Đang tải... (xem toàn văn)
GABA (gamma amino butyric acid), là một amino acid phi protein có 4 carbon, được tìm thấy trong các loài vi khuẩn đơn giản đến cây trồng và ở ngay cả động vật có vú. GABA được phát hiện trong cây từ hơn nửa thế kỷ trước. Tuy nhiên vai trò của nó ở trong thế giới thực vật vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhưng trong thế giới động vật thì các nhà khoa học đã tìm ra được vai trò của GABA: là một chất dẫn truyền thần kinh ức chế quan trọng nhất trong não bộ, ức chế sự dẫn truyền thần kinh gây kích thích, có rất nhiều hoạt tính sinh học như giảm stress, chống oxy hóa, giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch và thần kinh. Ở vi khuẩn và thực vật GABA đóng vai trò trao đổi chất trong chu trình Krebs, còn ở động vật có xương sống nó đóng vai trò như một máy phát tín hiệu thần kinh mạnh.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO MÔN HỌC CÁC PP PHÂN TÍCH TRONG NGHIÊN CỨU THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: LÊN MEN THU NHẬN GABA TỪ BỘT HẠT BỤP GIẤM GVHD: TS Phan Ngọc Hòa HVTT: Nhóm MỤC LỤC O DANH MỤC HÌNH Hình Công thức cấu tạo GABA Hình Chu trình chuyển hóa GABA Hình Các trạng thái biến đổi phân tử vật chất tương tác với xạ…………21 Hình Sơ đồ biến đổi Raman………………………………………………………… Hình Sơ đồ cấu tạo laser Nd-YAG Hình Cấu hình tán xạ 900 1800 Hình Sơ đồ máy đơn sắc đơn Hình Sơ đồ chuyển lượng khuếch đại Raman Hình Cấu trúc khuếch đại Raman Hình 10 Sơ đồ máy quang phổ Raman Hình 11 Phân vùng xạ ánh sáng theo bước sóng Hình 12 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ UV-Vis Hình 13 Bước sóng hấp thu cực đại nhóm chức hữu Hình 14 Mô hình đường chuẩn để định lượng Hình 15 Nguyên lý hoạt động HPLC Hình 16 Sắc ký đồ số hợp chất Hình 17 Cấu tạo hệ thống HPLC DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần hóa học hạt bụp giấm (Hainida cộng sự, 2008)……… Bảng Thành phần amino acid hạt bụp giấm (El-Adawy, 1994)……………… CHƯƠNG GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu GABA GABA (gamma amino butyric acid), amino acid phi protein có carbon, tìm thấy loài vi khuẩn đơn giản đến trồng động vật có vú GABA phát từ nửa kỷ trước Tuy nhiên vai trò giới thực vật chưa nghiên cứu cách đầy đủ, giới động vật nhà khoa học tìm vai trò GABA: chất dẫn truyền thần kinh ức chế quan trọng não bộ, ức chế dẫn truyền thần kinh gây kích thích, có nhiều hoạt tính sinh học giảm stress, chống oxy hóa, giảm thiểu nguy mắc bệnh tim mạch thần kinh Ở vi khuẩn thực vật GABA đóng vai trò trao đổi chất chu trình Krebs, động vật có xương sống đóng vai trò máy phát tín hiệu thần kinh mạnh Hình Công thức cấu tạo GABA GABA chủ yếu hình thành phản ứng α–decarboxylation không nghịch đảo acid L–glutamic muối nó, xúc tác enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) Enzyme tìm thấy vi khuẩn Lactobacillus (Bertoldi cộng sự, 1999), Escherichia (Rice cộng sự, 1993), Streptococcus, Aspergillus (Kato cộng sự, 2002) Neurospora (Kubicek cộng sự, 1979); thực vật trà (Zhao cộng sự, 2011), cà chua (Yoshimura cộng sự, 2010), đậu nành (Serraj cộng sự, 1998), gạo lứt nảy mầm (Daixin cộng sự, 2008); não động vật có vú (Nathan cộng sự, 1994) Tuy nhiên vi khuẩn Lactobacillus nấm men hai loại phổ biến để sản xuất GABA Ngoài ra, GABA tìm thấy côn trùng gián, châu chấu, sâu bướm ong mật (Anthony cộng sự, 1993) 1.2 Các chức sinh lý quan trọng GABA Ngày GABA nghiên cứu nhiều có hoạt tính sinh học mạnh, có nhiều chức sinh lý nhiều tác động tích cực có lợi cho sức khỏe người Bảng Các chức sinh lý GABA (Diana cộng sự, 2014) Chức sinh lý Dẫn truyền thần kinh Điều chỉnh huyết áp Bệnh não Bệnh tâm thần Các quan quan trọng Hệ thống miễn dịch Bảo vệ phòng chống ung thư Điều chỉnh tế bào Tim mạch Hệ hô hấp Điều chỉnh nội