ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THỊ VÂN PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ P10 CỦA VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THỊ VÂN PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ P10 CỦA VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM XUÂN HỘI GS.TS PHAN TUẤN NGHĨA Hà Nội - 2014 MỤC LỤC MỞ ĐẦU i CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS HẠI LÚAError! Bookmark not defined 1.2 BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN VÀ VIRUS SRBSDVError! Bookmark not defined 1.2.1 Bệnh lúa lùn sọc đen Error! Bookmark not defined 1.2.2 Virus lúa lùn sọc đen phƣơng NamError! Bookmark not defined 1.3 ĐẶC ĐIỂM ĐOẠN GEN P10 VÀ PROTEIN VỎ NGOÀI SRBSDV Error! Bookmark not defined 1.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ PHÁT HIỆN SRBSDV Error! Bookmark not defined 1.5 KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ ỨNG DỤNG THỰC TIỄN Error! Bookmark not defined 1.5.1 Giới thiệu chung kháng thể đa dòngError! Bookmark not defined 1.5.2 Một số ứng dụng kháng thể đa dòngError! Bookmark not defined CHƢƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Error! Bookmark not defined 2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT Error! Bookmark not defined 2.1.1 Vật liệu thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.1.2 Hóa chất Error! Bookmark not defined 2.1.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.2.1 Nhân đoạn DNA đặc hiệu kỹ thuật PCR Error! Bookmark not defined 2.2.2 Điện di DNA gel agarose Error! Bookmark not defined 2.2.3 Ghép nối DNA enzyme DNA ligaseError! Bookmark not defined 2.2.4 Biến nạp vi khuẩn E coli Error! Bookmark not defined 2.2.5 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩnError! Bookmark not defined 2.2.6 Tinh DNA từ gel agarose Error! Bookmark not defined 2.2.7 Nhân dòng sản phẩm PCR Error! Bookmark not defined 2.2.8 Phản ứng cắt DNA enzyme cắt giới hạnError! Bookmark not defined 2.2.9 Giải trình tự nucleotide đoạn DNAError! Bookmark not defined 2.2.10 Điện di protein gel polyacrylamide có chứa SDS Error! Bookmark not defined 2.2.11 Nuôi cấy E coli chuẩn bị dịch chiết tế bàoError! Bookmark not defined 2.2.12 Tinh protein tái tổ hợp qua cột Ni2+ agarose Error! Bookmark not defined 2.2.13 Định lƣợng protein cách đo độ hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại (A280) Error! Bookmark not defined 2.2.14 Gây kháng thể đa dòng chuột bạchError! Bookmark not defined 2.2.15 Phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch (Western blotting) Error! Bookmark not defined 2.2.16 Tinh kháng thể IgG cột sắc kí protein A-sepharose Error! Bookmark not defined 2.2.17 Phƣơng pháp Dot Blot Error! Bookmark not defined 2.2.18 Phƣơng pháp ELISA Error! Bookmark not defined 3.1 NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN P10 TỪ cDNA CỦA PHÂN ĐOẠN S10 Error! Bookmark not defined 3.1.1 Nhân đoạn gen P10 phản ứng PCRError! Bookmark not defined 3.1.2 Ghép nối đoạn gen P10 vào vector pGEMTError! Bookmark not defined 3.1.3 PCR kiểm tra có mặt plasmid tái tổ hợpError! Bookmark not defined 3.1.4 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pGEMT mang đoạn gen P10 Error! Bookmark not defined 3.1.5 Giải trình tự đoạn gen P10 chủng SRBSDV Error! Bookmark not defined 3.2 BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP P10 Error! Bookmark not defined 3.2.1 Thiết kế vector biểu pET28a mang đoạn gen P10 Error! Bookmark not defined 3.2.2 Biểu tinh protein tái tổ hợp P10Error! Bookmark not defined 3.3 GẤY KHÁNG THỂ ĐA DÒNG KHÁNG PROTEIN P10 Error! Bookmark not defined 3.3.1 Gây đáp ứng miễn dịch chuột bạchError! Bookmark not defined 3.4 PHÁT HIỆN VIRUS SRBSDV BẰNG KHÁNG THỂ TINH SẠCH Error! Bookmark not defined 3.4.1 Đánh giá độ nhạy kháng thể Error! Bookmark not defined 3.4.2 Phát SRBSDV kĩ thuật ELISAError! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO iii PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined ̉ ̀ LƠI CAM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Hội GS.TS Phan Tuấn Nghĩa ngƣời thầy tận tình bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu để hoàn thành khóa luận Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cán bộ, anh chị em Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp nhiệt tình hƣớng dẫn giúp đỡ nhiều thời gian hoàn thành luận văn Bộ môn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy, cô giáo Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh truyền đạt cho kiến thức quý báu thời gian học tập trƣờng Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè nhiệt tình động viên tạo điều kiện tốt để hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 03 tháng 11 năm 2014 Học viên Phạm Thị Vân ̉ ̉ DANH MỤC BANG BIÊU Bảng 1: Các cặp oligonucleotide sử dụng nghiên cứu Bảng 2: Thành phần phản ứng ghép nố i Bảng 3: Thành phần phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector pGEMT Bảng 4: Enzyme cắ t giới ̣n trình tự nhận biết đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng đề tài Bảng 5: Thành phần gel SDS-PAGE 12 % Bảng 6: Thành phần phản ứng PCR nhân đoa ̣n gen P10 Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pGEMT/P10 Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pGEMT/P10 pET28a Bảng 9: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pET28a/P10 Bảng 10: Các điều kiện cảm ứng biểu protein tái tổ hợp Bảng 11: Kết đo OD492 thử độ đặc hiệu kháng thể phản ứng ELISA Bảng 12: Kết đo OD492 phản ứng ELISA xét nghiệm SRBSDV mẫu rầy DANH MỤC CÁC HÌ NH Hình 1: Triệu chứng lúa bị nhiễm bệnh LSĐ Hình 2: Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền SRBSDV Hình 3: Cấ u trúc vỏ hình đa diện icosahedral kiể u T=13 chi Fijivirus Hình 4: Tinh thể virus phân tử virus SRBSDV phát kính hiển vi điện tử tế bào lúa bị bệnh LSĐ Việt Nam năm 2009 Hình 5: Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoa ̣n gen P10 gel agarose 1% Hình 6: Sơ đồ vector pGEMT vị trí enzyme giới hạn Hình 7: Biến nạp vector tái tổ hợp mang đoa ̣n gen P10 vào tế bào E coli Hình 8: PCR kiể m tra mô ̣t số khuẩ n la ̣c trắ ng Hình 9: PCR kiểm tra khuẩn lạc với thí nghiệm nhân đoa ̣n gen P10 Hình 10: Điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pGEMT/P10 Hình 11: Điê ̣n di sản phẩ m cắ t giới ̣n bằ ng BamHI/XhoI Hình 12: Sơ đồ vector pET28a vi ̣trí ghép nố i đoa ̣n gen P10 Hình 13: Biến nạp vector tái tổ hợp mang đoa ̣n gen P10 vào E coli DH5α Hình 14: Điện di sản phẩm PCR từ khuẩn lạc với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv Hình 15: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid pET28a/P10 Hình 16: Điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pET28a/P10 Hình 17: Biến nạp vector pET28a/P10 vào vi khuẩn E coli Rossetta Hình 18: Điện di SDS-PAGE kiểm