Bộ giáo dục đào tạo Trờng đại học vinh Khoa Sinh học - Lê thị thu lan Đề tài: Bớc đầu nghiên cứu số đặc điểm vi khuẩn Clostridium cố định nitơ đất trồng ngô xã hng lợi - hng nguyên - nghệ an Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh Giáo viên hớng dẫn - GVC: Nguyễn Dơng Tuệ lời cảm ơn Luận văn đợc thực đạt kết nhờ vào phần nỗ lực, cố gắng, mệt mài, nghiêm túc công tác nghiên cứu khoa học thân Cũng suốt trình thực hiện, nhận đợc giúp đỡ thầy cô giáo, ngời thân bạn bè Trớc hết xin chân thành gửi lời cảm ơn tới thầy giáo Nguyễn Dơng Tuệ tận tình, chu đáo giúp đỡ suốt trình hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo khoa Sinh học, phòng thí nghiệm Di truyền Vi sinh Phơng pháp, phòng thí nghiệm Hoá sinh trờng Đại Học Vinh tất bạn bè, ngời thân giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực Đặc biệt, qua xin chân thành cảm ơn nhân dân, cán xóm 6- xã Hng Lợi tận tình giúp đỡ để luận văn đợc hoàn thành Tuy có nhiều cố gắng, song thân đề tài tránh khỏi thiéu sót Tôi mong nhận đợc đóng góp ý kiến thầy cô bạn Tôi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên: Lê Thị Thu Lan Lớp:43E1 Sinh mục lục Mở Đầu Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài . Phần I: Tổng quan tài liệu I Định nghĩa phân bón .. II Phân bón vi sinh vật III Tình hình nghiên cứu nớc 3.1 Tình hình nghiên cứu phân vi sinh 3.2 ứng dụng thực tiễn phân bón vi sinh học Việt Nam 3.3 Tình hình nghiên cứu Clostridium pasteurianum IV Đặc điểm chung vi khuẩn Clostridium pasteurianum V Đặc điểm bào tử VI Vòng tuân hoàn nitơ t nhiên VII Cơ chế trình cố định nitơ phân tử .11 Phần II: Đối tợng, nội dung, phơng pháp, địa điểm thời gian nghiên cứu15 I Đối tợng nghiên cứu 15 II Thời gian nghiên cứu 15 III Địa điểm phơng pháp thu mẫu 15 IV Phơng pháp nghiên cứu 16 4.1 Phơng pháp phân tích số tiêu nông hoáthổ nhỡng 16 4.2 Phơng pháp nuôi cấy vi sinh vật 17 4.3 Phơng pháp xác định vi sinh vật 18 4.4 Phơng pháp phân lập 18 4.5 Phơng pháp theo dõi tiêu sinh trởng phát triển 19 4.6 Phơng pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Clostridium 20 4.7 Một số phơng pháp khác 20 4.8 Một số phơng pháp kiểm tra enzim.21 4.9 phơng pháp xác định khả đồng hoá nitơ chủng22 4.10 phơng pháp xử lý số liệu22 V Nghiên cứu yếu tố ảnh hởng đến khả đồng hoá nitơ. 23 5.1 ảnh hởng pH.23 5.2 ảnh hởng nhiệt độ 23 5.3 ảnh hởng độ ẩm 23 5.4 ảnh hởng thời gian. 23 Phần III: Kết nghiên cứu 25 I Một số đặc điểm khu vực nghiên cứu 25 II Kết qủa phân tích số tiêu nông hoá 25 Kết xác định pH 25 Kết phân tích NH4+trong đất 27 III Kết định lợng vi khuẩn Clostridium mẫu đất IV Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Clostridium 29 V Đặc điểm khuẩn lạc 31 VI Kết khẳng định vi khuẩn Clostridium 32 6.1 Kết nuôi ống thạch sâu 32 6.2 Thử nghiệm môi trờng lỏng .33 6.3 Thử hoạt tính catalaza 33 VII Sinh trởng chủng chọn.33 VIII Khả cố định nitơ phân tử chủng 35 IX Xác định khả đồng hoá nitơ chủng 36 X Các yếu tố ảnh hởng đến cố định nitơ phân tử .37 ảnh hởng pH 38 ảnh hởng nhiệt độ 39 ảnh hởng độ ẩm ..41 ảnh hởng thời gian .42 XI Số lợng vi khuẩn cần sử dụng . 