BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HÀ MINH HIỂN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT PHENOL TỪ NHỰA VÀ VỎ QUẢ MÙ U ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh- Năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HÀ MINH HIỂN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT PHENOL TỪ NHỰA VÀ VỎ QUẢ MÙ U ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc Mã số: 62.73.15.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ TS Nguyễn Văn Thị TP Hồ Chí Minh- Năm 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Hà Minh Hiển Hà Minh Hiển MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt iv Danh mục bảng vii Danh mục hình, biểu đồ, sơ đồ, đồ thị ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược Mù u 1.2 Sơ lược hợp chất phenol 13 1.3 Tình hình nghiên cứu hợp chất phenol từ Mù u 16 1.4 Một số phương pháp phân tích hợp chất phenol từ Mù u 19 1.5 Một số khái niệm chất chuẩn đối chiếu 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng 26 2.2 Nguyên vật liệu 26 2.3 Dung môi, hóa chất thiết bị thí nghiệm 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41 3.1 Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa vỏ Mù u 41 3.2 Thử tác dụng kháng khuẩn cao chiết từ nhựa vỏ Mù u 44 3.3 Phân lập hợp chất phenol từ nhựa vỏ Mù u 45 3.4 Xác định cấu trúc hợp chất phenol phân lập 48 3.5 Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu 61 3.6 Xây dựng thẩm định phương pháp GC-MS xác định calophyllolid cao methanol chiết từ nhựa Mù u (Phương pháp 1) 76 3.7 Xây dựng thẩm định phương pháp GC-MS xác định calophyllolid vỏ Mù u (Phương pháp 2) 83 3.8 Xây dựng thẩm định phương pháp HPLC-DAD định lượng calophyllolid chế phẩm dầu Mù u Inopilo 89 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 96 4.1 Chiết xuất hợp chất phenol từ nhựa vỏ Mù u 96 4.2 Thử tác dụng kháng khuẩn cao chiết từ nhựa vỏ Mù u 97 4.3 Phân lập hợp chất phenol từ nhựa vỏ Mù u 97 4.4 Xác định cấu trúc hợp chất phenol phân lập phương pháp phổ nghiệm 98 4.5 Xác định thành phần hợp chất phenol từ nhựa vỏ Mù u 102 4.6 Thiết lập chất chuẩn đối chiếu 106 4.7 Các phương pháp ghép nối sắc ký-phổ nghiệm xác định hợp chất phenol nhựa, vỏ 108 Mù u thuốc từ Mù u KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 110 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMDIS Automated Mass spectral Deconvolution and Identification System br Đỉnh giãn rộng (broad) CDCl3 Cloroform deuteri hóa CD3OD Methanol deuteri hóa 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 COSY COrrelation SpectroscopY d Đỉnh đôi (doublet) dd Đỉnh đôi kép (doublet of doublets) DAD Detector dãy diod quang (Diode Array Detector) DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO-d6 Dimethyl sulfoxid deuteri hóa EI-MS Phổ khối lượng-ion hóa bắn phá electron (Electron Impact Mass C-NMR Spectrometry) EMEA European Medicines Agency ESI-MS Phổ khối lượng-ion hóa phun mù electron (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry) EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol EU Liên minh châu Âu (European Union) FDA Cơ quan Thực Dược phẩm Hoa kỳ (Food and Drug Administration) FHH Forum for the Harmonization of Herbal Medicine FTIR Hồng ngoại chuyển đổi Fourier (Fourier Transform Infrared) GC-MS Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography- Mass Spectrometry) HIV Human Immunodeficiency Virus HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton H-NMR HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HRESI-TOFMS Phổ khối lượng thời gian bay-ion hóa phun mù electron phân giải cao (High Resolution Electrospray Ionization-Time Of Flight Mass Spectrometry) ICH Hội nghị quốc tế hòa hợp (International Conference on Harmonization) ICP-MS Khối phổ plasma cảm ứng (Inductively Coupled Plasma- Mass Spectrometry) IR Hồng ngoại (Infrared) LC-MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography- Mass Spectrometry) m Đỉnh đa (multiplet) MDL Giới hạn phát nhỏ (Minimum Detection Limit) MeCN Acetonitril MeOH Methanol MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration) MRSA Staphylococcus aureus đề kháng methicilin (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) NIST Viện Công nghệ Tiêu chuẩn Quốc gia Hoa kỳ (National Institute of Standards and Technology) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) Pđ Phân đoạn PLE Chiết lỏng áp suất (Pressurized Liquid Extraction) q Đỉnh bốn (quartet) Rf Hệ số di chuyển (Relative to front) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) s Đỉnh đơn (singlet) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SIM Ion lựa chọn kiểm tra (Selected Ion Monitoring) t Đỉnh ba (triplet) TGA Phân tích nhiệt trọng lượng (Thermogravimetric Analysis) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TMS Tetramethyl silan TT Thuốc thử tt/tt Thể tích/thể tích USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopoeia) UV-Vis Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet-Visible) VLC Sắc ký lỏng chân không (Vacuum Liquid Chromatography) WHO Tổ chức Y tế giới (World Health Organization) max Bước sóng hấp thu cực đại max Số sóng hấp thu cực đại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng số Tên bảng Trang 1.1 Phân loại hợp chất phenol theo Harborne 13 2.1 Tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn đối chiếu theo WHO 37 2.2 Các yếu tố mức để chọn điều kiện xử lý mẫu 39 2.3 Thiết kế thí nghiệm chọn điều kiện xử lý mẫu 39 3.1 Kết chiết xuất hợp chất phenol từ vỏ Mù u PLE soxhlet 43 3.2 Kết thử tác dụng kháng khuẩn cao chiết từ nhựa vỏ Mù u 44 3.3 Bảng liệu phổ NMR hợp chất N1 (CD3OD DMSO-d6, máy 500 49 MHz) 3.4 Bảng liệu phổ NMR hợp chất N2 (CD3OD, máy 500 MHz) 51 3.5 Bảng liệu phổ NMR hợp chất N3 (CDCl3, máy 500 MHz) 54 3.6 Dữ liệu độ dài liên kết tiêu biểu hợp chất N3 56 3.7 Dữ liệu độ dài góc liên kết hydrogen hợp chất N3 57 3.8 Bảng so sánh liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR calophyllolid điều chế 64 với tài liệu tham khảo 3.9 Kết khảo sát % diện tích tạp chất hữu số bước sóng 66 3.10 Tính phù hợp hệ thống HPLC -DAD (n=6) 67 3.11 Kết khảo sát khoảng tuyến tính tạp chất (1); calophyllolid (2); tạp 69 chất (3) 3.12 Kết khảo sát độ lặp lại độ xác trung gian phương pháp 70 3.13 Độ tinh khiết calophyllolid trình đóng l ọ 71 2.2.2 Phổ hồng ngoại: Tiến hành theo phụ lục 4.2 DĐVN IV Chuẩn bị mẫu cách tạo viên nén KBr Phổ hồng ngoại chế phẩm phải có đỉnh có số sóng: 1726, 1662, 1579, 1133, 759, 702 cm-1 2.2.3 Phổ khối lượng: Phổ khối lượng EI-MS (70 eV) mẫu thử phải có pic m/z 416 [M]+, 401 (pic bản), m/z 83, 55 2.