tra có mặt protein P10 tái tổ hợp điều kiện chuẩn Hình 19: Kiểm tra có mặt protein P10 tái tổ hợp điều kiện khác nhiệt độ thời gian Hình 20: Điện di sản phẩm sau tinh dịch chiết tế bào Hình 21: Kiểm tra đáp ứng miễn dịch kháng huyết thẩm tách miễn dịch Hình 22: Sắc ký huyết chuột sau gây miễn dịch qua cột protein Asepharose Hình 23: Điện di SDS- PAGE kiểm tra độ tinh kháng thể Hình 24: Phân tích Western blotting sử dụng kháng thể tinh (1:2000) Hình 25: Thử độ nhạy kháng thể tinh Hình 26: Thử độ đặc hiệu kháng thể tinh (1:5000) ́ ́ BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIÊT TĂT APS Ammonium persulphate bp Cặp bazơ CBB Coomassie Brillant Blue cDNA DNA bổ sung dNTPs Deoxy triphosphates nucleotides dsRNA Axit ribonucleotide sơ ̣i đôi E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid ELISA Kỹ thuật phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme- linked immunosorbent assay) EtBr Ethidium Bromide IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside kb Kilobase kDa Kilodalton LB Môi trƣờng Luria Bertani LSĐ Lùn sọc đen ORF Khung đọc mở (open reading frame) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide SRBSDV Virus lúa lùn so ̣c đen phƣơng Nam (Southern rice black strike dwarf virus) TAE Tris base – Acetic - EDTA TBE Tris base – Axit Boric – EDTA TEMED N,N,N'N'-Tetramethyl-Ethylenediamine MỞ ĐẦU Cây lúa (Oryza sativa L.) lƣơng thực lâu đời ngũ cốc quan trọng cung cấp nguồn lƣơng thực cho khoảng 2/3 dân số giới Ở nƣớc ta, lúa trở thành lƣơng thực chủ lực liên quan đến việc làm thu nhập khoảng 80% số hộ nông dân Tuy nhiên, năm gần đây, ngành trồng lúa phải đối mặt với nhiều khó khăn thách thức, thiên tai, biến đổi khí hậu, đặc biệt dịch bệnh xảy thƣờng xuyên ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản xuất lúa gạo Do đặc điểm địa lý khí hậu, Việt Nam giao lộ luồng di chuyển nhiều loại côn trùng, trung gian truyền dịch; bệnh virus có diễn biến phức tạp, lây lan nhanh chóng gây thiệt hại lớn Vào cuối tháng 8/2009, Nghệ An, bệnh lúa lùn sọc đen (LSĐ) bùng phát với diện tích nhiễm bệnh lên tới 5.506 ha, gần 3.510 bị trắng Đến tháng 10/2010 bệnh phát triển gây hại 28 tỉnh miền Bắc Trung với tổng diện tích nhiễm bệnh lên tới 24.000 Bằng phƣơng pháp sinh học phân tử, bƣớc đầu nguyên nhân gây bệnh lạ nêu đƣợc xác định virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam (Southern rice black strike dwarf virus - SRBSDV) Đây thành viên phân nhóm Fijivirus – 2, thuộc họ Reoviridae Hệ gen SRBSDV có chi ều dài 29.124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8 đến 4,5 kb đƣợc đặt tên theo thứ tự tƣ̀ S1 đến S10 dựa vào kích thƣớc phân đoạn RNA sợi đôi Phân đoạn S10 có kích thƣớc nhỏ nhất, mã hóa protein vỏ virus có độ bảo thủ cao nên thƣờng đƣợc chọn nghiên cứu nhằm phát virus chi Fijivirus Việc chẩn đoán bị nhiễm SRBSDV đƣợc thực phƣơng pháp RT-PCR nhằm phát phân đoạn RNA sợi đôi virus có mẫu bệnh Tuy nhiên, phƣơng pháp đòi hỏi kỹ thuật cao, chi phí tốn đồng thời không thuận tiện cho việc tiến hành với điều kiện đồng ruộng Việc xác định tác nhân gây bệnh nhiều thời gian, chi phí cao i dẫn tới khó khăn việc ngăn chặn kiểm soát dịch bệnh làm thiệt hại nhiều hecta sản lƣợng lƣơng thực Vì vậy, việc sớm tìm phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bệnh việc làm vô quan trọng cấp bách Với mục đích biể u hiê ̣n đoa ̣n gen P10 mã hoá protein vỏ virus làm