44 - 45 kết luận kiến nghị I II Kết luận Kiến nghị 46 48 Tài liệu tham khảo .49 - 50 Mở đầu Đặt vấn đề: Vi sinh vật có vai trò quan trọng trình hình thành phát triển đất nh trình sinh trởng phát triển trồng: vi sinh vật tham gia vào trình hình thành mùn làm cho đất tơi xốp, tăng khả giữ độ ẩm cho đất, tác dụng trực tiếp đến phân giải khoáng hoá hợp chất hữu cơ, nhóm vi sinh vật có khả cố định nitơ khí Nhờ đặc tính vi sinh vật kết hợp với chất mang để sản xuất phân bón sinh học làm tăng độ màu mỡ đất nâng cao chất lợng trồng Vi sinh vật cố định nitơ vi sinh vật có khả sử dụng nitơ phân tử khử thành NH Có nhóm có khả cố định nitơ phân tử là: nhóm sống cộng sinh nhóm sống tự Trong nhóm sống tự cố loài hiếu khí, kỵ khí vi khuẩn lam Và loài vi sinh vật có ý nghĩa không nhỏ trình cố định nitơ phân tử cho hệ sinh thái đất vi khẩn kỵ khí Clostridium pasteurianum [7] Clostridium pasteurianum loài vi khuẩn kỵ khí, sinh bào tử ,có khả cố định nitơ cao Khi đồng hoá hết 1g thức ăn cácbon, chúng tích luỹ đợc khoảng 10(mg) nitơ.[7] Do hiểu biết loài vi kkhuẩn hệ sinh thái đất cần thiết Vi sinh vật có tác dụng tốt đói với tính chất lý hoá sinh họccủa đất, tham gia trình chuyển hoá hợp chất hữu cơ, chất khoáng góp phần nâng cao dinh dỡng đất đồng thời vi sinh vật có tác dụng bảo vệ môi trờng sinh thái Bên cạnh giá trị thiết thực cho nông nghiệp, phân bón vi sinh kiến tạo nông nghiệp ổn định, bền vững gắn liền với nông nghiêp hữu Việc sản xuất phân bón sinh học góp phần giảm bớt nguy ô nhiễm môi trờng, đồng thời trả lại cho đất mà lấy Cây ngô (zemay SL) lơng thực có giá trị kinh tế không nhỏ nông nghiệp nớc ta nói riêng số nớc giới, nguồn nuôi sống 1/3 số dân toàn giới Cây ngô có nguồn gốc từ loại hoang dại miền trung nớc Mêhicô nớc ta ngô lơng thực đứng thứ hai sau lúa với diện tích tăng dần qua năm đến năm 2010 đạt 750.000 Từ trớc tới nay, ngô loài lơng thực đặc trng nớc ta số vùng dân c ven sông Lam nh huyện Hng Nguyên nói riêng [3] Sông Lam sông lớn Nghệ An hàng năm bồi đắp lợng phù sa lớn cho vùng đất nơi nh khu vực Hng Nguyên, Nam Đàn Đây điều kiện tốt, thuận lợi để phát triển nghề trồng ngô số loài khác nh: lạc, đỗ, vừng, nhng vai trò cố định nitơ vùng đất cha đợc nghiên cứu Để tìm hiểu chất dinh dỡng đất nh tìm hiểu khả cố định nitơ phân tử, tạo màu mỡ cho đất nơi việc tìm kiếm, phân lập, tuyển chọn chủng loài vi khuẩn kỵ khí Clostridium giúp chúng tacó thể xác định khả cung cấp phân đạmcho cây, biết đợc lợng nitơ cần thiết diệnn tích cụ thể,có thể xác định nhu cầu cung cấp thêm phân vi sinh cố định nitp - đạm sinh học, xác định lợng bón phân cân đối hợp lý để nâng cao suất ngô Đồng thời góp phần vào việc điều tra khai thác tài nguyên sinh vật có ích phục vụ sản xuất II Mục tiêu đề tài: Chúng tiến hành nghiên cứu vấn đề nhằm: Điều tra tình hình sản xuất ngô địa phơng Hng Lợi Hng Nguyên Nghệ An kỷ thuật canh tác, tình hình sử dụng loại phân bón, suất, Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Clostridium có khả cố định nitơ phân tử tồn đất ngô xã Hng Lợi Hng Nguyên Nghệ An Nghiên cứu số đặc điểm sinh học nh khả cố định nitơ tự Và lựa chọn chủng Clostridium pasteurianum có khả cố định nitơ lớn Nghiên cứu ảnh hởng số yếu tố điều kiện sống nh, độ ẩm, pH đến đời sống chủng chọn Từ đa trị số tối u để ứng dụng vào sản suất phân đạm vi sinh Rèn luyện cho thân số kỷ thực hành, thí nghiệm, làm quen với phiơng pháp nghiên cứu khoa học Phần I: Tổng quan tài liệu I Định nghĩa phân bón: Các chất đa vào đất có tác dụng trực tiếp cải thiện dinh dỡng thực vật cải thiện tính chất đất- gọi phân bón Phân bón đợc chia làm hai nhóm: - Nhóm phân khoáng không chứa chất hữu cơ, bao gồm: phân nitơ, phôtphat, Kali, Magiê, phân hỗn hợp, phân Bo, phân Molipđen - Phân hữu gồm: phân chuồng, phân than bùn, phân xanh, phân rác Ngoài có phân vi sinh bớc đầu đợc sử dụng để tăng cờng trình sinh học đất góp phần bảo vệ môi trờng Ngoài tác dụng trực tiếp tăng suất, phân bón có tác dụng lớn đến việc tạo đất thâm canh mà lâu ngời sử dụng ý tới Những khiếm khuyết chế độ dinh dỡng đất bổ cứu đợc biết đầu t lao động mà phải đầu t vật chất thông qua bón phân để nâng cao dự trữ dinh dỡng mức dễ tiêu nguyên tố Nhiều nghiên cứu khẳng định: Năng suất trồng cao, lợng dinh dỡng lấy nhiều nhu cầu phân bón lớn Tuy nhiên, việc sử dụng phân bón hoá học gây nguy ô nhiễm môi trờng, làm giảm khả chống chịu trồng dẫn đến bùng nổ dịch bệnh, ảnh hởng không tốt đến chất lợng nông sản nguyên nhân tất yếu dẫn đến thoái hoá đất canh tác Tồn d sản phẩm hoá học nàyđã tích luỹ hệ sinh thái trở thành mối đe doạ nghiêm trọng sức khoẻ ngời môi sinh Chẳng hạn nh: phân chuồng phân bắc không hợp vệ sinh gây nhiều bệnh đờng hô hấp, tiêu hoá,ảnh hởng đến sức khoẻ cộng đồng Phân vô thuộc nhóm chua sinh lý: K 2SO4, (NH4)2SO4, Supe lân tồn d axit làm chua hoá đất, dẫn đến làm nghèo kiệt ion bazơ làm xuất nhiều chất độc mà chủ yếu là: Al 3+, Fe2+, Mn2+ di động có hại cho cây, làm giảm hoạt tính sinh lý đất Ngoài bón nhiều đạm bón muộn phân đạm cho rau làm tăng đáng kể hàm lợng NO3- nh hại đến sức khoẻ ngời Do việc sử dụng phân bón vi sinh vật có tác dụng nâng cao suất chất lợng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô góp phần quan trọng bảo vệ môi trờng, xây dựng nông nghiệp bền vững [2] II Phân bón vi sinh vật: Phân bón vi sinh vật phân bón chứa nhiều chủng vi sinh vật sống, hữu hiệu đợc tuyển chọn mà hoạt động chúng có tác dụng tạo đất trồng chất dinh dỡng chất sinh học có tác dụng nâng cao suất trồng, chất lợng nông sản cải tạo đất Phân bón vi sinh vật không gây ảnh hởng xấu đến ngời, vật nuôi môi trờng sinh thái [17] Các loại phân bón vi sinh kể đến phân vi sinh vật cố định nitơ- đạm sinh học Và đề tài hớng tới khả ứng dụng phân bón vi sinh cố định nitơ phân tử đơn chủng với loài vi khuẩn Clostridium pasteurianum III Tình hình nghiên cứu nớc: 3.1 Tình hình nghiên cứu phân vi sinh: Năm 1895-1900 Anh, Mỹ, Balan Nga bắt đầu sản xuất chế phẩm vi sinh vật cố định nitơ phân tử [17] Năm 1964 vấn đề cố định nitơ phân tử đợc coi hai vấn đề quan trọng chơng trình sinh học quốc tế [17] Hiện vấn đề nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh đơn chủng đa chủng (tổng hợp) đợc xã hội đặc biệt quan tâm nhà nông nghiệp, nhà vi sinh Việt Nam, phân vi sinh cố định đạm đợc nghiên cứu từ bớc đầu năm 60 Nhng phải gần 30 năm sau, nghĩa tới năm 1987 có quy trình sản xuất hoàn thiện Từ năm 1991, mời đơn vị toàn quốc tập trung phân vi sinh vật cố định đạm cho loại trồng khác Hai đơn vị đầu công tác nghiên cứu ứng dụng phân vi sinh vật là: Viện công nghệ sinh học(Trung tâm khoa học tự nhiên công nghệ quốc gia) Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam- Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn [16] 3.2 ứng dụng thực tiễn phân bón vi sinh học Việt Nam: Nớc ta nớc nông nghiệp, nhu cầu phân bón lớn, với việc sử dụng phân bón hoá học phân bón sinh học bớc đầu đợc đa vào ứng dụng nông nghiệp nớc ta Phân bón vi sinh góp phần tăng suất trồng mà góp phần bảo vệ môi trờng Năm 1980 trờng đại học Cần Thơ thử nghiệm sản xuất thành công chế phẩm Vidana cho đậu Viện khoa học kỹ thuật Việt Nam trờng đại học Nông Nghiệp I sản xuất thử nghiệm chế phẩm Nitragin cho đậu tơng lạc số tỉnh miền Bắc đồng sông Hồng thu đợc kết tốt.