Trờng đại học vinh Khoa Sinh học Phạm Thị Lê bớc đầu nghiên cứu số đặc điểm vi khuẩn cố định nitơ tự lostridium đất trồng lạc xã nghi liên -nghi lộc nghệ an Khoá luận tốt nghiệp Chuyên Ngành: di truyền vi sinh Phần I: Đặt vấn đề Nitơ hay gọi đạm nguyên tố đợc ngời ta quan tâm nhiều từ trớc tới Nitơ chiếm khoảng 16%trong prôtêin Nitơ thành phần quan trọng axit Nuclêic Không có nitơ sống Nitơ có mặt chất diệp lục, nhiều loại vitamin, nhiều loại kích tố nhiều hoạt chất quan trọng khác Ngời ta nhận thấy muốn có thu hoạch 12 tạ hạt hecta,cây trồng cần lấy khỏi đất khoảng 30kg nitơ Số lợng nitơ nằm hạt ========================================================== Phạm Thị Lê rơm rạ thân Hiệu suất sử dụng phân hóa học vào khoảng 75% Nh có nghĩa dựa vào nguồn nitơ phân hoá học muốn có hạt phải bón vào hecta khoảng 116,6kg nitơ (tơng đơng với 833kg amôn sunphát) Số lợng nitơ thật khó thỏa mãn nớc có công nghiệp phân nitơ hóa học phát triển Dự trữ nitơ tự nhiên lớn, không khí có đến 78,16% nitơ Ngời ta tính bầu không khí xung quanh trái đất chứa 4x10 15tấn nitơ, khoảng không khí bên km đất đai có khoảng 80.000 nitơ Số lợng nitơ để thoả mãn nhu cầu nitơ trồng sống mảnh đất đó(với thu hoạch 20 tạ/ha)trong khoảng 80 triệu năm Trong thực tế trồng( nh ngời động vật) khả đồng hoá trực tiếp nguồn nitơ lớn lao Sở dĩ nh không khí, phân tử nitơ tồn trạng thái liên kết nguyên tử nitơ lại với nhờ dây nối bền vững(N=N) [3] Trên toàn trái đất năm trồng sử dụng khoảng 100-110 triệu nitơ, phân đạm hoá học tất nớc giới bổ sung đợc khoảng 30% số lợng nitơ bị lấy Trong ngời muốn phá vỡ liên kết phân tử nitơ (N=N)để dễ tạo loại phân hoá học, cần phải sử dụng điều kiện kỹ thuật phức tạp: nhiệt độ cao(6000 C ), áp suất cao(1000atm), chất xúc tác đắt tiền(Os,Ru) có số vi sinh vật có khả đồng hoá dễ dàng thờng xuyên nitơ không khí điêù kiện bình thờng , ngời ta gọi chúng vi sinh vật cố định nitơ.[2] Vi sinh vật cố định nitơ gồm có nhiều loài vi sinh vật sống tự đất nớc Các loài thuộc giống Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas ,Bacillus, Azotobacter,vi khuẩn dinh dỡng quang năng, vi khuẩn sinh mêtan Trong số vi sinh vật sống t đất Azotobacter ,Clostridium vi khuẩn có khả cố định nitơ cao nhất.Khả cố đinh nitơ tự có vi khuẩn nốt sần(Rhizobium) sống cộng sinh rễ họ đậu Tuy nhiên loài sống cộng sinh chúng có tính chọn lọc loại vi khuẩn nốt sần xâm nhiễm lên loài định chúng cố định đợc nitơ nốt sần vi sinh vật sống tự khả cố định nitơ tự không khí cho đất cho có ứng dụng lớn lao sản xuất phân bón vi sinh ========================================================== Phạm Thị Lê Ngời ta dành cố gắng lớn mặt sâu nghiên cứu đặc điểm sinh học nhóm vi sinh vật cố định nitơ tìm cách phát huy cao tác dụng lớn lao chúng, mặt khác tìm cách khám phá bí mật chế cố định nitơ sinh học với hy vọng bớc dẫn đến cải tiến quan trọng ngành công nghiệp sản xuất loại phân nitơ hoá học.[3] Trong điều kiện nớc ta nay, việc nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn cố định nitơ tự có ý nghĩa lớn nhằm để phát huy hết khả cố định nitơ chúng, từ ứng dụng công nghiệp sản xuất phân bón vi sinh Trong chiến lợc phát triển kinh tế năm gần đây, nhà nớc trọng phát triển công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao có lạc.ở Nghệ An, lạc có giá trị kinh tế đợc tỉnh quan tâm đầu t phát triển Từ lý với khuôn khổ đề tài tốt nghiệp cử nhân sinh học mà vào tìm hiểu khả cố định nitơ tự vi khuẩn kị khí Clostridium đất trồng lạc xã Nghi Liên- Nghi Lộc-Nghệ An Mục tiêu đề tài 1.Tìm chủng Clostridium có khả cố định nitơ tự 2.Chọn chủng có khả cố định nitơ tự lớn để nghiên cứu đặc điểm hình thái yếu tố ảnh hởng đến sinh trởng:nhiệt độ, độ ẩm, pH, tìm trị số tối u để chủng sinh trởng phát triển tốt 3.Rèn luyện cho thân số kĩ thực hành, thí nghiệm, phơng pháp nghiên cứu khoa học ========================================================== Phạm Thị Lê Phần II: Tổng luận I Sự phân bố vi