tiết tố Chức cụ thể Ức chế dẫn truyền thần kinh Giảm huyết áp Làm giảm rối loạn thần kinh Tăng cường trí nhớ Làm giảm rối loạn tâm trạng Tác dụng thư giãn Làm giảm triệu chứng ngủ Giảm phiền muộn Phòng ngừa điều trị chứng nghiện rượu Bảo vệ chống lại bệnh thận mãn tính Kích hoạt chức gan Cải thiện chức thị giác Tăng tốc độ tổng hợp protein não Tăng khả miễn dịch Làm chậm ức chế tế bào ung thư tăng sinh Kích thích tế bào ung thư tự hủy diệt Ức chế khối u Chống viêm tăng sinh tế bào nguyên bào sợi Tổng hợp acid hyaluronic Nâng cao hiệu suất nguyên bào sợi da Làm suy giảm phản ứng trao đổi chất làm thiếu máu cục Kiểm soát bệnh suyễn Kiểm soát đường hô hấp Tăng hormone tăng trưởng Kiểm soát tiết hormone Kiểm soát progesterone Kiểm soát hormone tuyến giáp Ngăn ngừa béo phì 1.3 Cơ chế hình thành GABA Trong động vật, GABA hình thành qua enzyme: enzyme glutamate decarboxylase (GAD), enzyme GABA transaminase (GABA–T) enzyme succinic seminaldehyde dehydrogenase (SSADH) Hình Chu trình chuyển hóa GABA 1.4 Thành phần hạt Bụp giấm Bảng Thành phần hóa học hạt bụp giấm (Hainida cộng sự, 2008) Thành phần Độ ẩm (%) Protein (g) Tổng chất xơ tiêu hóa (g) Carbohydrate (g) Chất béo (g) Tro (g) Hàm lượng 9.9 33.5 18.3 13.0 22.1 7.5 Bảng Thành phần amino acid hạt bụp giấm (El-Adawy, 1994) Amino acid Aspartic acid Threonine Serine Acid glutamic Proline Glycine Alanine Cystine Valine Methionine Isoleucine Leucine Hàm lượng (%) 10.50 4.74 4.65 21.78 4.13 4.27 4.55 2.91 3.32 1.20 3.03 7.29 Tyrosine Phenylalanine Lysine Histidine Trytophan Arginine 3.39 5.25 5.46 2.74 0.29 10.50 1.5 Các phương pháp sản xuất GABA nay: • Trích ly từ loại ngũ cốc • Tạo điều kiện tối ưu để ngũ cốc nảy mầm • Lên men đậu tương, đậu xanh, cám gạo… vi sinh vật Trong đó, trình sản xuất GABA lên men vi sinh vật (vi khuẩn Lacobacillus, nấm men) ứng dụng rộng rãi có hiệu cao giới 1.6 Mục đích đề tài Cho đến nay, GABA khai thác nghiên cứu loại nguyên liệu hạt ngũ cốc, gạo có giá trị thương phẩm cao Trong đó, hạt bụp giấm nước ta từ trước đến xem loại phế liệu có giá trị sử dụng thường bị thải bỏ Nhưng hạt bụp giấm chứa hàm lượng protein cao (26 – 27%) với tỷ lệ aicd glutamic cao tổng số amino acid (22%) Do đó, xem hạt bụp giấm nguồn nguyên liệu tiềm cho việc sản xuất GABA Đề tài “Khảo sát điều kiện lên men chuyển hóa acid glutamic thành GABA từ hạt bụp giấm Lactobacillus Plantarum” với mong muốn khảo sát điều kiện tối ưu để sản xuất GABA từ nguyên liệu, xem xét tiềm để sản xuất GABA từ bột hạt bụp giấm vi khuẩn Lactobacillus Plantarum Đồng thời khảo sát cho khà sản xuất GABA với giá thành thấp từ bột hạt bụp giấm CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG 2.1 Các phương pháp xác định thành phần hóa học hạt bụp giấm 2.1.1 Xác định độ ẩm Phương pháp: Xác định độ ẩm phương pháp sấy tới khối lượng không đổi Nguyên tắc: Dùng không khí nóng làm bay nước nguyên liệu, từ chênh • • lệch khối lượng mẫu trước sau sấy tính độ ẩm nguyên liệu Hóa chất, dụng cụ, thiết bị: Dụng cụ: Chén sấy có nắp, đũa thủy tinh, bình hút ẩm Thiết bị: Cân phân tích số lẻ, tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ Tiến hành: Bước 1: Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ • • • • Bật tủ sấy, cài đặt nhiệt độ 100 – 105 °C Rửa sạch, sấy khô làm nguội chén sấy bình hút ẩm Cân khối lượng chén sấy: mo (g) Tiếp tục sấy đến khối lượng chén không đổi (chênh lệch khối lượng hai lần cân liên tiếp không 0.0005 g) Bước 2: Chuẩn bị mẫu • Cân – 10 g mẫu (đã xay nghiền) xác đến 0.0001 g vào chén sấy • Cân khối lượng chén sấy có mẫu: m1 (g) Bước 3: Tiến hành sấy • Cho chén sấy chứa mẫu vào tủ sấy 100 – 105 °C • Làm nguội bình hút ẩm 30 phút cân • Tiếp tục sấy đến khối lượng mẫu không đổi (chênh lệch khối lượng hai • • lần cân liên