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ 13C-NMR phổ 1H-NMR mẫu thử phải phù hợp với phổ 13C-NMR phổ H-NMR theo phụ lục đính kèm 2.3 Điểm chảy: Tiến hành theo phụ lục 6.7 – DĐVN IV Tiêu chuẩn chấp nhận: 154-156 oC 2.4 Độ tinh khiết: 2.4.1 Xác định tạp chất hữu cơ: Phương pháp sắc ký lỏng Tiến hành theo phụ lục 5.3 DĐVN IV Pha động: Hỗn hợp acetonitril: nước với chương trình dung môi Thời gian (phút) % acetonitril % nước 50 50 20 90 10 30 100 37 100 45 50 50 55 50 50 Chuẩn bị dung môi pha mẫu: Acetonitril – Nước (50 : 50) Chuẩn bị dung dịch thử: Cân xác khoảng 1,5 mg chế phẩm vào bình định mức 25 ml, thêm 20 ml dung môi pha mẫu, siêu âm hòa tan 30 phút, bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ 25 ml, lọc qua màng lọc 0,45µm Điều kiện sắc ký: Cột: Gemini NX C-18 thép không gỉ (15 cm x 4,6 mm x µm) Detector dãy diod quang (270 nm) Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút Thể tích tiêm: µl Cách tiến hành: Tiêm dung môi pha mẫu Tiêm lần dung dịch thử Số đĩa lý thuyết pic calophyllolid tạp chất hữu phải không 2000, độ phân giải pic calophyllolid pic tạp chất hữu gần phải không 1,5, độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic calophyllolid tạp chất hữu không lớn 2% Tính hàm lượng phần trăm tổng tạp chất hữu mẫu theo công thức: 100 (rU/rT) đó: rU tổng diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử ngoại trừ pic calophyllolid, rT tổng diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử ngoại trừ pic dung môi pha mẫu Tiêu chuẩn chấp nhận: Không 3,8% tính theo chế phẩm nguyên trạng 2.4.2 Xác định tạp chất bay (nước dung môi hữu cơ) Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng Tiến hành theo USP Tốc độ gia nhiệt: oC/phút Khoảng nhiệt độ: 30-150 oC Khí: Nitrogen Tốc độ dòng: 100 ml/phút Tiêu chuẩn chấp nhận: Không 1,1% 2.4.3 Xác định tạp chất vô (Chì, arsen, thủy ngân) Phương pháp ICP-MS Tiến hành theo phụ lục IX Dược điển Trung quốc 2010 Công suất ICP RF: 1300 W Tốc độ khí nebulizer: 0,55 l/phút Tốc độ khí plasma: 15 l/phút Dwell: 15 ms Tiêu chuẩn chấp nhận: Không 20 ppm 2.5 Định lượng % Calophyllolid = 100% – (% tạp chất hữu cơ) – (% tạp chất bay hơi) – (% tạp chất vô cơ) Tiêu chuẩn chấp nhận: Không 95% C26H24O5 Bảo quản Đựng lọ thủy tinh màu nâu kín, tránh ánh sáng, nhiệt độ 2-8 oC Quy cách đóng gói: 10 mg/lọ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHẤT LƯỢNG CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU CALOPHYLLOLID Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết Kết luận Tính chất Chế phẩm tinh thể không màu, , dễ tan Tinh thể không màu, dễ tan Đạt aceton, benzen, ether ethylic, alcol aceton, benzen, ether ethylic, alcol Phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến chế 233, 269 294 nm Định tính Phổ UV-Vis Đạt phẩm thu dải sóng từ 220 nm đến 350 nm phải có cực đại hấp thu ở: 235, 270 295 nm Phổ IR Phổ hồng ngoại chế phẩm phải có 1726, 1662, 1581, 1134, 758, 700 cm-1 Đạt đỉnh có số sóng: 1726, 1662, 1579, 1133, 759, 702 cm-1 Phổ MS Phổ khối lượng EI-MS (70 eV) mẫu m/z 416 [M]+, 401, m/z 83, 55 Đạt thử phải có pic m/z 416 [M]+, 401, m/z 83, 55 Phổ NMR Phổ 13 C-NMR phổ 1H-NMR mẫu H-NMR (CD3Cl3, 300 MHz): 7,26 m x thử phải phù hợp với phổ 13C-NMR 2; 7,40 m x 2; 0,97 s x 2; 1,9 d (6,3); 2,01 s; 5,48 d (9,9); 6,02 s; 6,45 d (9,6), phổ 1H-NMR theo tài liệu tham khảo 6,57 q (6,0) Đạt 13 C-NMR (CD3Cl3, 75 MHz): 10,7; 15,2; 26,8 x 2; 63,0; 77,4; 105,6; 110,7; 114,2; 115,0; 115,9; 127,2 x 2; 127,5 x 2; 127,7; 129,0; 139,5; 139,9; 144,2; 151,7; 152,0; 155,0; 155,8; 159,4; 194,3 Điểm chảy 154-156 oC 155,6 oC Đạt Tạp chất hữu Không 3,8% 3,59% Đạt Tạp chất bay Không 1,1% 1,05% Đạt Tạp chất vô Không 20 ppm Pb: Không phát (MDL: 2,49 ppb) Đạt As: Không phát (MDL: 4,69 ppb) Hg: Không phát (MDL: 0,56 ppb) Định lượng Không 95% 95,42% Đạt PHỤ LỤC 13 TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU 4-HYDROXYXANTHON C13H8O3 Cấu trúc Công thức cấu tạo: O 8a 9a 10a O 4a OH Công thức phân tử: C13H8O3 Phân tử lượng: 212,2 Tên khoa học: 4-hydroxy-9H-xanthen-9-one Kiểm tra chất lượng nguyên liệu 2.1 Tính chất: Chế phẩm tinh thể hình kim, không màu, dễ tan aceton, methanol 2.2 Định tính 2.2.1 Phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến: Tiến hành theo phụ lục 4.1 DĐVN IV Chuẩn bị dung dịch mẫu thử methanol (TT) có nồng độ 0,6 g/ml Phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến chế phẩm thu dải sóng từ 220 nm đến 400 nm phải có cực đại hấp thu ở: 231, 248 348 nm 2.2.2 Phổ hồng ngoại: Tiến hành theo phụ lục 4.2 DĐVN IV Chuẩn bị mẫu cách tạo viên nén KBr Phổ hồng ngoại chế phẩm phải có đỉnh có số sóng: 3197, 1652, 1589, 1292, 754, 729 cm-1 2.2.3 Phổ khối lượng: Phổ khối lượng EI-MS (70 eV) mẫu thử phải có pic m/z 212 [M]+ (pic bản), m/z 184, 155, 128, 102, 63 2.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ 13C-NMR phổ 1H-NMR mẫu thử phải phù hợp với phổ 13C-NMR phổ H-NMR theo phụ lục đính kèm 2.3 Điểm chảy: Tiến hành theo phụ lục 6.7 DĐVN IV Tiêu chuẩn chấp nhận: 228-230 oC 2.4 Độ tinh khiết 2.4.1 Xác định tạp chất hữu Phương pháp sắc ký lỏng Tiến hành theo phụ lục 5.3 DĐVN IV Pha động: Hỗn hợp acetonitril: nước với chương trình dung môi Thời gian % acetonitril % nước 50 50 20 90 10 30 100 37 100 45 50 50 55 50 50 (phút) Chuẩn bị dung môi pha mẫu: Acetonitril – Nước (50 : 50) Chuẩn bị dung dịch thử: Cân xác khoảng 2,5 mg chế phẩm vào bình định mức 25 ml, thêm 20 ml dung môi pha mẫu, siêu âm hòa tan phút, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ 25 ml, lọc qua màng lọc 0,45µm Điều kiện sắc ký: Cột: Gemini NX C-18 thép không gỉ (15 cm x 4,6 mm x µm) tương đương Detector chuỗi diod quang (280 nm) Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút Thể tích tiêm: µl Cách tiến hành: Tiêm dung môi pha mẫu Tiêm lần dung dịch thử