sinh vật đất: Khu hệ vi sinh vật đất phức tạp, có đặc điểm sinh lý sinh thái khác Riêng vi khuẩn phong phú Chúng bao gồm vi khuẩn háo khí, vi khuẩn kị khí, vi khuẩn tự dỡng, vi khuẩn dinh dỡng cacbon, vi khuẩn cố định đạm Vi sinh vật sống thành quần thể, loài loài khác có tác động qua lại lẫn nhau, chúng tác nhân chủ yếu trình chuyển hoá vật chất đất Vi sinh vật có mặt tất loài vật nhng chân đất có đầy đủ chất dinh dỡng, kết cấu thành phần giới tốt, có độ ẩm phản ứng môi trờng thích hợp vi sinh vật phát triển nhiều phong phú thành phần Trên chân đất khô hạn, lầy thụt phát triển vi sinh vật bị hạn chế rõ rệt tạo thành khu hệ vi sinh vật đặc biệt: khu hệ vi sinh vật chịu chua, khu hệ vi sinh vật kị khí vi hiếu khí, khu hệ vi sinh vật phát triển môi trờng nhiều H2, CH4 Đất trồng lúa nớc vi sinh vật kị khí chiếm u Các loài vi khuẩn sống tự do, có khả cố định đạm nh : Azotobacter , Clostridium pasteurianum có nhiều đất lúa Hai loại có đặc điểm khác :Azotobacter đòi hỏi có ô xi phân tử, có phản ứng với môi trờng trung tính, có đầy đủ lân, Ca, Mg chất hữu Vì đất lúa có nhiều vùng không tìm thấy Azotobacter vi khuẩn kị khí Clostridium pasteurianum phân bố nhiều đất lúa, số lợng chúng có nhiều gam đất, Chúng góp phần tích cực làm giàu đạm cho đất lúa đất chuyên trồng màu luân canh vụ lúa, vụ màu có điều kiện thông khí tốt, vi sinh vật háo khí phát triển mạnh Quần thể vi sinh vật đất thờng tập trung nhiều đất canh tác, nơi tập trung nhiều rễ đợc bố sung nhờ chất dinh dỡng có chế độ nhiệt , chế độ không khí thích hợp cho vi sinh vật phát triển Các loài vi sinh vật háo khí giảm xuống theo chiều sâu tầng đất, vi khuẩn kị khí phát triển mạnh tầng đất sâu 40-60cm điều kiện đất thoát nớc mạnh, giàu chất dinh dỡng Thời tiết khí hậu chi phối mạnh mẽ đến quần thể vi sinh vật đất Những tháng nóng ẩm có ma rào, ma phùn, cối phát triển tốt thời gian vi sinh vật phát triển mạnh mẽ ========================================================== Phạm Thị Lê Vi sinh vật đất đặc biệt vi sinh vật vùng rễ có mối quan hệ mật thiết với trồng Thời kì hoa, rễ hoạt động mạnh tiết nhiều chất dinh dỡng có tác dụng kích thích vi sinh vật phát triển Vi khuẩn kị khí có khuynh hớng phân bố xa vùng rễ Điều kiện địa hình , khu vực địa lý ảnh hởng không nhỏ vi sinh vật đất Khi điều kiện sinh thái thích hợp với trồng thích hợp với phát triển vi sinh vật đất Sự tác động ngời thông qua việc khai phá đất đai, thâm canh tăng suất trồng làm chi phối mạnh mẽ tới khu hệ vi sinh vật đất Việc cày bừa, xới xáo đất, bón phân làm ải, tới tiêu hợp lý xúc tiến mạnh mẽ phát triển vi sinh vật đất, làm tăng độ phì nhiêu đất tăng suất trồng.[2] II Sơ lợc vi khuẩn Clostridium Năm 1893 lần X.N.Vinogradxki phát đợc loại vi khuẩn kị khí sống tự có khả cố định nitơ phân tử, Clostridium pasteurianum Tế bào Clostridium pasteurianum có kích thớc khoảng 2,5-7,5x0,71,3 đứng riêng rẽ, xếp thành đôi hay xếp thành chuỗi ngắn Khi non có tế bào chất đồng đều, có khả di động Khi già, tế bào chất có cấu tạo hạt, tế bào khả di động Bào tử thờng có hình bầu dục hay hình kéo dài nằm hay gần đầu tế bào Bào tử có kích thớc lớn bề rộng tế bào dinh dỡng, mang bào tử tế bào thờng có hình thoi Kích thớc bào tử khoảng 1,3à.x1,6.à Hiên loài Clostridium pasteurianum ngời ta nhận thấynhiều loài Clostridium khác có khả cố định nitơ phân tử loài: C.butyricum, C butylicum, C beijerinckia, C aceticum, C multifermentans, C Acetobutylicum, C felsineum, C kluyveri, C lactoacetafilum, C.madisonii Sự khác đặc điểm hình thái sinh lý loài đợc thấy rõ khoá phân loại Bergey(1965) Vi khuẩn thuộc loài Clostridium pasteurianum thờng có hoạt tính cố định cao loài Clostridium khác Khi đồng hoá hết 1g thức ăn bon, chúng thờng tích luỹ đợc khoảng 5-10mg nitơ Khả cố định nitơ loài chi Clostridium phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy Clostridium có khả đồng hoá monosaccarit, disaccarit số ========================================================== Phạm