Trường Đại học Tôn Đức Thắng Khoa: Khoa học ứng dụng Ngành công nghệ sinh học  Seminar: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN SVTH: Tân Thị Xuân Huyền Nguyễn Thị Lan Hương Hoàng Hồng Ngọc Phan Ngọc Bảo Nguyên http://www.ebook.edu.vn Mục Lục I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH: 1.1 Lịch sử phát chất kháng sinh 1.2 Định nghĩa kháng sinh: 1.3 Cơ chế tác dụng: 1.4 Đơn vị kháng sinh: II CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN: 2.1 Lịch sử phát sản xuất penicillin 2.2 Công thức cấu tạo penicillin 2.3 Những vi sinh vật sản sinh Penicillin đặc điểm dinh dưỡng chúng 2.4 Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin từ nấm mốc III QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT: 3.1 Đặc điểm chung: 3.2 Chuẩn bị lên men: 3.3 Kỹ thuật lên men: 3.3.1 Kỹ thuật lên men bề mặt: 3.3.2 Kỹ thuật lên men chìm: 3.4 Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên IV SẢN PHẨM: http://www.ebook.edu.vn I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH: 1.1.Lịch sử phát chất kháng sinh: Sự phát triển vi sinh vật học nói chung, vi sinh vật công nghiệp nói riêng, với bước ngoặt lịch sử phát minh vĩ đại chất kháng sinh Alexander Fleming (1982) mở kỷ nguyên y học: khai sinh ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho người