DuCV túi bursa fabricius vịt Mulard chụp kính hiển vi điện tử (Nguồn: Soike cs, 2004) Theo Hattermann cs (2003), DuCV có khung đọc mở: ORF1 (ORF V1) ORF2 (ORF V2) ORF1 gọi gien Rep (nucleotide 33-926), nằm sợi vi-rút, mã hóa cho protein có trọng lượng 33,6 kDa, liên quan đến nhân lên vi-rút Gien Rep có bảo tồn cao, đột biến (Zhilong cs, 2013) ORF2 gọi gien Cap (nucleotide 1151-1924), nằm hướng đối diện, mã hóa cho protein capside liên quan đến cấu trúc miễn dịch vi-rút (Hattermann cs, 2003; Liu cs, 2010) Năm 2012, Xiang cộng dựa sở giải trình tự gien chứng minh DuCV có thêm ORF3 (nucleotide 103-399), nằm mạch bổ sung ORF1 có đồng với gien ORF3 PCV2 heo ORF3 liên quan đến chết theo lập trình tế bào Tấc ORF chịu áp lực chọn lọc codon serotype (từ serotype đến serotype 21) báo cáo Tấc serotype phản ứng đặc hiệu với kháng huyết thanh, ngoại trừ serotype có phản ứng chéo với serotype serotye (Loh cs, 1992; Sandhu Harry, 1981) Subramaniam cộng (2000), chèn gien protein màng (Omp A) RA để mã hóa protein màng kháng nguyên đặc hiệu (42 kDa) Tấc chủng RA chứa gien Omp A, mặc dù, vài khác biệt gien quan sát chủng khác Hu cộng (2011) chứng minh Omp A yếu tố độc lực RA Hầu hết chủng RA chứa plasmids (3,9 b) mang gien protein (thêm hình cấu trúc RA) 2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy RA phát triển tốt môi trường thạch chocolate, thạch máu trypticase soy agar Để RA phát triển tốt cần bổ sung thêm 0,05 % chiết xuất men bia % huyết bê sinh Sự phát triển RA tốt tăng thêm carbon dioxide (Graham, 1938) Vi sinh vật phát triển tối ưu sau 48-72 nuôi cấy 37 0C bình nuôi cấy cung cấp đầy đủ carbon dioxide ẩm độ RA không phát triển nhiệt độ 55 0C 0C 2.2.3 Sức đề kháng Hầu hết chủng RA không sống sót môi trường rắn (solid media) 3-4 ngày 37 0C nhiệt độ phòng, 12-16 55 0C (Bangun cs, 1981) Ngược lại, RA tồn 2-3 tuần nhiệt độ 0C môi trường nước luộc thịt RA nhạy cảm với số kháng sinh như: penicillin, novobiocin, chloramphenicol, lincomycin, enrofloxacin, ceftiofur, streptomycin, erythromycin, ampicillin, bacitracin, neomycin tetracycline đề kháng với kanamycin, polymyxin (Bangun cs, 1981; Chang, 2003) gentamycin 2.2.4 Đặc điểm dịch tễ Bệnh RA xảy toàn giới công bố nhiều quốc gia có chăn nuôi vịt thâm canh Sự phức tạp bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: chủng vi khuẩn, tuổi vật chủ đường truyền lây (Heddleston, 1972; Sarver 2005) RA mô tả vịt ngỗng Sau đó, báo cáo gà tây (Sarver, 1977; Zehr, 1970), chim trĩ (Bruner, 1970), gà (Rosenfeld, 1973), cút (Pascucci, 1989) heo (Hinz, 1998) Vịt từ 1-8 tuần tuổi nhạy cảm cao với mầm bệnh Vịt nhỏ tuần tuổi thường chết 1-2 ngày sau xuất triệu chứng lâm sàng Tuổi vịt lớn thường có thời gian sống sót lâu Bệnh RA xảy vịt đẻ Mầm bệnh truyền lây trực tiếp gián tiếp RA truyền lây trực tiếp qua đường hô hấp (Layton, 1984), gián tiếp qua vết thương da thông qua trung gian chất độn chuồng nhiễm mầm bệnh (Asplin, 1955) Vi khuẩn xâm nhập qua vết trầy xước, vết nứt hay vết thương da điểm cánh Vịt bị nhiễm mầm bệnh qua phân vào thức ăn, nước uống hay môi trường, nơi vịt nhiễm RA mãn tính nguồn lây bệnh lâu dài trại Thời gian ủ bệnh thường từ 2-5 ngày Sự gây nhiễm thí nghiệm cách tiêm da da có biểu lâm sàng đặc trưng bệnh, tỷ lệ tử vong cao sớm sau 24 Ngược lại, gây nhiễm qua đường miệng hô hấp tỷ lệ tử vong thấp (Asplin, 1956; Hatfield, 1988; Sarver, 2005) 2.2.5 Triệu chứng lâm sàng Các dấu hiệu lâm sàng thường quan sát thấy với biểu hiện: ủ rũ, chảy nước mắt, nước mũi, ho, hắc hơi, sốt thở nhanh Vịt tiêu chảy phân xanh Ngoài ra, vịt bị thất điều vận động, bơi chèo, quẹo cổ, run đầu hôn mê Vịt chết nhiễm trùng huyết nhiễm độc tố huyết Tùy thuộc vào đặc tính gây bệnh vi khuẩn, tỷ lệ bệnh biến động từ 5-75 %, tỷ lệ chết thường cao Những vịt sống sót thường còi cọc hay chậm lớn (Pickrell, 1966) Hình 2.3 Vịt hư hại lông, chảy nước Hình 2.4 Vịt bị thất điều vận động, mắt, nước mũi (http://vemedim.vn/Download/Benh_Bai_Huyet _Tren_Vit.pdf) nằm ngửa bơi chèo (http://poultrypics.com/?page_id=446) 2.2.6 Bệnh tích 2.2.6.1 Bệnh tích đại thể Các tổn thương đại thể chủ yếu tiết dịch có sợi huyết số quan như: tim, gan hay túi khí Tình trạng viêm bao tim có dịch thẩm xuất biểu qua tình trạng: bao tim trắng đục lúc phát, giai đoạn sau, bao tim khô có nhiều sợi huyết Các tổn thương thường kết hợp với xuất huyết lấm Gan bị viêm bao phủ lớp trắng đục không bám dính vào quan khác Lách phì đại trung bình, dạng dài ra, màu bề mặt có dạng đá hoa cương Ở thể thần kinh, vịt bị viêm màng não có sợi huyết Đường mạch lên thường biểu rõ vùng phù nề Ở giai đoạn cuối, tấc quan nội tạng bao phủ lớp sợi huyết Ngoài ra, gặp tình trạng viêm khớp có mủ vịt bệnh Hình 2.5 Các bệnh tích đại thể phổ biến vịt nhiễm RA (a) Viêm màng bao tim, tích fibrin (b) Viêm màng bao gan (c) Túi khí viêm dày đục xuất huyết (d) Viêm xuất huyết khớp chân (e) Lách sưng, bề mặt đóa hoa cương (Nguồn: Hess cs, 2013) 2.2.6.2 Bệnh tích vi thể Bao tim tích dịch có sợi huyết chứa số tế bào viêm, tế bào đơn nhân bạch cầu trung tính Ở thể cấp, mô tim bị hoại tử điểm nghiêm trọng Ở mô gan, có xâm lấn nhẹ bạch cầu đơn nhân rìa thoái hoái tế bao nhu mô Ở thể cấp tính, xâm lấn tế bào bạch cầu rìa quan sát thấy (Pickrell, 1966) Ở túi khí, tế bào đơn nhân chiếm đa số dịch tiết Trong đó, tế bào đa nhân khổng lồ nguyên sợi bào quan sát thấy thể mãn tính (Dougherty, 1955) Đường hô hấp bị nhiễm RA biểu lâm sàng Phổi không bị ảnh hưởng Chỉ có xâm lấn nhẹ tế bào gia tăng nhanh