Thị Lê polisaccarit(nh tinh bột, dextrin) Chúng đồng hoá nhiều rợu bậc cao số hợp chất chứa bon khác Khi lên men hidratcacbon, Clostridium thờng làm tích luỹ axit hữu butanol, etanol, axeton, CO2, H2 Thành phần tỷ lệ sản phẩm lên men phụ thuộc vào loại vi khuẩn nh phụ thuộc vào hai pha khác trình lên men Chẳng hạn Clostridium axetobutylicum thờng làm tích luỹ pha đầu axit axetic, axitbutiric pha sau butanol, axeton etanol Clostridium pasteurianum nh nhiều loài Clostridium có khả cố đinh nitơ khác phát triển đợc phạm vi pH rộng (pH =4,78,5) Tuỳ nghiên cứu mà pH thích hợp phát triển Clostridium 5,9-8,3,hay 6,9-7,3 Các nghiên cứu Việt Nam cho biết vùng đất chua, không tìm thấy phát triển Azotobacter Clostridium có mặt với số lợng đáng kể Nói chung gam đất trồng lúa, miền bắc nớc ta, số lợng vi khuẩn nhóm có từ hàng vạn đến từ hàng triệu tế bào Số lợng chúng vùng rễ trồng nhiều vùng rễ Clostridium thờng tập trung nhiều lớp đất cày nhng độ sâu 75cm thấy có hàng ngàn tế bào gam đất (Nguyễn Lân Dũng, 1960, 1969) Bào tử Clostridium có sức đề kháng cao nhiệt độ cao khô hạn Một số nghiên cứu cho biết bào tử loài vi khuẩn sống đợc đến nhiệt độ 750C nhiệt độ 800C Bao tử số chủng Clostridium chịu nhiệt nhiệt độ 1000 C sống đợc 30phút Các loài Clostridium diện đất ,một số loài nhóm gây bệnh cho ngời động vật, số loại khác gây h hỏng thực phẩm khử sunphur tạo nên màu đen gây mùi khó chịu Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng C botulinum C perfringens.[14] III Vòng tuần hoàn Nitơ tự nhiên Cây không đồng hoá trực tiếp nitơ hữu Trong thực tế trồng nhận đợc nguồn nitơ lớn nhờ trình phân giải vi sinh vật chất hữu có mặt đất đa vào đất (phân rác, phân xanh, phân chuồng) Quá trình gọi trình a môn hoá trình thối rữa Nếu đất bị ngập nớc không đủ ôxi muối amôn đợc tạo thành tích luỹ lại đất, nhng đất có đầy đủ ôxi NH đợc oxi hoá ========================================================== Phạm Thị Lê thành nitrit tiếp ôxi hoá thành nitrat (Quá trình nitrat hoá) Nitrat dạng hợp chất nitơ đợc trồng hấp thụ cách dễ dàng Ngợc lại với trình nitrat hoá trình phản nitrat hoá, tức trình khử nitrat thành nitơ phân tử Bên cạnh trình phản nitrat hoá vi sinh vật có trình phản nitrat hoá hoàn toàn hoá học (Phản ứng HNO2với axit amin amit) Sau trình phản nitrat hoá, nitrat chuyển thành nitơ phân tử bay vào không khí Những tổn thất nitơ trình phản nitrat hoá gây nên đợc bù đắp lại nhờ trình sinh học đặc biệt gọi trình cố định nitơ, tức trình chuyển hoá nitơ phân tử thành hợp chất chứa nitơ Nhóm vi sinh vật có khả thực trình đợc gọi vi sinh vật ccố định nitơ, chúng có tác dụng làm giàu thêm nguồn dự trữ thức ăn nitơ đất _ _ n_ n n2 Sự phân giải Động vật thực vật Tự không khí Protein xác hữu Thực vật n2o Nấm vi khuẩn phân giải xác hữu Cây họ đậu Amon nh3 Đồng hoá amon hoá Nitrit - no2 Khử nitrat Nitri - Nitrat no no2 Nitrat hoá Hình 1: Chu trình nitơ tự nhiên IV Cơ chế trình cố định Nitơ phân tử Trong công nghiệp sản xuất phân hoá học việc chuyển hoá N thành dạng hợp chất nitơ (muối amôn, urê, nitrat) cần tiêu tốn nhiều lợng Số lợng để tổng hợp NH3 tơng đơng với số lợng sinh đốt cháy than đá Trong vi sinh vật cố định nitơ chế thờng xuyên chuyển hoá đợc N2 thành hợp chất ========================================================== Phạm Thị Lê chứa nitơ điều kiện bình thờng áp suất nhiệt độ Nếu khám phá đợc chế trình cố định nitơ vi sinh vật rõ ràng mở triển vọng to lớn việc cải tiến toàn trình sản xuất phân nitơ hoá học Đa số nghiên cứu cho thấy rằng:Quá trình cố định nitơ sinh học trình khử N2 thành NH3 dới tác dụng men nitrogenaza sinh vi sinh vật Nitrogenaza thu đợc từ dịch chiết vô bào lấy từ tế bào vi sinh vật cố định nitơ Nitrogenaza hệ phức enzim Chúng cấu tạo thành phần prôtêin có phân tử nhỏ Một thành phần gọi prôtêin sắt gọi nitrogenaza khử hay thành phần II Một thành phần khác gọi prôtêin sắt-Molipden hay gọi thành phần I Thành phần II đợc nghiên cứu Clostridium pasteurianum gồm tiểu phần đồng nhất, tiểu phần có khối lơng 29.000, có trung tâm chứa nguyên tử Fe nguyên tử S không ổn định với axit Thành phần I(Mo-Fe prôtêin ) Clostridium pasteurianum phức tạp có khối lợng phân tử chung 220.000 gồm nguyên tử Mo, khoảng 30 nguyên tử Fe nhiều nguyên tử S không ổn định với axit Chúng có cấu tạo tiểu phần gồm loại, loại có khối lợng phân tử 50 loại có khối lợng phân tử 60.000 Dalton Mỗi loại gồm hai tiểu phần Nitrogenaza không xúc tác việc khử N2 thành NH3 mà xúc tác việc khử CH3 CN, HCN, NH3,N2 O, C2H2 thành sản phẩm tơng ứng Phản ứng khử N2 dới xúc tác nitrogenaza biểu thị vắn tắt nh sau: Nitrogenaza N2 + 6e + 12ATP + 12 H2O 2NH4++ 12ADP + 12Pi + 4H+ Ngời ta cho trình khử bao gồm nhiều phản ứng sử dụng lợng ATP ========================================================== Phạm Thị Lê N2 2H+ ATP 2H+.ATP [NH = NH] +2H ATP [NH2 -NH2] 2NH3 Sơ đồ giả thuyết trung tâm hoạt động nitrogenaza đợc trình bày nh sau: Electron chất khử (feredoxin, ditionit)đi vào trung tâm có chứa Fe thành phần en zim II(prôtêin -Fe)và tiếp tục chuyển cho thành phần en zim I(prôtêin -Fe-Mo).Electron hoạt hoásẽ theo mạch nguyên tử Fe để đến Mo bên "hạt Tại Mo bị khử nhờ có khả phẳn ứng nhanh chóng với N2 Phân tử N qua khe có kích thớc khoảng 4-5 Ao tức tơng ứng với chiều dài phân tử N2 vào bên men đợc hoạt hoá Kết trình Nitrogen hoạt hoá hấp phụ hoá học Nitơ làm dứt dây nối số dây phân tử N Năng lợng tiêu phí 7,8x105J/mol Dây nối thứ cắt đứt tiếp xúc với hidro đợc hoạt hoá nhờ men đehirogenaza hệ thống hidrogenaza Sau NH3 sản phẩm khử khác đợc sinh liên kết với ketoaxit để tạo thành axitamin [2] Hiệu suất trình cố định đạm loại kị khí cao so với loại hiếu khí Khi sử dụng hết 1g thức ăn cacbon Clostridium pasteurianum thờng chuyển hoá đợc lợng N2 Azotobacter khoảng 4- lần Trong khi phân giải thức ăn cacbon Clostridium pasteurianum nhận đợc số lợng Azotobacter đến 45 lần Nh tính theo đơn vị lợng nhân đợc loại kị khí cố định đạm đợc nhiều loại hiếu khí tới 6-10 lần [6] V Sử dụng vi sinh vật có khả cố định Nitơ nông nghiệp Vi sinh vật cố định nitơ đóng vai trò quan trọng việc thực vòng tuần hoàn nitơ nông nghiệp Các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do(háo khí kị khí) có khả làm giàu thêm hàng năm khoảng 15-16kg nitơ cho đất đai(tơng đơng với 75-300kg đạm sun phát) Các loại tảo lam sống ruộng lúa có khả đem lại cho đất năm khoảng 15-80 kg nitơ Một hecta trồng đạu năm cố định từ 50-600kg nitơ Để tăng khả ========================================================== Phạm Thị Lê cố định nitơ vi khuẩn nốt sần ngời ta tiến hành nuôi cấy vi khuẩn nốt sần tạo chế phẩm Nitragin để bón vào đất hay tẩm hạt giống thuộc đậu tơng ứng trớc gieo trồng, Nitragin có khả làm nâng cao suất đậu khoảng 10-15% [2] Chế phẩm Azotobacter gọi làAzotobacterin Đối với loại đất có chứa nhiều chất hữu cơ, dễ hấp thụ Azotobacterin làm tăng suất khoảng 6-10% sản lợng trồng.Là loại phân có chứa vi sinh vật trực tiếp hút nitơ không khí chuyển hóa vào đất thông qua vi sinh vật tự dỡng háo khí ,nghĩa làm thức ăn cho vi sinh vật sau chết để lại chất dinh dỡng hữu ,đạm dễ tiêu cho đất Vì điều kiện để vi sinh vật hoat động nghiêm ngặt :đất phải chua, lợng lân dễ tiêu,chất hữu ,một số nguyên tố vi lợng phải dồi Kĩ thuật phổ biến thờng ngâm với hạt giống trớc gieo Tại Việt Nam áp dụng thử phân Azotobacterin nhng cha có hiệu rõ rệt Đã có nhiều thí nghiệm sử dụng chế phẩm Clostridium pasteurianum (dịch nuôi cấy dịch nuôi cấy trộn với đất khử trùng) để bón cho trồng Trong số trờng hợp thu đợc hiệu dơng tính rõ rệt(nhất phối hợp với Azotobacterin ) Tuy nhiên hiệu thờng không ổn định ngời ta cha giải thích đợc cách dứt khoát trờng hợp có tác động dơng tính chủ yếu cố định nitơ tích luỹ chất có hoạt tính sinh học cao.