tiếp không lớn 0.0005 g) Thời gian sấy lần 30 phút Cân mẫu kết thúc trình sấy: m2 (g) Tính kết quả: Độ ẩm X tính phần trăm theo công thức: X (%) = m1 − m2 × 100 m1 − m0 Trong đó: m0: khối lượng chén sấy (g) m1: khối lượng chén sấy mẫu trước sấy (g) m2: khối lượng chén sấy mẫu sau sấy (g) Kết cuối trung bình cộng kết thử song song, tính xác đến 0.1% Chênh lệch kết lần thử không lớn 0.3% 2.1.2 Xác định hàm lượng tro Phương pháp: Vô hóa mẫu Nguyên tắc: Tro hóa mẫu nhiệt sau xác định hàm lượng tro phương pháp khối lượng Hóa chất, dụng cụ, thiết bị: • Dụng cụ: Chén nung thạch anh sứ, bình hút ẩm • Thiết bị: Cân phân tích số lẻ, tủ sấy, lò nung điều chỉnh nhiệt độ từ 500 – 600 °C Tiến hành: Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị Rửa chén nung nước sạch, sấy tủ sấy 105 °C 30 phút sau nung lò nung 525 ± 25 °C 30 phút Làm nguội bình hút ẩm 30 phút cân xác đến 0.0001 g Quá trình nung lập lại khối lượng chén không đổi (chênh lệch hai lần cân không 0.0005 g) Bước 2: Chuẩn bị mẫu • • • • Cân 10 – 20 g mẫu với độ xác 0,0001 g cho vào chén nung chuẩn bị Cân khối lượng chén nung chứa mẫu Sấy tủ sây nhiệt độ 105 °C đến khô ( khoảng – giờ) Đốt cẩn thận bếp điện đến than hóa Bước 3: Tiến hành nung • Nung nhiệt độ 525 ± 25 °C thu tro màu trắng ngà (khi có mặt • sắt có màu đỏ gạch, có mặt đồng mangan có màu xanh nhạt) Làm nguội bình hút ẩm Quá trình nung lặp lại chén nung có khối lượng không đổi (chênh lệch hai lần cân không lớn 0.0005 g) Tính kết quả: Hàm lượng tro X tính phần trăm theo công thức: X (%) = m − m0 × 100 m1 − m0 Trong đó: m0: khối lượng chén nung (g) m1: khối lượng chén nung mẫu trước nung (g) m2: khối lượng chén nung mẫu sau nung (g) Kết cuối trung bình cộng kết thử song song, tính xác đến 0.01% Chênh lệch kết lần thử không lớn 0.02% 2.1.3 Xác định hàm lượng Nitơ tổng phương pháp Kjeldalh Nguyên tắc Số đĩa lý thuyết- hiệu lực cột N Số đĩa lý thuyết đại lượng biểu thị hiệu cột điều kiện sắc ký định Mỗi đĩa lý thuyết cột sắc ký giống lớp pha tĩnh có chiều cao H, tất nhiên lớp có tính chất động, tức khu vực hệ phân tách mà cân nhiệt động học thiết lập nồng độ trung bình chất tan pha tĩnh pha động Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố: • Đường kính độ hấp phụ hạt pha tĩnh • Tốc độ độ nhớt (độ phân cực) pha động • Hệ số khuyếch tán chất cột Vì với điều kiện sắc ký xác định chiều cao H định chất phân tích số đĩa lý thuyết cột xác định Hiệu lực cột (số đĩa lý thuyết) N tính sau: Trong đó: tR: thời gian lưu chất phân tích W0,5: độ rộng điểm 1/2 Peak Trong thực tế N nằm khoảng 2500 đến 5500 vừa đủ Độ phân giải R (Resolution) Độ phân giải đại lượng biểu thị độ tách chất khỏi điều kiện sắc ký cho Độ phân giải Peak cạnh nhau, tính theo công thức sau: Trong đó: tRB , tRA: thời gian lưu peak liền kề WB, WA: độ rộng peak đo đáy peak Các giá trị tRB , tRA, WB, WA phải tính theo đơn vị Yêu cầu R > 1, giá trị tối ưu R = 1,5 2.4.6.Phân loại kỹ thuật HPLC Các kỹ thuật HPLC bản: sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion sắc ký loại cỡ (rây phân tử) Sắc ký phân bố Pha tĩnh Pha tĩnh sắc ký phân bố lớp mỏng chất hữu lỏng phủ bề mặt chất mang silica chất liệu khác Các tiểu phân chất mang thường có đường kính 3-10 μm, cỡ hạt tăng đến 50 μm lớn cho sắc ký điều chế Sắc ký dùng loại pha tĩnh gọi sắc ký lỏng-lỏng (LLC: Liquid-Liquid Chromatography) Nhưng kiểu pha tĩnh có nhược điểm bị rửa trôi dần theo dòng pha động Kết quả, hiệu lực cột bị giảm dần trình sử dụng Để khắc phục nhược điểm trên, người ta sử dụng kỹ thuật sắc ký pha liên kết (BPC: Bonded-Phase Chromatography) Trong kỹ thuật này, pha tĩnh liên kết hoá học với chất mang Kỹ thuật nhanh chóng trở thành kỹ thuật phổ biến HPLC Trong loại pha tĩnh này, nhóm chức hữu liên kết với bề mặt tiểu phân