chóng nốt lympho gần tiểu phế quản (Pickrell, 1966) viêm phổi tiết dịch sợi huyết có mủ (Graham, 1938) Hệ thống thần kinh trung ương tạo sợi huyết viêm màng não với xâm lấn tế bào lympho xung quanh mạch máu não (Jortner cs, 1969) Sự hoại tử mô lympho suy kiệt lympho bào mô tả lách túi bursa fabricius (Sarver, 2005) Hình 2.6 Các bệnh tích vi thể phổ biến vịt nhiễm RA (a) Màng bao tim lấp đầy tế bào đơn nhân bạch cầu hạt bắt màu lưỡng tính (b) Viêm màng não lấp đầy tế bào viêm (c) Viêm vùng mô da lấp đầy bạch cầu trung tính (d) Các tế bào đơn nhân bạch cầu hạt nhuộm màu lưỡng cực vùng gân gót Asin (Nguồn: Hess cs, 2013) 2.2.7 Chẩn đoán Phân lập xác định RA: Hầu hết vi khuẩn phân lập nhanh để chẩn đoán bệnh trường hợp bệnh cấp tính Các mẫu mô thường sử dụng gồm: não, máu tim, túi khí, tủy xương, phổi, gan dịch tiết tổn thương Các phản ứng trung hòa phản ứng AGP sử dụng để xác định serotype RA với kháng huyết đặc hiệu Thử phản ứng sinh hóa phương pháp chẩn đoán phổ biến Ngoài ra, phản ứng phân tử sử dụng để xác định chủng RA nghiên cứu dịch tễ bệnh như: PCR (Christensen, 2010; Yu, 2008), multiplex PCR (Hu, 2011), LAMP (Han, 2011; Zheng, 2011) Chẩn đoán huyết học: Phản ứng miễn dịch huỳnh quang sử dụng để xác định RA mẫu mô bệnh dịch tiết từ vịt bệnh (Marshall, 1961) Phản ứng ngưng kết ELISA sử dụng để phát kháng thể huyết ELISA nhạy so với phản ứng ngưng kết (Hatfield, 1987; Lobbedey, 2003) 2.2.8 Chẩn đoán phân biệt RA nên chẩn đoán phân biệt với bệnh gây nhiễm trùng huyết khác như: P.multocida, E.coli, Salmonella, Streptococcus faecium Nếu dựa vào triệu chứng bệnh tích đại thể khó để chẩn đoán phân biệt bệnh này, cần phải phân lập xác định nguyên gây bệnh xác 2.2.9 Phòng điều trị Những vấn đề quan trọng việc ngăn ngừa RA thực an toàn sinh học, quản lý thực hành vệ sinh chăn nuôi Chuồng trại thông thoáng, giảm yếu tố có nguy gây stress cao mật độ đông đúc, nhiệt độ nóng lạnh Nền sàn nuôi, dụng cụ thiết bị cần vệ sinh định kỳ Hiện nay, có hai loại vắc-xin sử dụng để phòng bệnh RA vịt, bao gồm: vắc-xin chết vắc-sống nhược độc Vắc-xin chết ngăn ngừa làm giảm tỷ lệ tử vong RA (Harry, 1979; Layton, 1984; Sandhu, 1979) Vắc-xin chết chứa serotype 1, sử dụng Mỹ Canada Vịt chủng vắc-xin lúc 2-3 tuần tuổi cho đáp ứng miễn dịch bảo vệ đến xuất thịt (Layton, 1984) Trong đó, vắc-xin sống chứa serotype 1, sử dụng cho vịt ngày tuổi cách phun sương cho uống (Sandhu, 1991) Miễn dịch bảo vệ vịt tới 42 ngày tuổi Vịt đẻ sử dụng vắc-xin sống vắc-xin chết để tạo đáp ứng miễn dịch cho vịt đến 2-3 tuần tuổi thông qua kháng thể mẹ truyền (Sandhu, 1992) Tuy nhiên, Việt Nam chưa có vắc-xin phòng bệnh RA vịt Sự đề kháng kháng sinh RA thay đổi theo thời gian (Zhong, 2009) Kháng sinh sulfamides hoạt chất