[3] 10 ========================================================== Phạm Thị Lê Sinh trởng phát triển thuộc tính sở sinh vật Theo Blachman, sinh trởng tăng trởng kích thớc, thể tích, số lợng phát triển biến đổi đặc tính sinh lý, sinh hoá qua giai đoạn sinh trởng Rõ ràng việc nghiên cứu cá thể tế bào vi khuẩn nhỏ khó Do nói đến sinh trởng phát triển vi khuẩn tức đề cập đến sinh trởng phát triển quần thể Quần thể vi khuẩn nuôi cấy klhông liên tục sinh trởng theo đờng cong gồm pha : Số lợng tế bào Pha luỹ thừa Pha cân Pha tử vong Pha tiềm phát H Đờng cong sinh trởng quần thể thể vi khuẩn nuôi cấy không liên thời gian tục - Pha tiềm phát(pha lag): Pha tính từ lúc bắt đầu cấy đến vi khuẩn đạt đợc tốc độ cực đại Trong pha lag vi khuẩn cha phân chia(nghĩa cha có khả sinh sản) nhng thể tích khối lợng tế bào tăng lên rõ rệt trình tổng hợp chất trớc hết cao phân tử(prôtêin ,ezim, axitnuclêic )diễn mạnh mẽ Độ dài pha lag phụ thuộc vào tuổi ống guống thành phần môi trờng -Pha luỹ thừa(pha log): Vi khuẩn sinh trởng phát triển theo luỹ thừa nghĩa sinh khối số lợng tế bào tăng theo phơng trìnhN=N0x2ct , kích thớc tế bào, thành phần hoá học, hoạt tính sinh lý nói chung không thay đổi theo thời gian tế bào trạng thái động học xem nh tế bào tiêu chuẩn - Pha ổn định :quần thể vi khuẩn trạng thái cân động học, số tế bào sinh số tế bào cũ chết Kết số tế bào sinh khối không tăng không giảm Nguyên nhân tồn pha ổn định tích luỹ sản phẩm độc trao đổi chất(các loại rợu, axit hữu cơ) việc cạn chất dinh dỡng(thờng chất dinh dỡng có nồng độ thấp) - Pha tử vong số lợng tế bào sống giảm theo luỹ thừa(mặc dù số lợng tế bào tổng cộng không giảm) 21 ========================================================== Phạm Thị Lê Vi sinh vật phát triển môi trờng đặc hình thành khuẩn lạc đặc trng cho loài Ta đo kích thứơc loài khuẩn lạc riêng biệt để tốc độ sinh trởng loài nhanh hay chậm Theo dõi sinh trởng chuẩn vi khuẩn cách xác định kích thớc đờng kính khuẩn lạc(sau ngày lần) Bảng 2.1: Sự sinh trởng chủng Ngày 14/10/06 15/10/06 16/10/06 17/10/06 18/10/06 19/10/06 20/10/06 P(%) C1 1,5 Đờng kính khuẩn lạc (mm) C2 C3 C4 1,2 C5 1,0 0,6 2,8 1,3 1,5 0,9 86% 66% 50% 50% 1,9 46% Qua bảng ta thấy sinh trởng chủng sau ngày là: Chủng C1 đạt 86% có tốc độ sinh trởng mạnh Sau đến chủng C đạt tốc độ sinh trởng 66%, chủng C3 chủng C4 có tốc độ sinh trởng 50% Chủng C5 có tốc độ sinh trởng yếu 46% Từ ta phân lập chủng C1 sử dụng để làm thí nghiệm II Hoạt tính cố định nitơ chủng Đánh giá định tính Từ chủng phân lập đợc, dùng que cấy lấy chủng vi sinh vật cho vào ống nghiệm chứa 2ml nớc cất Cho thuốc thử Nessle vào , lắc nhẹ, quan sát, kết thu đợc nh sau: Bảng 2.2: Hoạt tính cố định nitơ chủng Ngày C1 C2 C3 C4 26/10/2006 + + + + Nhận xét: Các chủng có phản ứng dơng tính (+) với thuốc thử Nessle cho màu vàng cam Chứng tỏ chủng có khả cố định nitơ phân tử Xác định số lợng vi sinh vật 22 ========================================================== Phạm Thị Lê Để xác định số lợng vi sinh vật dùng phơng pháp CFU(Colony Forming unit) tính kết theo tiêu chuẩn quốc tế FDA(Food and Drug Asminisstration) đề xuất Tiến hành - mẫu ban đầu pha loãng theo thập phân - Cấy 0,1ml nồng độ pha loãng vào hai đĩa - Nuôi 300C 3-5 ngày - Xác định số lợng khuẩn lạc đĩa petri Kết thu đợc nh sau : Bảng 2.3: Vi sinh vật độ pha loãng Độ pha loãng 10-2 Đĩa Đĩa 342 365 10-3 189 223 Số lợng vi sinh vật 5.086 x 105 (CFU/ml) Khả cố định nitơ chủng Tiến hành: Dùng que cấy lấy chủng vi sinh vật với số lợng nh Sauđó cấy vào ống nghiệm chứa ml môi trờng lỏng Sau khoảng ngày xác định hàm lợng NH4+ phơng pháp so màu quang phổ bớc sóng =415nm theo Sapiro(1972) Kết thu đợc nh sau : Bảng 2.4: Hàm lợng amôn chủng Hàm lợng amôn (mg/l) Chủng Xi C1 C2 1,8 1,91 1,82 1,75 1,72 1,81 X X 1,86 0,075 1,860,075 1,76 0,037 1,760,037 23 ========================================================== Phạm Thị Lê C3 C4 1,71 1,68 1,59 1,74 1,72 1,65 1,66 0,05 1,660,05 1,7 0,03 1,70,03 Qua bảng ta thấy :trong điều kiện môi trờng, số vi sinh vật, pH,nhiệt độ ,độ ẩm ,thời gian ta thấy