[16] Quá trình sản xuất phân vi sinh cố định nitơ chất mang không khử trùng đợc ứng dụng(1999) xí nghiệp phân vi sinh Sơn TâyCông ty phân bón Pháp Vân- Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn sản xuất, làm tăng suất lúa 12,02%-19,5%; ngô tăng 10,2%-1097%; chè tăng 26,7%; lạc tăng 23,7%; đồng thời giảm bớt 30% phân NPK chè, 20% phân NPK lúa, 50% lân lạc đảm bảo suất.[16] Chế phẩm Vidafo dùng nhiễm khuẩn cho lạc Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp miền Nam đồng sông Cửu Long làm tăng suất lạc 13,8%- 17,5% miền Bắc miền Trung; tăng 22% miền Nam.[16] Và với chế phẩm đơn chủng, đặc biệt với Clostridium pasteurianum đờng mở cho nhà nghiên cứu khoa học sinh học, nhà nông nghiệp 3.3 Tình hình nghiên cứu Clostridium pasteurianum: Năm 1893 lần X.N Vinogradxki phát đợc loài vi khuẩn kỵ khí sống tự có khả cố định nitơ phân tử Đó loài Clostridium pasteurianum.[7] Hiện loài Clostridium pasteurianum ngời ta phân lập thấy có nhiều loài Clostridium khác có khả cố định nitơ phân tử Đó loài: C.butyrium, C.butylicum, C.beiferinkia, C.aceticum, Đã có nhiều chế phẩm thí nghiệm sử dụng chế phẩm Clostridium pasteurianum để bón cho trồng Trong số thu đợc hiệu dơng tính rõ rệt Tuy nhiên, hiệu không ổn định Cn4, Cn6, Cn7) Còn số chủng lại phát triển yếu phát triển bề mặt Những chủng phát triển tốt làm tách đôi mặt thạch sâu chứng tỏ loài vi khuẩn kỵ khí Clostridium pasteurianum Còn chủng phát triển bề mặt bị chết bị loại bỏ (Cn5, Cn8) Kết phù hợp với phơng pháp nghiên cứu Nguyễn Thành Đạt (1980) 6.2 Thử nghiệm môi trờng lỏng : chủng đợc lựa chọn, tiếp tục thử nghiệm Cấy vào môi trờng lỏng nuôi điều kiện nh Kết quả: Cả chủng phát triển tốt phía dới đáy ống chứa môi trờng lỏng Chứng tỏ loài kỵ khí 6.3 Thử hoạt tính Catalaza : chủng Clostridium pasteurianum kỵ khí gen Catalaza Thử hoạt tính Catalaza tác dụng phân giải hyđrô peroxit (H2O2) Dới tác dụng enzim này, H 2O2 phân giải tạo O2 bay lên (sủi bọt): H2O2 Catalaza H2O + ẵ O2 Kết thu đợc bảng (bảng 5): + : Sủi bọt - : Không sủi bọt Bảng 5: Kết thử hoạt tính H2O2 : chủng Hoạt tính H2O2 Chủng Hoạt tính H2O2 Cn1 Cn5 + Cn2 Cn6 Cn3 Cn7 Cn4 Cn8 + Qua bảng nhìn thấy: có chủng có hoạt tính Catalaza chủng hoạt tính Catalaza Các chủng không sủi bọt cho phản ứng phân giải hyđrô perôxit chứng tỏ chủng kỵ khí 100% (Cn1;Cn2;Cn3;Cn4; Cn6;Cn7) Còn chủng có phản ứng dơng tính (sủi bọt) chủng không chắn loài kỵ khí loài hiếu khí (chủng Cn5, Cn8) VII Sinh trởng chủng chọn: 27 Sinh trởng tiêu vô quan trọng vi sinh vật Biết đợc quy luật sinh trởng chúng điều chỉnh đợc chúng sinh trởng tiếp ứng đợc mục đích sử dụng Thông thờng đờng cong sinh trởng vi khuẩn gồm pha nh sau: Pha (1): pha tiềm phát Pha (3): pha cân Pha (2): pha luỹ thừa (pha log) Pha (4): pha suy vong Số lợng vi sinh vật (3) (4) (2) (1) Thời gian [12] Đờng cong sinh trởng vi khuẩn thể qua pha: [8] Đôi sau cấy vào môi trờng mới, vi khuẩn không sinh sản thời gian Điều nhiều nguyên nhân, chẳng hạn lấy bào tử dạng tiền sinh phải cần thời gian định