tiề n đề cho việc phát triển kit chẩn đoán nhanh , xác bệnh lúa lùn sọc đen phƣơng Nam dƣ̣a phƣơng pháp ELISA , thực đề tài: “Phân lâ ̣p và biể u hiên gen mã hoá protein vỏ P10 virus gây bệnh lúa ̣ lùn sọc đen Việt Nam” nhằm phục vụ công tác chẩn đoán sớm bê ̣nh ̣i đồ ng ruô ̣ng ii TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Bền (2009), “Bắt bệnh” lúa lùn: Chƣa ngã ngũ nguyên nhân”, Báo Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ngày 24/9/2009 Bô ̣ NN & PTNT (2009), Công điê ̣n (Số 31/CĐ-BNN-BVTV) v/v Cảnh giác đố i với bê ̣nh vàng lùn , lùn xoắn lúa bộc phát lần phía Bắc để phát hiện, phòng trừ kịp thời Hà Viết Cƣờng, Nguyễn Viết Hải, Vũ Triệu Mân (2009), "Xác định nguyên nhân lúa lùn sọc đen (lùn lụi) lúa mùa năm 2009 miền Bắc", Tạp chí BVTV, 6, tr 24-31 Nguyễn Đình Hƣơng (2009), “Nghệ An: Ra quân tiêu diệt nguồn bệnh dịch “lùn lụi” lúa”, Báo Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ngày 14/9/2009 Sao Mai (2009), “Chuyện khẩn cấp Nghệ An: Trên 5.500 lúa HT bị VL – LXL”, Báo Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ngày 7/9/2009 Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh đại cương , Trƣờng Đa ̣i ho ̣c Nông nghiê ̣p I, Hà Nội Vũ Triệu Mân (2010), Bê ̣nh virus hại thực vật ở Viê ̣t Nam, NXB Nông nghiê ̣p Hà Nô ̣i Đinh Văn Thành, Nguyễn Thị Dƣơng, Lại Tiến Dũng, Phan Thị Bích Thu (2008), "Một số kết nghiên cứu sinh thái rầy lƣng trắng phía Bắc Việt Nam", Hội nghị côn trùng toàn quốc Việt Nam lần thứ 6, Hà Nội, 9-10/5/2008, 281-287 Ngô Vĩnh Viễn, Phạm Thị Vƣợng, Nguyễn Nhƣ Cƣờng, Tạ Hoàng Anh, Nguyễn Thị Me, Phan Bích Thu, Phạm Hồng Hiển, Hà Viết Cƣờng (2009), "Kết chẩn đoán bệnh virus lúa lùn sọc đen số tỉnh miền Bắc Việt Nam", Tạp chí BVTV, 6, tr 8-18 iii Tài liệu tiếng Anh 10 Amero S A., James T C and Elgin C R (1994), "Production of antibodies using protein in gel bands" In: Basic Protein and Peptide Protocols Vol.32 (Humana Press, editor), Springer, pp 717-720 11 Caspal D L., Klug A (1962), "Physical principles in the construction of regular viruses", Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 27, pp 1-24 12 Cuong H V., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M., Dale J L (2008), "Design DNA application of two novel degenerate primer pairs for the detection DNA complete genomic characterization of potyvirus", Arch Virol., 153, pp 25-36 13 Cuong H V., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M., Dale J L (2008), “Molecular characterization of begomovirus DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminivirus were present in the Old World prior to continental separation”, J Gener Virol., 89, pp 312-326 14 Dodds J A., Morris T J., Jordan R L (1984), "Plant viral double-stranded RNA", Annu Rev Phytopathol., 22, pp 151-168 15 Goodman M F (2002) "Error-prone repair DNA polymerase in prokaryotes and eukaryotes", Annu Rev Biochem, 71, pp 17 - 50 16 GuoHui Z., Jung W J., Jiang C D., Peng L., Lin X D., Guang Z S (2008), "Southern rice black–streaked dwarf virus: A new proposed Fijivirus species in the family Reoviridae", Chin Sci Bullet., 53, pp 3677-3685 17 Hibino H (1989), "Insect-borne virus of rice", Advances in Disease Vector Research, Springer 6, pp 209-41 18 Hibino H (1996), "Biology and epidemiology of rice viruses", Ann Rev Pathology., Springer 34, pp 249-274 iv 19 Kishimoto R (1979), "Brown planthopper migration", In Brown