hàm lợng NH4+ chủng sau ngày nuôi cấy: chủng C1 cao đạt 1,86 mg/l sau đến chủng C đạt 1,76 mg/l, chủng C4 đạt 1,7mg/l chủng C3 yếu đạt 1,66mg/l Từ ta chọn chủng C1 có khả cố định nitơ mạnh giữ lại để nghiên cứu, tìm điều kiện pH, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp cho vi khuẩn phát triển mạnh để áp dụng vào thực tiễn Và qua biểu đồ sau thấy rõ hơn: NH4+ (mg/l) chủng C1 C2 C3 C4 Biểu đồ 1.1: So sánh khả cố định nitơ chủng qua biểu đồ cho thấy: Chủng C1 có khả cố định nitơ lớn nhất(1,86 mg/ml), thứ hai chủng C2 (1,76 mg/ml), thứ ba chủng C4 (1,7 mg/ml), thấp chủng C3 (1,66mg/ml) Do chọn chủng C1 tốt để thực nghiên cứu 24 ========================================================== Phạm Thị Lê Chơng III: Các yếu tố ảnh hởng đến khả cố định Nitơ I ảnh hởng pH pH môi trờng có ý nghĩa quan trọng sinh trởng phát triển nhiều vi sinh vật Sự thay đổi nồng độ ion H + môi trờng làm ảnh hởng đến trạng thái ion hoá bề mặt tế bào vi sinh vật, ảnh hởng đến trạng thái ion hoá enzim ảnh hởng đến trình trao đổi chất lợng chúng Do cần phải tìm hiểu ảnh hởng độ pH hi vọng qua tìm pH thích hợp cho hoạt động cố định nitơ vi sinh vật Các giá trị pH (cực tiểu, tối thích, cực đại) cần cho sinh trởng sinh sản vi khuẩn tơng ứng với giá trị pH cần cho hoạt động nhiều enzim Giới hạn pH hoạt động vi sinh vật khoảng - 10 Đa số vi khuẩn sinh trởng tốt giá trị pH trung tính(7,0) Đờng biểu diễn ảnh hởng pH đến vận tốc phản ứng nhiều ezim có dạng 100 % Hoạt độ cực đại 50 H.4 Đờng biểu diễn minh hoạ ảnh hởng pH đến tốc độ phản ứng enzim pH thích hợp cho hoạt động ezim vào khoảng Tuy nhiên có số ezim có pH thích hợp thấp (pepxin, prôtêinaza axit vi sinh vật) cao (subtilizin, pH thích hợp >10).[1] pH thích hợp ezim liên quan đến cấu trúc di truyền chúng nên tìm hay xác định đợc pH tối thích cần thiết để điều chỉnh hoạt tính enzim cho có hiệu Với phơng pháp nêu, công thức thí nghiệm có pH khác nhau, hàm lợng amon thu đợc nh sau: 25 ========================================================== Phạm Thị Lê Thời gian (h) 24 48 72 X CT1 1,65 1,66 1,66 1,65 Bảng 3.1: ảnh hởng pH Độ pH hàm lợng NH4+ (mg/ l) CT2 CT3 CT4 1,68 1,70 1,67 1,70 1,77 1,70 1,73 1,82 1,72 1,70 1,76 1,69 CT5 1,66 1,66 1,67 1,66 đây: CT1: pH = 5; CT2: pH = 6; CT3: pH = 7; CT4: pH = 8; CT5: pH = Và xác định hàm lợng amon sau 24h lần Qua bảng 3.1 pH ta thấy: pH = có hàm lợng amon lớn (1,76 mg/l) pH = 6, pH = cho kết tơng tự (1,7 mg/l 1,69 mg/l) Từ cho thấy pH trung tính thích hợp cho vi sinh vật hoạt tính cố định nitơ lớn nhất, vùng pH = - > có kết cao pH = kết thấp Chứng tỏ vi sinh vật thích ứng pH rộng từ 5->9 Nh khả sử dụng vi sinh vật lớn Biểu đồ sau thấy rõ điều đó: NH4+ (mg/l) pH Biểu đồ 3.1: So sánh ảnh hởng pH Qua biểu đồ cho thấy hàm lợng amon đợc tích luỹ theo hớng tăng dần từ pH = -> sau giảm dần từ pH = đến pH = Nh pH = tối u biến thiên hàm lợng amon theo pH tăng giảm quanh pH trung tính 26 ========================================================== Phạm Thị Lê II ảnh hởng nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hởng lớn đến đời sống vi sinh vật chúng mẫn cảm với nhiệt độ Thông thờng nhiệt độ ảnh hởng đến hoạt tính ezim vi sinh vật Teo định luật Vanhop điều kiện tiêu chuẩn nhiệt độ tăng 10 0c tốc độ phản ứng tăng hai lần Kt +10 Q10= Kt đây: Kt: Hằng số tốc độ phản ứng nhiệt độ t Kt + 10 số tốc độ phản ứng nhiệt độ tăng 100c Đờng biểu diễn ảnh hởng nhiệt độ đến tốc độ ezim có dạng: 100 % Hoạt độ cực đại 50 H.5 Đờng biểu diễn minh hoạ ảnh hởng nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzim t Nhiệt độ ứng với hoạt độ ezim cao gọi nhiệt độ hoạt động thích hợp ezim Đa số ezim có nhiệt độ hoạt động thích hợp khoảng 30 - 400 Tuy nhiên nhiệt đô hoạt động enzim không cố định thay đổi tuỳ chất, pH môi trờng, thời gian phản ứng Với mật độ vi sinh vật, pH, độ ẩm phù hợp thu đợc từ kết trên, tìm hiểu ảnh hởng nhiệt độ đến khả cố định nitơ thu đựơc kết sau: Bảng 3.2: ảnh