silica qua nhóm silanol Tính phân cực loại pha tĩnh phụ thuộc vào tính phân cực nhóm chức liên kết, chúng vùng từ nhóm không phân cực octadecyl silan đến nhóm phân cực nitril Một số pha liên kết thường dùng: octyl, octadecyl, phenyl, cyanopropyl, aminopropyl, diol Pha động Ái lực thành phần pha tĩnh hay nói cách khác, thời gian lưu cột điều khiển cách thay đổi độ phân cực pha động Pha động dung môi đơn hay hỗn hợp 2, hay thành phần Người ta thay đổi độ phân cực pha động cách thay đổi tỷ lệ thành phần dung môi hỗn hợp Kỹ thuật thay đổi liên tục thành phần dung môi thời gian chạy sắc ký gọi rửa giải gradient chương trình hoá dung môi Tuỳ thuộc vào việc sử dụng pha động pha tĩnh người ta chia sắc ký phân bố thành loại (sắc ký pha thuận sắc ký pha đảo): Sắc ký pha thuận (normal phase): Trong kỹ thuật người ta sử dụng chất nạp cột – pha tĩnh (packings) gồm nhóm phân cực liên kết với chất mang nhóm alkylnitril [-(CH 2)nCN] alkylamin [(CH2)nNH2] Dung môi sử dụng dung môi sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn – LSC) Kỹ thuật này, sử dụng pha tĩnh phân cực pha động, gọi sắc ký phân bố pha thuận Sự phân tách đạt sắc ký pha thuận tương tự LSC Song pha tĩnh sắc ký pha liên kết có ưu điểm pha tĩnh LSC như: • • • • Cột nhanh đạt cân nên thuận lợi cho phân tách gradient Cột thích hợp với nhiều dung môi dễ tái sinh Cột bền Cột alkylamin có chức cột trao đổi anion yếu Pha động sắc ký pha thuận nói chung không phân cực, thường dùng hỗn hợp hydrocarbon mạch thẳng pentan, hexan, heptan, isooctan Các dẫn chất halogen dãy béo sử dụng diclorometan, dicloroetan, butyl clorid cloroform Có thể thêm vào pha khan nước 1-2% acid acetic phosphoric để ngăn cản ion hoá chất phenol, acid carboxylic Ngược lại, ion hoá base yếu kìm lại cách thêm lượng nhỏ amoniac amin khác (0,1-1%) Ngoài thêm vào pha động chất cải biến hữu (organic modifier) khác alcohol, tetrahydrofuran Nói chung, việc đuổi khí hoà tan không thành vấn đề với dung môi pha thuận Trong kỹ thuật sắc ký pha thuận chất không phân cực rửa giải sớm Thứ tự rửa giải chậm dần theo chiều tăng độ phân cực thành phần mẫu thử Ứng dụng sắc ký pha thuận: để tách phân tích hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn Sắc ký pha đảo (reversed phase): Trong kiểm nghiệm thực phẩm phương pháp HPLC, sắc ký phân bố pha đảo sử dụng nhiều Trong kỹ thuật pha tĩnh bao gồm nhóm không phân cực octadecyl (C18), octyl (C8) hay phenyl (C6H5) Pha động dung môi phân cực nước, methanol (MeOH), acetonitrile (ACN), dioxin, tetrahydrofuran (THF) dimethylformamid Tóm lại, pha động phân cực pha tĩnh Độ chọn lọc kỹ thuật khác biệt đáng kể với trình tách pha thuận Người ta thấy rằng, chất tan tốt nước rửa giải khỏi cột nhanh Quy tắc rửa giải ngược với pha thuận Một số thành phần khác thêm vào pha động acid, base, đệm, chất diện hoạt Cặp dung môi sử dụng phổ biến sắc ký pha đảo là: H2O-MeOH H2O-ACN Điều dễ nhận thấy, MeOH có nhược điểm độ nhớt cao làm giảm hiệu lực cột Trong ACN có độ nhớt thấp hơn, thích hợp với chất không phân cực thường dùng nhiều MeOH Thời gian lưu ngắn nồng độ ACN nồng độ MeOH Lưu ý: • Khi pha động có thêm muối vô chất hoạt động bề mặt, nên lọc trước dùng có cặn không tan nước gây bẩn cột • Việc đuổi khí quan trọng với pha động sắc ký pha đảo • Về thứ tự rửa giải: sắc ký pha đảo chất phân cực trước, chất không phân cực sau Ứng dụng sắc ký pha đảo: dùng phân tích hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết hợp chất hữu có mạch carbon dài (ít phân cực) thích hợp cho phân tích SKPĐ Sắc ký cặp ion (IPC: Ion-Pair Chromatography) Sắc ký cặp ion dựa sở tạo thành cặp ion cần phân tích mang điện với tác nhân tạo cặp mang điện trái dấu (đối ion) Nhìn chung, IPC thực chất HPLC pha đảo Dung môi: dung môi pha đảo, thường