Planthopper: Threat to Rice Production in Asia, Los Ba˜nos, Philippines: IRRI, pp 113–124 20 Hoang A T., Zhang H M., Yang J., Chen J P., Hebrard E., Zhou G H., Vinh V N., Cheng J A (2011), "Identification, characterization, and distribution of southern rice black-streaked dwarf virus in Viet-nam", Plant Dis., 95, pp 1063–1069 21 Laemmli V K (1970) "Cleavage of structure protein during the assembly of the head of bacterophage T4", Nature 227, pp 680 - 685 22 Lee J Y, Lee S H., Cung B J (1977), "Studies on the occurrence of rice black-streaked dwarf virus in Korea", Korean J Plant Prot., 16, pp.121– 25 23 Li Y., Xia Z., Peng J., Zhou T., Fan Z (2013), "Evidence of recombination and genetic diversity in southern rice black-streaked dwarf virus", Arch Virol., 158, pp, 2147-2151 24 Michael G R., Venigalla B R (2012), "Viral Molecular Machines", Advance in Experimental Medicine and Biology, pp 726 25 Mullis K F., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G and Erlich H (1986) "Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction", Cold Spring Harbor Symposium in Quantitative Biology, 51, pp 263 – 273 26 Sambrook J and Russell D W (2001), Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 27 Shikata E (1974), “Rice black streaked dwarf virus”, CMI/AAB Description of Plant Viruses No 135 28 Studier F W (2005), "Protein production by auto-induction in highdensity shaking cultures", Protein Expr Purif, 41, pp 207 – 234 v 29 Wang Q., Yang J., Zhou G H., Zhang H M., Chen J P., Adams M J (2010), "The complete genome sequence of two isolates of southern rice black-streaked dwarf virus, a new member of the genus Fijivirus", J Phytopathol., 158, pp 733–737 30 Wang Z., Fang S., Xu J., et al., (2003), “Sequence analysis of the complete genome of rice black-streaked dwarf virus isolated from maize with rough dwarf disease”, Virus Genes, 27, pp 163-168 31 Wang Z., Yu D., Li X., et al., (2012), “The Development and Application of a Dot-ELISA Assay for Diagnosis of Southern Rice Black-Streaked Dwarf Disease in the Field”, Viruses, 4, pp 167 - 183 32 Wang Z H., Fang S G., Zhang Z Y., Han C G., Li D W., Yu J L (2006), "Development of an ID-ELISA for the detection of Rice blackstreaked dwarf virus in plants", J Virol Methods., 134 (1-2), pp 61-65 33 Xie L.H (1986), "Research on rice virus diseases in China", Proc Symp Trop Agric Res Trop Agric Res Ser., 19, pp 45–58 34 Yin X., Xu F F., Zheng F Q., Li X D., Liu B S., Zhang C Q (2011), "Molecular characterization of segments S7 to S10 of a southern rice black-streaked dwarf virus isolate from maize in Northern China", Virol Sin., 26, pp 47–53 35 Zhang H M., Yang J., Chen J P., Adams M J (2008), "A black-streaked dwarf disease on rice in China is caused by a novel fijivirus", Arch Virol., 153, pp 1893–1898 36 Zhenchao W., Dandan Y., Xiangyang L., Mengjiao Z., Zhuo C., Liang B., Jiaju L., Linhong J., Deyu H., Song Y and Baoan S (2012), “The Development and Application of a Dot-ELISA Assay for Diagnosis of Southern Rice Black-Streaked Dwarf Disease in the Field”, Viruses, 4(1), pp 167-183 vi 37 Zhou T., Du L L., Fan Y J., Zhou Y J (2012), "Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification of RNA for sensitive and rapid detection of southern rice black-streaked dwarf virus", J Virol Methods, 180, pp 91–95 38 http://viralzone.expasy.org/all_by_protein/260.html vii