Số đĩa lý thuyết pic 4hydroxyxanthon tạp chất hữu phải không 2000, độ phân giải pic 4-hydroxyxanthon pic tạp chất hữu gần phải không 1,5, độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic 4-hydroxyxanthon tạp chất hữu không lớn 2% Tính hàm lượng phần trăm tổng tạp chất hữu mẫu theo công thức: 100 (rU/rT) đó: rU tổng diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử ngoại trừ pic 4-hydroxyxanthon, rT tổng diện tích pic thu sắc ký đồ dung dịch thử ngoại trừ pic dung môi pha mẫu Tiêu chuẩn chấp nhận: Không 6,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng 4.2 Xác định tạp chất bay Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng Tiến hành theo USP 34 Tốc độ gia nhiệt: oC/phút Khoảng nhiệt độ: 30-150 oC Khí: Nitrogen Tốc độ dòng: 100 ml/phút Tiêu chuẩn chấp nhận: Không 1,0% Định lượng %4-hydroxyxanthon = 100% – (% tạp chất hữu cơ) - (% tạp chất bay hơi) Tiêu chuẩn chấp nhận: Không 90% C13H8O3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHẤT LƯỢNG CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU 4-HYDROXYXANTHON Chỉ tiêu Mức chất lượng Kết Kết luận Tính chất Chế phẩm tinh thể hình kim, Tinh thể hình kim, không màu Dễ tan Đạt không màu Dễ tan aceton, aceton, methanol methanol Định tính Phổ UV-Vis Phổ hấp thụ tử ngoại khả 231, 248 348 nm Đạt kiến chế phẩm thu dải sóng từ 220 nm đến 400 nm phải có cực đại hấp thu ở: 231, 248 348 nm Phổ IR Phổ hồng ngoại chế phẩm 3197, 1652, 1589, 1292, 754, 729 cm-1 Đạt phải có đỉnh có số sóng: 3197, 1652, 1589, 1292, 754, 729 cm-1 Phổ MS Phổ khối lượng EI-MS (70 eV) m/z 212 [M]+, m/z 184, 155, 128, 102, Đạt mẫu thử phải có pic 63 m/z 212 [M]+, m/z 184, 155, 128, 102, 63 Phổ NMR Phổ 13 C-NMR phổ 1H-NMR H-NMR (CD3OD, 500 MHz): 7,73 dd Đạt mẫu thử phải phù hợp với (8,0; 2,0); 7,25 t (8,0); 7,31 dd (8,0; 1,5); 7,68 dd (8,5; 0,5); 7,83 dt (8,5; 1,5); phổ 13C-NMR phổ 1H-NMR 7,44 dt (7,5; 1,0); 8,26 dd (8,0; 2,0) theo tài liệu tham khảo 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 179,2; 157,4; 147,9; 147,1; 136,4; 127,3; 125,3; 125,1; 123,6; 122,5; 121,5; 119,4; 117,1 Điểm chảy 228-230 oC 229,1oC Đạt Tạp chất hữu Không 6,0% 5,57% Đạt Tạp chất bay Không 1,0% 0,52% Đạt Định lượng Không 90% 93,91% Đạt PHỤ LỤC 14 QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CALOPHYLLOLID TRONG CAO METHANOL TỪ NHỰA MÙ U BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS Cao nhựa Mù u điều chế phương pháp chiết với methanol –nước (9:1) nhựa Mù u loại tinh chế dầu Mù u Mô tả Cao nhựa Mù u chất mềm, đồng Màu nâu sẫm Mùi đặc biệt Định tính Trong phần xác định hàm lượng calophyllolid, sắc ký đồ dung dịch thử phải có pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic calophyllolid sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (khác biệt thời gian lưu phải khoảng ± 2%) Phải có mảnh ion phân tử m/z 416, pic m/z 401, mảnh ion m/z 83 55 Hàm lượng calophyllolid Tiến hành điều kiện tránh ánh sáng Phương pháp sắc ký khí ghép phổ khối Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,04 g cao methanol vào ống eppendorf, thêm xác 2,0 ml methanol (TT), lắc xoáy