phối hợp H 2O-MeOH H2O-ACN Điểm quan trọng phải đảm bảo thuốc thử tạo cặp ion tan hết pha động để tránh kết tủa hệ thống Đối ion: đối ion thường amin bậc muối sunfonat Cần phải điều chỉnh pH pha động với đệm tới giá trị thích hợp Đồng thời phải kiểm tra độ tan đệm dung môi trước bơm qua hệ sắc ký Cột: dùng chất nạp pha đảo với nhóm alkyl C2, C8 C18 … Sắc ký cặp ion phức tạp sắc ký phân bố pha đảo, vì: • Cân pha tĩnh thuốc thử tạo cặp ion diễn chậm • Sự hình thành cặp ion phụ thuộc vào pH dung dịch, nồng độ thuốc thử tạo cặp, nhiệt độ Do trình cân diễn chậm nên người ta khuyên không nên dùng rửa giải gradient cho sắc ký cặp ion Sắc ký hấp phụ hiệu cao (LSC: Liquid-Solid Chromatography) Là kỹ thuật phát triển sớm dùng phổ biến Trong kỹ thuật này, chất cần phân tích bị giữ bề mặt pha tĩnh (chất hấp phụ) bị dung môi đẩy (phản hấp phụ) Pha tĩnh silicagel, nhôm oxyd … silicagel dùng nhiều Pha động thường dung môi không phân cực Khi rửa giải, chất không phân cực trước, chất phân cực chậm Ứng dụng sắc ký hấp phụ: Các chất phân tích có khối lượng phân tử 5000, tan nước hỗn hợp nước-dung môi hữu Người ta cần dùng sắc ký pha thuận, đặc biệt sắc ký hấp phụ để tách hỗn hợp chất • Sắc ký hấp phụ mạnh việc tách đồng phân vị trí hợp chất hữu • Ngoài sắc ký hấp phụ ứng dụng nhiều phân tích chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm Sắc ký trao đổi ion (IEC: Ion-Exchange Chromatography) Sắc ký trao đổi ion dùng để phân tách thành phần ion hoà tan nước, có phân tử lượng nhỏ 1500 Pha tĩnh nhựa trao đổi ion dạng bột mịn Đó hợp chất hữu cao phân tử có chứa nhóm chức có khả trao đổi ion • Nhựa có nhóm hoạt động mang điện tích âm, dùng để tách chất bazơ amin • Nhựa có nhóm hoạt động tích điện dương để phân tách chất có nhóm mang điện âm, nhóm phosphate, sulfonat, carboxylat pH pha động, nhiệt độ, loại ion, nồng độ ion chất cải biến hữu ảnh hưởng đến cân bằng, điều chỉnh để thu kết tách mong muốn Ứng dụng nhựa trao đổi ion: • Dùng cân trao đổi ion để tinh chế nguyên liệu loại tạp chất • Dùng nhựa trao đổi ion để tăng nồng độ thành phần vi lượng dung dịch đủ cho phân tích Trong sắc ký ion, chất phân tích ion đưa vào đầu cột nhồi nhựa trao đổi ion thích hợp Rửa giải thực dung dịch có ion đủ sức đẩy ion phân tích bị lưu giữ khỏi bề mặt nhựa Sắc ký loại cỡ (SEC: Size Exclusion Chromatography) Phương pháp SEC ứng dụng chủ yếu để phân tách chất có phân tử lượng (MW) lớn 2000 Pha tĩnh hạt xốp silicagel hay polymer Các phân tử chất phân tích lọc theo cỡ khối lượng phân tử Khi cho hỗn hợp cần phân tách qua cột, ta thấy: • Các phân tử có MW lớn, chạy nhanh qua cột, chúng không bị lưu lại • Các phân tử có MW nhỏ bị lưu giữ cột Khi rửa giải chúng khỏi cột với thời gian lưu tăng theo chiều giảm khối lượng phân tử 2.4.7.Cấu tạo nguyên lý hoạt động hệ thống HPLC Máy HPLC bao gồm phận sau: bình chứa pha động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào cột, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy tích phân máy ghi Hình 17 Cấu tạo hệ thống HPLC Trong hình 17: 1- Bình chứa dung môi pha động 2- Bộ phận khử khí 3- Bơm cao áp 4- Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay Autosample) 5- Cột sắc ký (Pha tĩnh) (để ngòai môi trường hay điều nhiệt) 6- Detector (nhận tín hiệu) 7- Hệ thống máy tính có phần mềm xử lý liệu điều khiển hệ thống HPLC 8- In liệu Hệ bơm Hệ bơm HPLC có chức tạo áp suất cao để đẩy pha động từ bình dung môi qua cột sắc ký Hệ bơm đại điều khiển máy tính lập chương trình để thay đổi tỷ lệ thành phần pha động theo yêu cầu (sắc ký gradient) Bơm HPLC cần phải đáp ứng số yêu cầu: tạo áp suất cao 3000-6000 psi (250-500 atm), lưu lượng bơm khoảng 0,1-10 ml/phút, không bị ăn mòn với thành phần pha động, có tốc độ bơm không đổi Hiện có loại bơm thường