chúng nảy mầm Trong vài đầu, tế bào cấy vào cha thích nghi với điều kiện môi trờng biến đổi điều kiện theo hớng cần thiết Thời kỳ kìm hãm sinh trởng ban đầu - đợc gọi tiền phát Cuối pha tế bào bắt đầu sinh trởng với tốc độ tăng dần (quá trình sinh trởng tế bào bắt đầu sớm trình sinh sản) Sau pha thời kỳ vi khuẩn sinh trởng với tốc độ riêng không đổi sau khoảng thời gian xác định số lợng tế bào tăng lên gấp đôi [9] Việc xác định trình sinh trởng tế bào riêng biệt nuooi cấy môi trờng đặc Vi khuẩn sinh trờng đặc hình thành khuẩn lạc đặc trng cho loài Vì ta đo kích thớc khuẩn lạc riêng biệt để xem tốc độ sinh trởng khuẩn lạc nhanh hay chậm Và nghiên cứu vi khuẩn ngời ta thờng nghiên cứu sinh trởng quần thể Quá trình sinh trởng đạt đến mức độ định hình thành sinh sản số lợng tăng lên 28 Vì việc miêu tả khuẩn lạc xác dịnh tốc độ sinh trởng vi khuẩn moọt việc cần thiết công tác định tên loài vi sinh vật nghiên cứu tính đợc số thé hệ dự đoán đợc số lợng tế bào sau thời gian nuôi cấy định.từ đa ứng dụng sản xuất Theo dõi sinh trởng vi khuẩn cách xác định kích thớc () khuẩn lạc (sau ngày lần) Kết thu đợc bảng 8: Bảng 8: Sinh trởng cuẩ chủng: Đờng kính khuẩn lạc (nm) Ngày Cn1 Cn2 Cn3 Cn4 Cn6 Cn7 01/12/06 0,7 1,0 1,2 0,9 1,5 1,5 04/12/06 1,4 2,2 2,6 1,9 2,9 3,5 P(%) 100 120 116 111 93 133 Nh qua bảng ta nhận thấy: chủng có độ sinh trởng mạnh Cn7 , sau đến chủng Cn2, Cn3, Cn4, Cn1 cuối chủng Cn6 có tốc độ sinh trởng yếu Sự sinh trởng sau ngày chủng Cn 100%, Cn2 120%, Cn3 160%, Cn4 111%, Cn6 93% Cn7 133% Nên ta phân lập sử dụng chủng sinh trởng mạnh Cn7 vào thực tiễn để làm thí nghiệm 29 VIII Khả cố định nitơ phân tử chủng : Các chủng đợc nuôi môi trờng đĩa thạch yếm khí điều kiện (nhiệt độ, độ ẩm, pH, thử hoạt tính cố định nitơ sau ( sau 24h) Đo đờng kính vùng có phản ứng với: D: Đờng kính vòng vàng cam (phản ứng NH3) (nm) d: Đờng kính vòng vàng nhạt (phản ứng prôtêin) (nm) Bằng Digital micrometer Tính sai dị, kết thu đợc bảng : Bảng : Kết đo D d (nm) So sánh D d : Thời gian Các D d D-d (24 h) chủng Cn1 Cn2 Cn3 Cn4 Cn6 Cn7 (nm) 2,5 3,6 2,7 2,1 3,2 3,3 (nm) 1,3 1,2 1,1 1,2 1,4 2,2 (nm) 1,2 2,4 1,6 0,9 1,8 1,1 Ngày 18/11/2006 D (%) 48,00 66,67 59,25 42,85 56,25 33,33 Qua bảng cho ta thấy: hiệu số D d chủng Cn lớn (2,4nm) chứng tỏ chủng có khả cố định nitơ phân tử lớn Các chủng có khả cố định nitơ thấp (1,6 1,8 nm) là: Cn3;Cn4; Cn7 Còn lại chủng Cn1, Cn7 có khả cố định nitơ yếu (1,1 1,2 nm) IX Xác định khả đồng hoá nitơ chủng : Quá trình đồng hoá nitơ phân tử trình biến đổi từ N NH3 nhờ enzim vi sinh vật Để đánh giá khả đồng hoá chủng, xác định lợng amon thu đợc dịch nuôi phơng pháp trình bày Qua theo dõi đo liên tiếp ngày lần Sau ngày kết thu đợc nh bảng sau (bảng 7) : 30 Bảng : Hàm lợng NH4+ đồng hoá đợc chủng : Chủng Ngày đo Lợng NH4+ (mg/100ml dung dịch) Cn1 Cn2 Cn3 Cn4 Cn6 Cn7 20/11/2006 0,81 0,88 0,82 0,35 0,84 0,86 21/11/2006 0,90 0,97 0,95 0,49 0,74 0,89 22/11/2006 0,98 1,05 0,99 0,53 0,87 0,84 23/11/2006 1,87 1,97 1,69 1,45 1,23 1,69 24/11/2006 1,24 1,55 1,60 1,31 1,09 1,49 Trung bình 1,16 1,28 1,21 0,82 0,95 1,15 Qua bảng nhận thấy: lợng NH4+ thu đợc sau ngày đo liên tục cho ta thấy: lợng NH4+ cao chủng Cn2 va Cn3 (1,28 1,21) Sau chủng Cn1 Cn7 (1,16 1,15) mức trung bình.Còn chủng có lợng NH4+ thấp là: Cn4 Cn6 (0,82 0,95 mg NH4+/50ml dịch) Nhìn chung, chủng có khả