chứng minh có tác dụng tốt điều trị bệnh RA (bảng ) Bảng 2.1 Một số kháng sinh sulfamides sử dụng điều trị bệnh RA Tên Sulfamethazine Sulfaquinoxaline Novobiocin Lincomycin Penicillin Enrofloxacin Ceftiofur Sulfadimethoxine + Ormetoprim Penicillin + Streptomycin Lincomycin + Spectinomycin Hàm lượng liều sử dụng 0,2-0,25% 0,025-0,05% 0,0303-0,0368% 0,011-0,022% Đường cấp thuốc Uống trộn thức ăn Trộn thức ăn Trộn thức ăn Trộn thức ăn Tiêm da 50 ppm ngày đầu Pha nước uống tiên 25 ppm ngày mg/kgP Tiêm da 0,02-0,12% Trộn thức ăn Tiêm da Tiêm da (theo Ruiz Sandhu, 2013) Mức độ đề kháng cao với RA số kháng sinh chứng minh với tỷ lệ gồm: oxacillin (88,6 %), penicillin G (86,9 %), sulfamethoxazole/trimethoprim (79,2 %), ceftazidime (75,9 %) Mức độ đề kháng thấp amikacin (9,5 %), neomycin (9,5 %) 2.4 Các công trình nghiên cứu Circovirus vịt giới Việt Nam Sau Hattermann cộng (2003) có mô tả đặc điểm, hình thái, cấu trúc Circovirus hai vịt mái Mulard tuần tuổi Đức Hàng loạt nghiên cứu triệu chứng, bệnh tích mà đặt biệt phương pháp chẩn đoán bệnh Circovirus góp phần làm sáng tỏ chẩn đoán nhanh mầm bệnh Những nghiên cứu đó, đóng góp chung vào việc phòng chống bệnh hiệu quả, đem lại lợi ích to lớn cho ngành chăn nuôi công tác thú y giới Fringuelli cộng (2005) ứng dụng phương pháp PCR truyền thống real time PCR chẩn đoán DuCV Kết cho thấy, DNA DuCV phát 85/104 mẫu fabricius (84 %) từ mẫu vịt bệnh chết lứa tuổi đến 12 tuần tuổi 35/37 trại (94 %) dương tính với DuCV Ngoài ra, tác giả đánh giá phương pháp real time PCR có độ nhạy cao so với phương pháp PCR truyền thống Jiang cộng (2008) báo cáo: sử dụng phương pháp PCR để phát giải trình tự gien DuCV vịt Muscovy bệnh tỉnh Fujian , Trung Quốc Theo đó, tỷ lệ mẫu dương tính 79 %, có 10/12 trại dương tính với DuCV Tác giả sử dụng phương pháp PCR để giải trình tự gien cho biết tỷ lệ tương đồng DuCV phân lập tỉnh Fujian (FJ0601) 97,3-97,5 % so với chủng phân lập Đài Loan (TC1/2002, TC2/2002, TC3/2002, TC4/2002), 82,9 % so với chủng phân lập Mỹ 82,3 % chủng phân lập Đức Phân tích trình tự gien DuCV cho thấy genome hoàn chỉnh có độ dài 1988 bp Sự nhiễm ghép DuCV với tác nhân khác như: E.Coli, P multacida, Riemerella anatipestifer hay viêm gan vịt mô tả Các nghiên cứu Zhang cộng (2009) sử dụng phương pháp PCR để điều tra tỷ lệ nhiễm ghép DuCV với RA, E.coli DHV1 vịt Cherry Valley tỉnh Shangdong, Trung Quốc Theo đó, tỷ lệ vịt nhiễm DuCV 33,29% So sánh tỷ lệ vịt dương tính âm tính với DuCV nhiễm ghép với RA là: 23,4 % 8,28 %; với E.coli 16,19 % 4,85 % DHV1 là: 25,5 % 7,47 % Sau đó, Cha cộng (2012) đánh giá tỷ lệ nhiễm ghép DuCV với RA Salmonella vịt nuôi Hàn Quốc Tỷ lệ vịt nhiễm Circovirus 10,9 % Trong đó, tỷ lệ nhiễm ghép DuCV với RA, Salmonella