phút siêu âm 10 phút Ly tâm 8000 vòng/phút phút Hút xác 1,0 ml dịch methanol cho vào bình định mức 10,0 ml pha loãng methanol (TT) đến định mức Lắc Dung dịch chuẩn đối chiếu: Hòa tan chất chuẩn đối chiếu calophyllolid methanol (TT) để dung dịch có nồng độ 12,5 g/ml Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: DB-5MS 25 m x 0,22 mm ID, df = µm Khí mang: heli dùng cho sắc ký (TT) với tốc độ dòng 1,43 ml/phút Kiểu bơm mẫu: không chia dòng Nhiệt độ: Thời gian (phút) 80 5,5 300 14,5 Cột Nhiệt độ (oC) 300 Buồng tiêm mẫu 250 Nguồn ion 250 Giao diện 200 Kiểu ion : Bắn phá điện tử Khoảng quét : 50-550 amu Kiểu thu liệu : SCAN SIM Các ion định lượng : Ion đích m/z 401; ion tham chiếu m/z 83 55 Thể tích tiêm mẫu : l Cách tiến hành: Phép thử có giá trị hệ số đối xứng pic sắc ký đồ dung dịch chuẩn đối chiếu không độ lệch cường độ tương đối (%) ion m/z 55, 83, 416 dung dịch chuẩn đối chiếu dung dịch thử không 20% Tiêm dung dịch thử dung dịch chuẩn đối chiếu vào máy GC-MS ghi sắc ký đồ Định tính cách so sánh thời gian lưu mảnh ion dung dịch thử dung dịch chuẩn đối chiếu kiểu thu liệu SCAN Xác định hàm lượng phần trăm calophyllolid (X%), C26H24O5, cách so sánh cường độ mảnh m/z 401 dung dịch thử dung dịch chuẩn đối chiếu kiểu thu liệu SIM theo công thức: X% (g/100 g) = (At/Ac) x (C x D)/mt x 0,1 At : Cường độ mảnh m/z 401 dung dịch thử Ac : Cường độ mảnh m/z 401 dung dịch chuẩn đối chiếu C : Hàm lượng calophyllolid dung dịch chuẩn đối chiếu (g/ml) D : Độ pha loãng mt : Khối lượng cao đem thử (mg) PHỤ LỤC 15 QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CALOPHYLLOLID TRONG VỎ QUẢ MÙ U BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS Xử lý mẫu Xay vỏ thành bột máy nghiền rây để thu hạt có kích thước trung bình 1,84 mm xác định theo phương pháp Dược điển Mỹ 30 (2007) Tiến hành điều kiện tránh ánh sáng Cân xác khoảng g bột vỏ cho vào ống chiết đặt lọc 10 µm đầu, lớp thủy tinh, thêm hạt thủy tinh dày 1-2 mm để hạn chế khoảng trống ống, tiếp tục cho lớp thủy tinh lọc 10 µm đầu Điều kiện chiết Thiết bị chiết lỏng áp suất: ASE-100-Dionex Áp suất : 1500 psi Nhiệt độ : 120 oC Thời gian chiết : 15 phút Chu kỳ chiết :1 Thể tích rửa : 60% Thời gian làm hệ thống khí nitrogen : 90 giây Cô dịch chiết áp xuất giảm 40 oC định mức đến 100 ml methanol (TT) Lọc dịch chiết giấy lọc Whatman 40 (Dịch chiết V) Định tính Trong phần xác định hàm lượng calophyllolid, sắc ký đồ dung dịch thử phải có pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic calophyllolid sắc ký đồ dung dịch chuẩn đối chiếu (khác biệt thời gian lưu phải khoảng ± 2%) Phải có mảnh ion phân tử m/z 416, pic m/z 401, mảnh ion m/z 83 55 Hàm lượng calophyllolid Tiến hành điều kiện tránh ánh sáng Phương pháp sắc ký khí ghép phổ khối Dung dịch thử: Dịch chiết V Dung dịch chuẩn đối chiếu: Hòa tan chất chuẩn đối chiếu calophyllolid methanol (TT) để dung dịch có nồng độ 12,5 g/ml Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: DB-5MS 25 m x 0,22 mm ID, df = µm Khí mang: heli dùng cho sắc ký (TT) với tốc độ dòng 1,43 ml/phút Kiểu bơm mẫu: không chia dòng Nhiệt độ: Thời gian (phút) 80 5,5 300 17,5 Cột Nhiệt độ (oC) 300 Buồng tiêm mẫu 250 Nguồn ion 250 Giao diện 200 Kiểu ion : Bắn phá điện tử Khoảng quét : 50-450 amu Kiểu thu liệu : SCAN SIM Các ion định lượng - Ion đích - Ion tham chiếu : m/z 83, 55 Thể tích tiêm mẫu : m/z 401 : l Cách tiến hành: Phép thử có giá trị hệ số đối xứng pic sắc ký đồ dung dịch chuẩn đối chiếu không độ lệch cường độ tương đối (%) ion m/z 55, 83, 416 calophyllolid dung dịch chuẩn đối chiếu dung dịch thử không 20% Tiêm dung dịch thử dung dịch chuẩn đối chiếu vào máy GC-MS ghi sắc ký đồ Định tính cách so sánh thời gian lưu mảnh ion dung dịch thử dung dịch chuẩn đối chiếu kiểu thu liệu SCAN Xác định hàm lượng phần trăm calophyllolid (X%), C26H24O5, cách so sánh cường độ mảnh m/z 401 dung dịch thử dung dịch chuẩn đối chiếu kiểu thu liệu SIM theo công thức sau: X% = (At/Ac) x (C x D)/mt x 0,1 At : Cường độ mảnh m/z 401 dung dịch thử Ac : Cường độ mảnh m/z 401 dung dịch chuẩn đối chiếu C : Hàm lượng calophyllolid dung dịch chuẩn đối chiếu (g/mL) D : Độ pha loãng mt : Khối lượng vỏ đem thử (mg) PHỤ LỤC 16 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CALOPHYLLOLID TRONG CHẾ PHẨM “DẦU MÙ U INOPILO” BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-DAD Tiến hành điều kiện tránh ánh sáng Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng theo DĐVN IV (Phụ lục 5.3) Dung dịch thử: Cân xác khoảng 120 mg mẫu thử cho vào bình định mức 10 ml, làm ấm mẫu 60 oC 10 phút thêm ml hỗn hợp methanol-nước (TT) (9:1), siêu âm 15 phút Bổ sung hỗn hợp methanol-nước (TT) (9:1) đến thể tích Lọc mẫu qua lọc 0,45 m Dung dịch chuẩn đối chiếu: pha dung dịch chuẩn calophyllolid methanol (TT) có nồng độ khoảng 75 g/ml; 60 g/ml 45 g/ml Lọc mẫu qua lọc 0,45 m Điều kiện sắc ký: Pha động A: Acetonitril (TT) Pha động B: Dung dịch acid acetic 2% Tiến hành chạy sắc ký theo chương trình bảng sau: Thời gian (phút) Acetonitril (%) Dung dịch acid acetic 2% (%) 20 80 30 80 20 35 20 80 40 20 80 Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh C18 (5 μm), cột Zorbax phù hợp Tốc độ dòng: ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 10 μl Nhiệt độ cột: 40 oC Detector DAD đặt bước sóng 270 nm Cách tiến hành: Kiểm tra tính phù hợp hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn đối chiếu Hệ số đối xứng thu từ pic calophyllolid phải nằm khoảng 0,81,5, độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic calophyllolid lần tiêm lặp lại không 2,0 %, số đĩa lý thuyết pic calophyllolid phải không 2000 Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn đối chiếu dung dịch thử Vẽ đồ thị biểu diễn diện tích pic calophyllolid theo nồng độ calophyllolid dung dịch chuẩn đối chiếu xác lập phương trình h ồi quy tuyến tính, dựa vào tính nồng độ calophyllolid dung dịch thử (g/ml) Tính hàm lượng phần trăm (kl/kl) calophyllolid, C26H24O5, chế phẩm dựa vào diện tích pic thu từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn đối chiếu hàm lượng C26H24O5 calophyllolid chuẩn đối chiếu theo công thức: X% (g/ 100 g) = Ct/mt Ct: Nồng độ calophyllolid dung dịch thử (g/ml) mt: Khối lượng mẫu thử (mg)