cố định cao ngày thứ thứ nuôi môi trờng lỏng Sau giảm dần ngày thứ ngày sau Điều với thực tế: lợng chất dinh dỡng môi trờng giảm dần nên khả cố định chúng giảm dần Theo T.S Nguyễn Thành Đạt, T.S Nguyễn Lân Dũng (1978, 1981) Clostridium pasteurianum hoạt tính cố định nitơ 10 12mg nitơ sử dụng hết 1g chất hữu Điều có ý nghĩa thiết thực việc sử dụng phân bón hữu vi sinh Nh từ chủng có khả cố định lớn là: Cn 2,chúng lựa chọn chủng để thực nghiên cứu X Các yếu tố ảnh hởng đến cố định nitơ phân tử : 10.1 ảnh hởng pH : pH có ảnh hởng đến đời sống vi sinh vật,đặc biệt ảnh hởng đến trạng thái iôn hoá bề mặt enzim làm thay đổi hoạt tính enzim nh khả 31 cố định nitơ phân tử Theo dõi ảnh hởng pH đến biểu tích luỹ amon hoá môi trờng nuôi chủng Cn2 thu đợc kết bảng 11: Bảng 11: ảnh hởng pH đồng hoá nitơ: Độ pH pH = pH =5 pH =6 pH =7 pH =8 Hàm lợng NH4+ (mg/100 ml dịch chủng Cn2) 1,08 1,14 1,26 2,90 1,90 Hình 3: Liên quan pH hàm lợng Amôn Qua bảng 11 biểu đồ cho thấy: khả cố định nitơ điều kiện pH rộng từ axit đến kiềm: pH = lợng amôn 1,08 pH = lợng amôn 1,90 Chủng vi khuẩn phát triển tốt nh khả cố định nitơ lớn ở: pH =6 với lợng amôn 1,26 ( mg NH4+ /100 ml dịch chủng ) 2,90 ( mg NH4+ mg/100 ml dịch chủng nuôi ) kết thu đợc tố pH =7 pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển 32 Nh vậy: điều kiện pH thay đổi vi khuẩn có khả cố định nitơ Và, pH thích hợp cho vi khuẩn pH =7 Điều phù hợp với kỹ thuật phân bón phân hữu bón vôi trồng trọt tạo dinh dỡng cho vi sinh vật điều kiện pH thích hợp cho vi sinh vật phát triển 10.2 ảnh hởng nhiệt độ : Nhiệt độ có vai trò lớn phản ứng enzim Và ảnh hởng lớn đến Nitrogenaza xúc tác cho trình biến đổi nitơ phân tử thành amôn Với pH tối u, tiếp tục nghiên cứu ảnh hởng nhiệt độ mối liên quan nhiệt độ với hàm lợng amôn để từ tìm nhiệt độ thích hợp cho trình cố định nitơ Với phơng pháp trình bày trên, số liệu phân tích đợc nêu bảng (bảng 12): Bảng 12 : ảnh hởng nhiệt độ đồng hoá nitơ : Nhiệt độ ( 0C ) 20 30 40 50 60 Hàm lợng NH4+ (mg/100 ml dịch chủngCn2) 1,00 1,56 2,74 1,38 0,94 Qua bảng 12 nhận thấy: + nhiệt độ 30C hàm lợng amôn 1,56 + nhiệt độ 40C hàm lợng amôn 2.74 + nhiệt độ 50C hàm lợng amôn 1,38 Chủng phát triển mạnh có khả cố định cao nhiệt độ 20 - 40C, đặc biệt 40C(2,74mg/100ml dịch chủng) phát 33 triển yếu 60C Chứng tỏ loài vi khuẩn không sống đợc nơi khô hạn Điều chứng minh cho thực tế : Vùng đất ven bờ Sông Lam hệ sinh thái thích hợp cho loài vi khuẩn Clostridium pasteurianum phát triển Điều dễ thấy rõ qua biểu đồ sau (hình 4): Hình : Liên quan nhiệt độ hàm lợng Amôn Qua hình cho thấy: - Hoạt động cố định nitơ tăng dần từ 20 400C giảm dần 40 600C - nhiệt độ 400C hàm lợng amôn lớn tức hoạt động cố định nitơ mạnh Và nhiệt độ tối thích chủng nghiên cứu 10.3 ảnh hởng độ ẩm (RH %): Độ ẩm có ảnh hỏng lớn để cố định nitơ vi khuẩn Nghiên cứu ảnh hởng độ ẩm với hàm lợng amôn để từ tìm độ ẩm thích hợp cho trình cố định nitơ Với nhiệt độ tối thích 400C ,tiêp tục theo dõi RH=5%; 50%;75% 100% thu đợc kết theo bảng (bảng 13) : Bảng 13 : ảnh hởng độ ẩm đồng hoá nitơ : Độ ẩm Hàm lợng NH4+ (RH%) (mg/100ml dịch chủng Cn2) 25% 1,12 50% 1,48 75% 2,86 100% 1,26 Kết bảng cho thấy: nhiệt độ 25% lợng amôn 1,12 (mg/100 ml dịch chủng) + độ ẩm 50% lợng amôn 1.48 (mg/100 ml dịch chủng) 34 + độ ẩm 75% lợng amôn 2,86( mg/100 ml dịch chủng) + độ ẩm 