hởng nhiệt độ Thời gian (h) 24 48 20 1,66 1,66 Nhiệt độ ( 0C ) 30 40 1,7 1,67 1,76 1,68 27 50 1,66 1,66 ========================================================== Phạm Thị Lê 72 X 1,67 1,66 1,80 1,75 1,71 1,68 1,67 1,66 Qua bảng ta thấy: 300 C có hàm lợng NH4+ lớn (1,75 mg/l) 400C có hàm lợng NH4+ (1,68 mg/l) 200C 500C hàm lợng NH4+ thấp (1,66 mg/l) 1,67 mg/l Căn vào kết thu đợc ta rút kết luận nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật phát triển hoạt tính cố định nitơ lớn 300C Trong vùng từ 300 C đến 400 C có hàm lợng NH4+ cao Chứng tỏ nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật phát triển khoảng 300 C đến 400 C Qua biểu đồ sau thấy rõ hơn: NH4+ (mg/l) Nhiệt độ 20 30 40 50 Biểu đồ 3.2: So sánh ảnh hởng nhiệt độ Qua đồ thị ta thấy: Hàm lợng NH4+ thu đợc tăng dần từ nhiệt độ 200C đến 300C giảm dần từ 300C đến 500C Nh vậy, nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn Clostridium điều kiện thí nghiệm 300C 28 ========================================================== Phạm Thị Lê III ảnh hởng độ ẩm Độ ẩm yếu tố quan trọng môi trờng ảnh hởng không nhỏ đến đời sống vi khuẩn Đa số vi khuẩn thuộc loại sinh vật a nớc Trong tế bào vi khuẩn nớc chiếm 75 - 85% Nớc hoà tan chất dinh dỡng trớc hấp thụ vào tế bào, phản ứng sinh hoá tế bào vi sinh vật xảy đợc có nớc Độ ẩm ảnh hởng vi sinh vật mức độ khác Tế bào dinh dỡng giai đoạn sinh trởng mạnh mẽ cần nhiều nớc nhất, tế bào già, hình thành bào tử cần đến nớc Có loại vi sinh vật thích nghi vói môi trờng ngập nớc, có loại sinh vật lại có khả chịu khô hạn cao Tuy nhiên điều kiện khô trình sinh trởng sinh sản vi sinh vật bị hạn chế, nhiều vi khuẩn chuyển sang dạng bào tử Phần lớn loại vi sinh vật đất phát triển mạnh mẽ độ ẩm đồng ruộng 60 - 80% Việc đảm bảo chế độ ẩm đất có ý nghĩa định đến hoạt tính sinh học đất Đất thiếu ẩm trình hoạt động vi sinh vật bị hạn chế điều kiện đất khô hạn (độ ẩm < 40% độ ẩm bão hoà) hầu nh trình sinh học đất bị ngừng trệ Yêu cầu vi sinh vật nớc đợc biểu thị độ hoạt động nớc môi trờng : aw = p p0 P: áp lực dung dịch P0: áp lực nớc Nớc nguyên chất có aw = 1, hoà tan thêm chất hoà tan (đờng, muối vv ) vào nớc trị số aw nhỏ dần Vi khuẩn thờng phát triển đợc aw môi trờng vào khoảng 0,93 đến 0,99 Để theo dõi ảnh hởng độ ẩm (RH) đến cố định nitơ vi khuẩn, dùng mẫu làm sấy khô Sau dùng nớc cất vô đạm (nớc cất hai lần) cho vào đất, điều chỉnh độ ẩm Độ ẩm đợc kiểm tra máy Huminity/ Thermometer HANA Anh Kết thu đợc bảng sau: Bảng 3.3: ảnh hởng độ ẩm đến cố định nitơ Thời gian NH4+ công thức (mg/100g) 29 ========================================================== Phạm Thị Lê (h) CT1 CT2 CT3 24 5,5 7,0 6,5 48 72 6,0 6,8 8,3 9,2 7,2 7,5 96 6,2 8,5 7,0 6,1 8,2 7,1 Với điều kiện nh ( khối lợng đất, pH, nhiệt độ, số lợng vi sinh vật) CT1: Độ ẩm 50%, CT2 độ ẩm 75%, CT3 độ ẩm 100% Từ bảng cho thấy CT1: Hàm lợng amon 6,1 mg/100g, CT2 8,2 mg/100g, CT3 7,1 mg/ 100g Nh CT2 có hàm lợng amon lớn tiếp CT3, CT1 Nh độ ẩm 75% có đợc kết cao nhất, nghĩa điều kiện chúng đồng hoá đợc nhiều nitơ hơn, độ ẩm 50% 100% có kết thấp Sự sai khác thấy rõ biểu đồ sau: X NH4+ (mg/100g) RH 50% 75% 100% Biểu đồ 3.3: So sánh ảnh hởng độ ẩm Qua biểu đồ cho thấy hàm lợng NH4+ thu đợc tăng dần từ độ ẩm 50% đến 75% giảm dần từ độ ẩm 75% đến 100% Nh vậy, độ ẩm thích hợp cho Clostridium điều kiện thí nghiệm 75% 30 ========================================================== Phạm Thị Lê Phần V: Kết luận đề nghị I Kết luận: Qua nghiên cứu rút kết luận sau: 1) đất trồng lạc xóm 17 xã Nghi Liên Nghi Lộc Nghệ An đất cát pha, pH trung tính Kết phân lập đợc chủng có khả cố định nitơ 2) Theo dõi thời gian xuất vi khuẩn Khuẩn lạc xuất sau ngày nuôi cấy, số khuẩn lạc tăng lên nhanh chóng sau ngày nuôi cấy, sau giảm dần Nh với vi khuẩn thời gian phải từ đến ngày 3) Tốc độ sinh trởng chủng Sự sinh trởng sau ngày nuôi cấy Chủng C1 đạt 86%, chủng C2 đạt 66%, chủng C3, C4, C5 sinh trởng yếu tốc độ gần nh ngang Nh chủng C1 chủng có khả sinh trởng tốt chủng khuẩn lạc tròn, đều, lồi, mép phẳng, có màu trắng đục, cấu trúc đồng nhất, đờng kính lớn 1,5 mm 4) Thử hoạt tính cố định nitơ kết cho thấy chủng C có khả cố định nitơ cao dùng chủng để nhân lên tìm hiểu yếu tố ảnh h ởng đến khả cố định nitơ chủng 5) Với số lợng vi sinh vật không đổi, thực nghiệm chủng C1 cho thấy điều kiện thích hợp cho chủng hoạt động cố định nitơ có hiệu cao pH = 7, nhiệt độ: 300C, độ ẩm 75%, thời gian 72h II Đề nghị 31 ========================================================== Phạm Thị Lê Do thời gian nghiên cứu có hạn, tìm hiểu sinh trởng, đặc điểm hình thái vi khuẩn Clostridium chọn chủng có khả cổ định nitơ mạnh để tìm hiểu số tiêu tốt cho sinh trởng phát triển chủng nh pH, nhiệt độ, RH, thời gian Bên cạnh cần nghiên cứu sâu chủng đổi với số chủng khác, áp dụng việc sử dụng trực tiếp chủng vi khuẩn trộn với đất trồng lạc ảnh hởng chúng sinh trởng phát triển lạc Đông thời nghiên cứu để sản xuất chể phẩm Clostridium góp phần phục vụ cho việc nâng cao suất trồng Tài liệutham khảo Phạm Thị Trân Châu Hoá sinh học, NXB GD - 1997 Đờng Hồng Dật cộng (1997) Giáo trình vi sinh vật học trồng trọt - NXB Nông nghiệp 32 ========================================================== Phạm Thị Lê Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty - VSV học, NXB GD (1980) Nguyễn Lân Dũng - vi sinh vật đất chuyển hoá hợp chất bon Nitơ - NXB KHKT (1984) Nguyễn Lân Dũng, thực tập vi sinh vật học - NXB "MIR" Maxcơva (1983) Nguyễn Lân Dũng - vi sinh vật học tuyển tập - NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Thành Đạt - Hớng dẫn thực hành vi sinh vật học - NXB Giáo dục Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng, Sinh Học VSV- NXB GD (2001) Nguyễn Danh Đông, Cây lạc (1984) NXB QG Hà Nội 10 Vũ Minh Đức - Thực tập VSV học, NXB GD 2001 11 E Gorop N.X (1983) Thực tập VSV NXBĐH trung học chuyên nghiệp, Ngời dịch Nguyễn Lân Dũng 12 Lê Văn Khoa cộng - Phơng pháp phân tích đất, nớc, phân bón trồng, NXB GD 13 Nguyễn Mời cộng (1979) Giáo trình thực tập thổ nhỡng NXB NN 14 Nguyễn Dơng Tuệ - Các phơng pháp Nghiên cứu VSV học - 2003 15 Dơng Đức Tiến - Vi khuẩn lam cố định Nitơ ruộng lúa(1999) NXB Nông Nghiệp 16 Trần Cẩm Vân - Giáo trình VSV học môi trờng - NXB ĐHQG Hà Nội 17 Nguyễn Kim Vũ (1995) - Kết nghiên cứu khả ứng dụng phân vi sinh nông nghiệp, VSV học CNSH mục lục phần I Đặt vấn đề.1 phần II Tổng luận.4 I Sự phân bố vi sinh vất đất II.Sơ lợc vi khuẩn Clostridium. 33 ========================================================== Phạm Thị Lê III.Vòng tuần hoàn nitơ tự nhiên.7 VI.Cơ chế trình cố định nitơ phân tử V Sử dụng vi sinh vật có khả cố định nitơ nông nghiệp 10 Phần III Địa điểm, thời gian Phơng pháp nghiên cứu 12 I Địa điểm nghiên cứu....12 II Thời gian nghiên cứu 12 III phơng pháp nghiên cứu .12 3.1 Phơng pháp điều tra 12 3.2 Phơng pháp thu mẫu vi sinh vật 12 3.3 Phơng pháp phân lập vi sinh vật 12 3.4 Phơng pháp theo dõi .14 3.4.1 Thời gian mọc vi khuẩn 14 3.4.2 Theo dõi sinh trởng .14 3.4.3 Tìm hiểu đặc điểm khuẩn lạc14 3.4.4 Thử hoạt tính cố định nitơ chủng. 15 3.5 Xác định số lợng vi sinh vật theo phơng pháp CFU .15 3.6 Các yếu tố ảnh hởng đến sinh trởng 16 3.6.1 ảnh hởng độ ẩm.16 3.6.2 ảnh hởng pH 17 3.6.3 ảnh hởng nhiệt độ 17 3.7.Phơng pháp xử lý số liệu .17 Chơng II: Đặc điểm vi khuẩn Clostridium 20 I Phân lập vi khuẩn Clostridium. 20 Đặc điểm Clostridium 20 Quy trình phân lập 21 Kết 22 II Sinh trởng chủng23 III Đặc điểm khuẩn lạc 25 IV Hoạt tính cố định nitơ chủng.26 Đánh giá định tính26 Xác định số lợng vi sinh vật 26 Khả cố định nitơ chủng 27 34 ========================================================== Phạm Thị Lê Chơng III: Các yếu ảnh hởng đến khả cố định nitơ 29 I.ảnh hởng pH 29 II.ảnh hởng nhiệt độ 31 III ảnh hởng độ ẩm.33 Phần IV Kết luận đề nghị 37 I Kết luận.37 II Đề nghị 37 35 ========================================================== Phạm Thị Lê