hay DuCV với RA Salmonella là: 4,1 %, % hay 1,4 % Chúng nhận thấy giới có nhiều công trình nghiên cứu đặc điểm bệnh vi-rút gây bệnh, đó, có công trình chẩn đoán DuCV Nhưng Việt Nam chưa có nhiều mô tả bệnh, đánh giá khả nhiễm ghép DuCV tác nhân khác, ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán nhanh DuCV Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm Đề tài nghiên cứu tiến hành từ tháng 05/2015 đến tháng 05/2016 trại vịt siêu thịt nhập ngoại thuộc huyện Trảng Bom, Thống Nhất Gia Kiệm, tỉnh Đồng Nai Các xét nghiệm mẫu bệnh phẩm thực phòng Bệnh lý, xét nghiệm PCR phòng xét nghiệm PCR, Bệnh viện Thú y - Khoa Chăn nuôi Thú y, trường đại học Nông Lâm TP.HCM 3.2 Đối tượng nghiên cứu Vịt siêu thịt nhập ngoại lứa tuổi: vịt Grimaud star (Pháp), vịt Super Meat Bệnh Circovirus bệnh bại huyết Riemerella anatipestifer vịt 3.3 Nội dung nghiên cứu Luận văn có nội dung nghiên cứu chính: - Đánh giá lưu hành DuCV đàn vịt nuôi - Đánh giá mức độ đồng nhiễm DuCV với RA vịt 3.4 Phương pháp vật liệu nghiên cứu 3.4.1 Đánh giá lưu hành DuCV đàn vịt nuôi 3.4.1.1 Phương pháp quan sát, thống kê Chúng tiến hành điều tra thu thập thông tin trại theo phương pháp cắt ngang, số thông tin theo phương pháp hồi cứu từ chủ trại kỹ thuật viên Vịt nhiễm Circovirus thường biểu lâm sàng đặc trưng Do đó, lựa chọn ngẫu nhiên vịt chết rãi rác (không giờ) số lượng nhỏ vịt có biểu chậm lớn, còi cọc bất bình thường phát triển lông (xơ xác, chậm mọc lông hư hại vùng lông dọc sống lưng) Các liệu thu thập thống kê theo mẫu điều tra (xem phụ lục 1) 3.4.1.2 Phương pháp bố trí thu thập vịt phương pháp mổ khám * Bố trí điều tra lấy mẫu: Chúng bố trí thu thập vịt để mổ khám theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên huyện: Trảng Bom, Thống Nhất Gia Kiệm, tỉnh Đồng Nai Số lượng trại khảo sát số mẫu dự kiến sau: Bảng 3.1 Số lượng trại khảo sát số mẫu dự kiến Huyện Số trại dự Số vịt dự kiến lấy Tổng số vịt lấy Giai đoạn kiến khảo trại (con) mẫu (con) tuổi (tuần) 2-5 120 - 300 0-8 sát (trại) Trảng Bom Gia Kiệm Thống 20 20 20 * Bố trí lấy mẫu mổ khám theo tuổi vịt Các mẫu vịt bố trí thu thập để mổ khám theo lứa tuổi sau: < tuần, 2-4 tuần, 4-6 tuần, 6-8 tuần * Phương pháp mổ khám thu thập mẫu Mẫu vịt thu thập tiến hành mổ khám chỗ đưa vịt (còn sống chết không giờ) phòng mổ khám, Bệnh viện Thú y trường đại học Nông Lâm TP.HCM Chúng tiến hành mổ khám vịt theo phương pháp mổ khám toàn diện ngành thú y - Cục Thú y (2006) Chuẩn bị mổ khám Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ mổ khám vô trùng, hóa chất trang thiết bị bảo hộ cho người mổ khám Tiến hành mổ khám Quan sát từ vào trong, kiểm tra quan riêng biệt, ghi lại biểu vào biên mổ khám Tiến hành mổ khám theo trình tự sau: vịt sống, cắt