100% lợng amôn 1,26 (mg/100 ml dịch chủng) Chủng vi khuẩn phát triển tốt cho hàm lợng amôn cao RH% = 75% với 2,86 (mg/100 ml dịch chủng) Và độ ẩm thích hợp cho vi khuẩn phát triển NH4+ 2.5 1.5 0.5 25% 50% 75% 100% Độ ẩm Hình : Liên quan độ ẩm hàm lợng Amôn Qua hình cho thấy: Hoạt động cố định nitơ tăng dần từ độ ẩm 25% - 75% giảm dần từ 75 100% độ ẩm 75% hàm lợng amôn lớn tức hoạt động cố định nitơ mạnh mẽ Và độ ẩm tối u chủng 10.4 ảnh hởng thời gian : Sự tích luỹ amôn vi sinh vật đồng hoá đợc không liên quan tới yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, pH môi trờng, Mà liên quan tới thời gian tích luỹ Với mẫu đất thu đợc đặt điều kiện tối u pH, nhiệt độ, độ ẩm, Số vi sinh vật sau ngày/1 lần phân tích hàm lợng amôn có môi trờng nuôi vi khuẩn Kết thu đợc nh sau (bảng 14) : Bảng 14 : thời gian tích luỹ amôn : 35 Thờigian(ngày) 1ngày(26/12/06) 3ngày(29/12/06) ngày (5/01/06) 9ngày(14/01/06) Hàm lợng NH4+ (mg/100ml dịch nuôi Cn2) 0,50 1,14 2,58 0,88 Qua bảng 14 cho thấy : thời gian đầu (sau 24 giờ) hàm lợng amôn không đáng kể 0,5(mg NH4+/100ml dịch nuôi Cn2) + Sau ngày (72 giờ) hàm lợng amôn 1,14 (mg NH 4+/100 ml dịch chủng) + Sau ngày hàm lợng amôn 2,58( mg NH4+/100 ml dịch chủng) + Sau ngày hàm lợng amôn 0,88( mg NH4+/100 ml dịch chủng) Qua thấy rằng: sau ngày nuôi chủng môi trờng có kết qủa cao là: 2,58 (mg NH4+/100 ml dịch chủng) Đó thời gian tích luỹ amôn tốt chủng Sau ngày hàm lợng amôn giảm 0,88 ( mg NH 4+/100 ml dịch chủng) thực tế môi trờng cạn dinh dỡng làm xuất số yếu tố: tồn số chất độc môi trờng, gây ảnh hởng đến đời sống vi khuẩn Làm cho số lợng vi khuẩn giảm đồng thời lợng amôn giảm Và biểu đồ dới làm rõ kết thu đợc bảng 14 : , 36 Hình 6: Liên quan thời gian hàm lợng Amôn Qua hình cho thấy: Hoạt động cố định nitơ tăng dần từ ngày thứ đến ngày thứ giảm dần từ thứ đến ngày thứ ngày thứ hàm lợng amôn lớn tức hoạt động cố định nitơ mạnh mẽ Và thời gian tối thích chủng nghiên cứu XI Số lợng vi khuẩn cần sử dụng: Sau biết đợc khả cố định N2của chủng vi khuẩn cao nhất, pH tối u, nhiệt độ tối u, độ ẩm tối u, thời gian tối thích, điều quan trọng phải biết đợc số lợng vi khuẩn để từ tính số lợng cần thiết cho tác dụng lên đơn vị nguyên liệu có hiệu Số lợng vi khuẩn đợc xác định sở đo độ đục máy đo màu quang điện Erma (Nhật) bớc sóng trung tính ( =610nm) Bảng 10: Số lợng vi sinh vật cần /đơn vị nguyên liệu: Ngày 10/12/06 15/12 06 Dịch vi khuẩn (ml) Nguuyên liệu NH4+ (mg/100g) 100g 100g 100g 100g 14.9 15,7 17,2 16,4 Qua bảng 10 nhận thấy: với 1(ml) dịch khuẩn cha đủ cố định nitơ phân tử ml vi khuẩn thực khả cố định tốt nhất, đạt 15,7 (mg NH4+ mg/100g nguyên liệu) ml vậy, đạt 17,2 (mg NH4+ mg/100g nguyên liệu) Nhng tăng số lợng vi sinh vật lên có tợng ức chế cạnh tranh dinh dỡng dẫn đến cố định nitơ giảm 37 Kết luận kiến nghị I kết luận: Vùng đất trồng ngô xóm 6-Hng Lợi Hng Nguyên Nghệ An thuộc loại đất phù xa, pH trung tính (6,64-7,18), có hàm lợng đạm amon (NH4+) từ 0,0045-0,014mg/100g đất độ sâu (độ sâu lấy mẫu ) 20 30 cm Số lợng tế bào vi khuẩn Clostridium pasteurianum trung bình chung khoảng 9,3.105 CFU/ml Kết cho thấy độ sâu 20 30 cm sinh cảnh thích nghi vi khuẩn Phân lập đợc 12 chủng ký hiệu là: Cn1, Cn2, Cn3, Cn4, Cn5, C6, Cn7, Cn8, Cn9, Cn10, C11, Cn12 Trong có: + chủng phát triển tốt là: Cn1, Cn2, Cn3, Cn4, C6, Cn7 + chủng phát triển mức