gặp: Bơm đẩy piston (single piston pump): Loại bơm có piston lam ngọc (sapphire), đường kính 3-4mm, dài khoảng 4cm, di chuyển xy lanh thép không gỉ dung tích thường 250μl Dung tích giảm xuống 2-5μl để dùng cho cột đường kính nhỏ Bơm đẩy piston cho lưu lượng dòng 0,022 ml/phút 0,210 ml/phút áp suất 6000psi Nhược điểm: dùng bơm piston, dòng chảy xuất xung dòng (flow pulses) Chúng gây nhiễu detector, làm giảm độ nhạy Để loại trừ giảm thiểu xung người ta dùng bơm đẩy kéo bơm làm đầy nhanh Bơm làm đầy nhanh (rapid refill pump): Bơm có xy lanh dùng chung piston Nguyên lý hoạt động: piston di chuyển bên trái, pha động bơm vào cột Cùng lúc pha động từ hệ cấp vào buồng bên phải Khi piston di chuyển trở lại bên phải, lượng pha động buồng phải đẩy buồng bên trái với tốc độ lớn 100 lần so với tốc độ pha động vào cột Vì giảm xung rõ rệt chu kỳ làm đầy buồng bên trái Nếu dùng chương trình dung môi buồng phải làm đầy hỗn hợp, sau chuyển sang làm đầy buồng trái Đây hệ thống bơm thường dùng, rẻ loại bơm kép (với bơm piston) Bơm kép đẩy kéo (twin-headed reciprocating pump): Đây hệ thống kết nối bơm piston hãng Waters thiết kế sử dụng lần Hai bơm nối đầu với Có đường pha động vào đến cột chung Khi piston bơm bên trái tiến lên đẩy pha động vào cột, đồng thời piston bơm bên phải hút pha động từ hệ cấp đầy bơm Sau piston bơm bên phải tiến lên đẩy pha động vào cột, đồng thời kéo piston bơm bên trái lùi lại lấy pha động vào Quá trình đẩy kéo piston tiếp tục Hệ tiêm mẫu Có thể dùng bơm tiêm để tiêm mẫu vào đầu cột Phương pháp phổ biến dùng van tiêm có vòng chứa mẫu (sample loop) có dung tích xác định xác, thay đổi vòng chứa mẫu với dung tích khác Một số máy HPLC đại có hệ tiêm mẫu tự động lập trình điều khiển thể tích mẫu, số lần tiêm chu kỳ rửa vòng chứa mẫu Cột Cột dùng phổ biến làm thép không gỉ, thông thường có chiều dài 10-30 cm, đường kính 2-5 mm Cột có đường kính lớn dùng cho sắc ký điều chế Cột làm nóng để đạt hiệu phân tách tốt hơn, tiến hành nhiệt độ 600C nhiệt độ làm suy giảm hiệu lực cột làm pha động bay Chất nạp thường silicagel silicagel có bao lớp mỏng hữu liên kết hoá học với nhóm chất hữu Bên cạnh silicagel người ta dùng chất liệu khác như: nhôm oxyd, polyme xốp, nhựa trao đổi ion, … Cột nhồi: hạt nhồi thường có kích cỡ 5-10μm Số đĩa lý thuyết dao động 40.000-60.000 đĩa/m Gần người ta có loại cột nhỏ (microcolumn) với đường kính 1-2mm, dài 3-7cm Loại cột nhồi hạt cỡ 3-5μm, có trị số N đến 100.000 đĩa/m Ưu điểm bật chúng chạy sắc ký tốn dung môi thời gian Cột bảo vệ (guard column): cột bảo vệ đặt trước cột sắc ký để loại chất làm giảm tuổi thọ cột sắc ký có mặt pha động mẫu phân tích Cột bảo vệ ngắn cột sắc ký, nhồi hạt loại kích thước hạt lớn Điều nhiệt cột: sắc ký lỏng, khác với sắc ký khí, vận hành thiết bị thường nhiệt độ phòng không cần điều nhiệt cột Tuy nhiên máy sắc ký lỏng đại thường trang bị thêm hệ thống điều nhiệt cột đến 1500C với độ xác đến 0,10C Detector Detector phận phát đo tín hiệu sinh có chất khỏi cột tín hiệu ghi dạng peak sắc ký đồ Các loại detector dùng nay: • Detector tử ngoại khả biến (UV-VIS) có bước sóng tuỳ chọn, dùng phổ biến • Detector dãy diod DAD (diode array detector) Detector luôn có tỷ lệ tín hiệu nhiễu thấp so với detector UV-VIS bình thường • Detector đo số khúc xạ • Detector huỳnh quang, điện hoá Detector hấp thụ UV-VIS: Đây detector sử dụng phổ biến sắc ký lỏng dựa hấp thu xạ UV-VIS (trong khoảng 190-800nm) chất phân tích Tế bào đo detector ống hình trụ đường kính 1mm, chiều dài 10mm Ba cấu hình detector hấp thụ UV-VIS: • Detector đo bước sóng cố định: Nguồn sáng đèn thuỷ ngân đèn Wonfram với kính lọc để chọn số bước sóng 254, 280, 334 436 nm Detector loại linh hoạt sử dụng rẻ tiền • Detector đo bước sóng thay đổi: Có thể đo bước sóng vùng UV-VIS, cho phép lựa chọn bước sóng có đáp ứng tối ưu detector chất phân tích Hệ thống tạo bước sóng đơn sắc bao gồm nguồn sáng đèn D2 đèn Wonfram thiết bị đơn sắc hoá kết nối với ống nhân quang Detector mảng diod (diod array detector-DAD): Detector có mảng diod để nhận xạ tán sắc từ cách tử kẻ vạch laser (holographic grating) Quang phổ sắc ký đồ hiển thị hình nhờ phần mềm hệ thống xử lý tín hiệu máy tính Có thể gọi DAD detector sóng quét bên cạnh detector đo bước sóng cố định thay đổi Mặt khác, hệ thống cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng thời gian Detector huỳnh quang (fluorescence detector): Có thể sử dụng thiết bị huỳnh quang kính lọc (filter fluorimeter) quang phổ huỳnh quang (spectrofluorimeter) cho detector huỳnh quang Loại detector chọn lọc nhạy (có thể đến 1000 lần) detector hấp thụ UV Nó đáp ứng với chất phát huỳnh quang như: hợp chất thơm đa vòng, dẫn xuất quinolin, steroid alkaloid Có thể dùng thuốc thử tạo huỳnh quang để làm dẫn chất hoá (trước cột sau cột) chất phân tích Do có độ nhạy cao nên detector huỳnh quang sử dụng cho phân tích vết kiểm soát môi trường, giám định pháp y, … Detector số khúc xạ (refractive index detector-RID): Đây detector vạn đáp ứng với hầu hết chất phân tích độ nhạy detector hấp thụ UV đến 1000 lần Hoạt động detector theo nguyên lý đo vi sai Tín hiệu đo khác số khúc xạ (RI) pha động pha động hoà tan chất phân tích Tín hiệu có giá trị dương âm Detector khúc xạ nhạy với nhiệt độ khó sử dụng cho rửa giải theo chế độ gradient khó so sánh trị số RI mẫu pha động thành phần pha động thay đổi Detector khúc xạ nhạy, có khoảng tuyến tính hẹp nên phạm vi sử dụng bị hạn chế Detector tán xạ bay (evaporative light scattering detector-ELSD): Đây detector vạn đáp ứng với chất phân tích bay so với pha động sắc ký lỏng Dịch rửa giải từ cột sắc ký vào đầu detector trộn lẫn với khí nitơ phận phun sương (nebulizer) Hỗn hợp qua kim nhỏ phân tán thành đám sương mù (dropler) kích thước Ở dung môi bay loại khỏi hạt sương, hạt rắn mịn tạo thành Các hạt rắn cắt ngang chùm tia laser Chùm tia laser bị tán xạ hạt rắn phát nhờ ống nhân quang Như chất phân tích phát nhờ ánh sáng tán xạ tạo tín hiệu điện Đáp ứng detector liên quan đến khối lượng chất phân tích, nghĩa diện tích peak sắc ký tỷ lệ thuận với khối lượng Trong detector UV, diện tích peak tỷ lệ với hệ số hấp thu: khối lượng nhỏ chất hấp thu mạnh UV cho tín hiệu hấp thu mạnh chất có khối lượng lớn hấp thu yếu Detector khác với detector khúc xạ, thích hợp với chế độ rửa giải gradient; khác với detector UV, độc lập với độ hấp thụ UV nhóm chức Detector điện hoá (electrochemical detector): Detector điện hoá phát chất phân tích dựa vào độ dẫn điện pha động có chứa chất phân tích dạng ion dòng điện tạo thành phản ứng oxy hoá khử điện xác định • Detector độ dẫn (conductivity detector): Dịch rửa giải từ cột trước đến buồng đo dẫn qua phận khử ion (suppressor) Đây cột ngắn cài vào sau cột phân tích máy sắc ký lỏng, gọi cột khử, có nhiệm vụ loại ion pha động, giữ lại ion phân tích Cột khử nhồi nhựa trao đổi ion thích hợp Detector độ dẫn đặc biệt thích hợp cho sắc ký ion (IC) chất phân tích ion mang điện • Detector đo dòng (amperometric detector): Detector đo dòng có cấu tạo gồm điện cực: Điện cực công tác xảy phản ứng oxy hoá khử, chế tạo carbon thuỷ tinh (glassy carbon), bạch kim, vàng Điện cực so sánh thường điện cưc bạc cloride Điện cực bổ trợ thường thép không gỉ Các điện cực cài vào dòng pha động Điện cực thị phân cực điện để tạo dòng oxy hoá Tín hiệu dòng đo gửi tới hệ thống xử lý liệu Đây detector vào loại nhạy Tuy nhiên nhược điểm điện cực dễ bị nhiễm bẩn 2.4.8.Hướng dẫn chọn kỹ thuật HPLC phù hợp Trong HPLC có kỹ thuật sắc ký bản: phân bố, hấp thụ, trao đổi ion sắc ký loại