đứt tĩnh mạch cổ hủy não cho vịt chết Đặt vịt nằm ngửa bàn mổ, dùng kéo cắt da vùng bụng vùng bẹn hai bên chân lật chân sang bên Cắt da vùng lỗ huyệt xương lưỡi hái lên đến tận diều bộc lộ vùng ngực Kiểm tra tình trạng khô cơ, xuất huyết đùi, ngực xương lưỡi hái Sau đó, dùng kéo rọc da từ phần mỏ ác lên tới tận mỏ bộc lộ diều, khí quản, tuyến ức để kiểm tra bên Cắt ngang phần lỗ huyệt xương lưỡi hái, cắt tiếp lên phía hai bên sụn qua xương đòn, xương mỏ quạ, loại tổ chức dính Bỏ xương lưỡi hái để bộc lộ xoang ngực, xoang bụng Đến ta quan sát quan nội tạng vịt Các mẫu bệnh phẩm cho vào túi nylon vô trùng, riêng cho xét nghiệm Mẫu bảo quản ngắn -8 0C tiến hành xử lý Cơ quan mẫu thu thập cho xét nghiệm trình bày chi tiết qua bảng 3.2 Bảng 3.2 Mẫu thu thập cho nghiên cứu xét nghiệm bệnh Chẩn đoán Circovirus RA Cơ quan lấy mẫu Gan, túi bursa fabricius Não, swab lỗ huyệt hầu họng 3.4.1.3 Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán Circovirus vịt (bổ sung sau) 3.4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ nhiễm DuCV vịt theo địa phương = (số mẫu cho kết PCR (+) với Circovirus theo địa phương/Tổng số mẫu xét nghiệm Circovirus theo địa phương) x 100 Tỷ lệ nhiễm DuCV vịt theo lứa tuổi = (Số mẫu cho kết PCR (+) với Circovirus theo lứa tuổi/Tổng số mẫu xét nghiệm theo lứa tuổi) x 100 3.4.2 Đánh giá mức độ đồng nhiễm Circovirus với RA Để xác định tỷ lệ nhiễm RA mẫu nghiên cứu, tiến hành nuôi cấy, phân lập RA khẳng định lại kết nuôi cấy kỹ thuật PCR 3.4.2.1 Nuôi cấy, phân lập RA 3.4.2.1.1 Vật liệu hóa chất nghiên cứu Đĩa thạch máu cừu % (Hanil Komed, Seongnam, South Korea) CO2 % Kit API 20E (Bio Merieux, Marcy-I’Etoile, France) gồm: test + thuốc thử (TDA-Tryptophane DeAminase, IND-INDole production, VP-Voges Proskauer) vật dụng phòng nuôi cấy 3.4.2.1.2 Nguyên liệu Não vịt Mẫu swab hầu họng Mẫu swab lỗ huyệt 3.4.2.1.3 Phương pháp nuôi cấy Đồng mẫu mô não trước ủ cấy đĩa thạch máu cừu 10 % ủ 37 0C CO2 5% 48 (hoặc mẫu swab hầu họng, lỗ huyệt nuôi cấy thạch máu 37 0C 24 giờ) Các khuẩn lạc gram âm đặc trưng (đường kính 1-2 mm, mặt lồi, suốt, long lanh) nuôi cấy lần thạnh máu cừu % Tiến hành nhuộm Gram cho khuẩn lạc điển hình Sau đó, khuẩn lạc gram (-) xác định kit API 20E 3.4.2.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán RA (Manju cs, 2014) Các mẫu xét nghiệm RA khẳng định xác lại kỹ thuật PCR * Dụng cụ hóa chất dùng cho phản ứng PCR - Dụng cụ: Tủ cấy vô trùng, máy ly tâm, tủ -70 0C, -20 0C, tủ lạnh, tủ trữ mẫu hóa chất, máy PCR, máy vortex, nguồn bồn điện di, lược gel, khuôn đổ gel, micropipet, đầu tuýp effendorf, máy luân nhiệt, máy đọc gel, máy đo OD… - Hóa chất Hóa chất dùng phản ứng PCR: Master mix gồm thành phần: Taq DNA Polymerase, PCR Buffer (MgCl2, KCl, Tris-HCl) and dNTPs Hóa chất dùng điện di: Dung dịch đệm TBE 10X (Promega), agarose (promega), ladder 100 kp (Promega), ethidium bromide (Invitrogen) * Nguyên liệu Mẫu: môi trường nuôi cấy chứa khuẩn lạc RA Đối chứng dương: ? Đối chứng âm: nước không chứa DNA mẫu * Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA DNA mẫu ly trích từ môi trường nuôi cấy chứa khuẩn lạc RA phương pháp ly giải nhiệt Môi trường mẫu tinh khiết cho vào ml dung dịch PBS đem ly tâm 3000 vòng/ 10 phút 40C, ống mẫu rửa lần PBS Sau đó, mẫu pha loãng lần 100 µl nước cất Dung dịch đun sôi 10 phút làm lạnh nước đá 30 phút Sau ly tâm 3000 vòng/ 10 phút 0C, dung dịch lọc sử dụng DNA mẫu Phản ứng PCR Trong nghiên cứu này, sử dụng cặp mồi theo hướng dẫn Manju cộng (2014) với Taq DNA polymera (Takara Biotechnology Co., Ltd) chu trình nhiệt trình bày qua bảng Bảng 3.3 Trình tự đoạn mồi dùng phản ứng PCR chẩn đoán RA Mồi Mồi xuôi Mồi ngược Trình tự đoạn mồi (5’-3’) TTACCGACTGATTGCCTTCTAG AGAGGAAGACCGAGGACATC Sản phẩm PCR (bp) 546 Tài liệu tham khảo Manju cs (2014) Manju cs (2014) Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR chẩn đoán RA Thành phần Thể tích ((µl) Nồng độ cuối DNA mẫu Master mix 20 Taq DNA polymerase Mồi xuôi 20 pm Mồi ngược 20 pm dNTP 200 µM PCR buffer + KCl 50 Mm + Tris-HCl 10 Mm + MgCl2 1,5 mM Thêm nuclear free water để đạt tổng thể tích 25µl Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt phản ứng PCR phát RA Giai đoạn Tiền biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Kéo dài cuối Nhiệt độ (0C) 95 95 55 72 72 Thời gian phút Số chu kỳ 1 phút 35 phút Điện di sản phẩm PCR Sản phẩm PCR từ thí nghiệm điện di gel agarose % Đun sôi lò viba 550 W phút để agarose tan Để nguội đến 50-55 0C, chuẩn bị khuôn đổ agarose vào khuôn Chờ 30 phút để agarose đông Đặt gel vào buồng điện di Cho TBE 10X ngập gel Đặt mẫu vào giếng với tỷ lệ 1,3 µl loading dye µl sản phẩm PCR Tiến hành điện di 50 V Sau đó, nhuộm ethidium bromide 20 phút Cuối cùng, rửa gel nhiều lần nước để loại bỏ bớt ethidium bromide dính bên gel Chụp hình tia UV tiến hành đọc kết điện di 3.4.2.3 Chỉ tiêu theo dõi + Tỷ lệ nhiễm đơn lẻ Circovirus trại khảo sát = Số mẫu cho kết PCR (+) Circovirus/Tổng số mẫu xét nghiệm Circovirus + Tỷ lệ nhiễm đơn lẻ Circovirus vịt khảo sát = Số mẫu đại diện trại cho kết PCR (+) Circovirus/Tổng số trại xét nghiệm Circovirus + Tỷ lệ nhiễm ghép DuCV RA = Số mẫu nhiễm Circovirus cho kết PCR (+) RA/Tổng số mẫu nhiễm Circovirus đem xét nghiệm RA + Tỷ lệ nhiễm RA mẫu âm tính với DuCV = Số mẫu âm tính với Circovirus cho kết PCR (+) RA/Tổng số mẫu đem xét nghiệm RA 3.4.3 Xử lý số liệu Chúng tiến hành xử lý số liệu trắc nghiệm chi-square test (minitab 16) phần mềm Microsoft Excel 2010