trung bình là: Cn 5, Cn8 (chỉ đợc ẳ ống thạch) Còn lại số chủng bị chết quấ trình nghiên cứu Qua phơng pháp nghiên cứu hoá sinh vi sinh vật cho thấy: chủng :Cn1, Cn2, Cn3, Cn4, C6, Cn7 chủng thuộc giống Clostridium pasteurianum, có chủng Cn2 có khả cố định cao (1,28 mg NH4+/100g) dùng chủng để nghiên cứu Chủng Cn2 phát triển tốt pH = 6,0 7,0 với lợng amôn 1,26 2,90 ( mg NH4+ /100ml dịch chủng), độ ẩm:75% với lợng amôn 2,86 (mg NH4+ /100 ml dịch chủng), nhiệt độ tối u 400C với hàm lợng amôn 38 2,74 ( mg NH4+ /100ml dịch chủng) Kết nghiên cứu cho thấy Clostridium vi khuẩn kỵ khícó khả cố định nitơ, góp phần làm tăng dinh dỡng nitơ cho đất, nhờ mà ảnh hởng đến sinh trởng phát triển trồng Điều lý thú tích lĩy amôn nhờ vi sinh vật cố định nitơ liên quan mật thiết với chế độ phân bón biện pháp kỷ thuật (bón phân hữu cơ, bón vôi, ) Điều làm sáng tỏ thêm đắn biện pháp kỷ thuật mà ngành nông nghiệp áp dụng II kiến nghị: Có điều kiện tìm hiểu thêm chủng vi khuẩn sống tự cố định nitơ khác để phục vụ sản xuất Vì vi khuẩn sống tự docos định nitơ dùng cho loại đất, loại trồng mà không đặc hiệu h vi khuẩn nốt sần đậu (mỗi loài loài vi khuẩn) Có thể điều khiển sinh trởng, phát triển chủng để tạo chế độ phân bón hữu - vi sinh, góp phần làm tăng dinh dỡng cho đất giảm bớt việc sử dụng phân bón hoá học nhằm xây dựng hệ sinh thái bền vững Tài liệu tham khảo 39 Kiều Hữu ảnh (2006) Giáo trình giảng dạy vi sinh vật học - ĐHQG Hà Nội Nguyễn Văn Bộ (2005) Bón phân cân đối hợp ký cho trồng NXB Nông Nghiệp Hà Nội Đờng Hồng Dật Cây ngô (kỹ thuật canh tác tăng suất) (1986) NXB Lao Động Xã Hội Đờng Hồng Dật (1978)- Giáo trình vi sinh vật học trồng trọt - NXB Giáo Dục Đờng Hồng Dật Nguyễn Lân Dũng 1981 Vi sinh vật học NXB Giáo Dục Nguyễn Lân Dũng (1978) sinh học phục vụ sản xuất đòi sống Nguyễn Lân Dũng cộng (1978) Hớn dẫn thực hành vi sinh vật NXB Giáo Dục Nguyễn Lân Dũng Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Tỵ (1980) vi sinh học - NXB Giáo Dục N.DIER Uxalimxki - Nguyễn Lân Dũng - Phạm Văn Tỵ Ngô Kế Sơng (1970) Cơ sơ sinh lý học vi sinh vật - NXB Giáo Dục 10 Nguyễn Lân Dũng Nguyễn Đình Quyến (1981) Vi sinh vật học NXB Giáo Dục 11 Nguyễn Thành Đạt Cơ sơ vi sinh vật (tập 1) (1999) - NXB Giáo Dục 12 Nguyễn Thành Đạt cộng (1990) Thực hành vi sinh vật - NXB Giáo Dục 13 Nguyễn Thành Đạt (1980) Hớng dẫn thực hành vi sinh vật - NXB Giáo Dục Hà Nội 14 Phạm Công Hoạt (2005) Bài giảng vấn đề vi sinh vật học Bộ khoa học công nghệ 15 Lê Văn Khoa cộng (2001) Phơng pháp phân tích đất, nớc, phân bón trồng - NXB Giáo Dục 16 Trần Minh Tâm (2000) Công nghệ vi sinh ứng dụng 17 Chu Thị Thơm , Phạm Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006) ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất đời sống NXB Lao Động Xã Hội 18 Nguyễn Dơng Tuệ (1995) Thực tập vi sinh vật học - Đại học Vinh 19 Nguyễn Dơng Tuệ (2003) - Thực tập lớn vi sinh vật học - Đại học Vinh 40 20 Nguyễn Khắc Tuấn (1982) Giáo trình thực tập vi sinh vật Bộ Nông Nghiệp, trờng đại học Nông Nghiệp I - Hà Nội 21 Lê Văn Tri (2004) Phân phức hợp hữu vi sinh NXB Nông Nghiệp 22 Trần Cẩm Vân (2001) Giáo trình vi sinh học môi trờng - NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội 23 Viện nông hoá thổ nhỡng (1976) Tài liệu hớng dẫn phân tích nông hoá thổ nhỡng Hà Nội 24 Campbell (20005) Biology, Pearson Education 41