cỡ Muốn chọn kỹ thuật sắc ký thích hợp để phân tách hỗn hợp, phải dựa vào đặc tính lý, hoá học chất thành phần: Tính tan: tan hay không tan nước Phân tử lượng (MW) Tính phân cực: ion hoá hay không ion hoá Nếu phân tử lượng lớn 2000: nên sử dụng sắc ký rây phân tử Dùng dung môi nước mẫu thử tan nước Nếu mẫu tan dung môi hữu cơ, dùng dung môi hữu làm pha động Pha tĩnh Sephadex (dextran) μ Bondagel Series E pha động nước Còn Styragel gel MicroPak TSK dùng pha động hữu Nếu phân tử lượng 2000: trước hết phải xác định mẫu có tan nước hay không • Nếu mẫu không tan tan nước sử dụng sắc ký trao đổi ion phân bố pha đảo Nếu độ tan tăng lên thêm acid kiềm dùng kỹ thuật trao đổi ion Nếu độ tan không bị ảnh hưởng acid kiềm dung dịch nước hoàn toàn trung tính nên chọn sắc ký phân bố pha đảo Nếu mẫu tan nước nên sử dụng sắc ký phân bố pha thuận LSC Để tách đồng phân nên dùng LSC Để tách đồng đẳng nên dùng sắc ký phân bố Những thông tin gợi ý ban đầu, không mang tính bắt buộc Để đảm bảo việc phân tích sắc ký thành công nhà kiểm nghiệm cần phải tiến hành khảo sát thực nghiệm 2.4.9.Định lượng GABA HPLC (Yingguo Lü CS, 2010) Chuẩn bị mẫu có chứa GABA: Các mẫu có chứa GABA lọc qua giấy lọc để tách bã sinh khối vi sinh vật Dung dịch FDNB (1% w/v) chuẩn bị cách hòa tan 1g FDNB 100ml Acetonitril bảo quản 40C trước sử dụng Dùng 1ml dung dịch GABA mẫu để kiểm tra, cho 1ml NaHCO 0,5 mol/L (pH = 9.0) 1ml FDNB (1%) thuốc thử vào bình định mức 10ml Lắc hỗn hợp 5s giữ tối 600C Sau làm mát hỗn hợp đến nhiệt độ phòng, tiếp tục cho vào dung dịch đệm phosphate (0,02 mol/L, pH = 7.0) Lắc hỗn hợp cho hỗn hợp qua màng lọc có kích thước mao quản 0,22 μm Dịch lọc đem phân tích HPLC nhằm định lượng GABA Hệ thống HPLC để định lượng GABA Việc xác định dẫn xuất từ mẫu thực HPLC với máy dò quang phổ UV 360 nm Một cột sắc ký pha đảo (Hanon Lichrospher C18, 250 mm x 4.6 mm, hạt có kích thước μm) Nhiệt độ cột trì 35 0C Các thành phần pha động tối ưu hóa gồm: dung môi A acetonitrile: H2O = 1: 1, dung môi B dung dịch đệm phosphate (0,02 mol/L, pH = 7.0).Cột cân theo tỷ lệ 16% dung môi A 84% dung môi B trước sử dụng microlit mẫu tiêm vào cột sắc ký, cột sẵn sàng chạy mẫu sau thời gian > 20 phút TÀI LIỆU THAM KHẢO Gurvinder Singh Bumbrah, Rakesh Mohan Sharma, 2015 Raman spectroscopy – Basic principle, instrumentation and selected applications for the characterization of drugs of abuse Elsevier, 1-7 Akiko Ishoikawa, 2009 Development of a method for the determination of Gamma amino butyric acid in food stuff J Nutr Sci Vitaminol, 55, 292-295 Yingguo Lü, Hui Zhang , Xiangyong Meng , Li Wang & Xiaona Guo (2010) A validated HPLC Method for the Determination of GABA by Pre-Column Derivatization with 2,4-Dinitrofluorodinitrobenzene and Its Application to Plant GAD Activity Study Analytical Letters, 43:17, 2663-2671 Diana, M., Quílez, J., Rafecas, M (2014) Gamma-aminobutyric acid as a bioactive compound in foods: a review Journal of functional foods, (10), 407– 420 Vidhu S Tiwari*, Altaf Khetani, Ali Momenpour T Monfared, Brett Smith, Hanan Anis, 2015 Detection of amino acid neurotransmitters by surface enhanced Raman scattering and hollow core photonic crystal fiber University of Ottawa Ottawa, ON K1N 6N5, Canada, Proc of SPIE Vol 8233 82330Q-1 Hà duyên Tư, 2009 Phân tích hóa học thực phẩm NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội https://en.wikipedia.org/wiki/Gamma-Aminobutyric_acid http://www.dost.danang.gov.vn/chi-tiet?articleId=10260 http://www2.hcmuaf.edu.vn/contents.php?ur=mnam&ids=1999 10 http://www.biomedia.vn/review/quang-pho-raman-co-so-phuong-phap.html 11 http://www.ued.edu.vn/khoahoa/file.php/1/Giao_trinh/BG_Pho_C._Tho_.pdf 12 http://www.slideshare.net/nhattamnhattam/i-cng-v-cc-phng-php-quang-pho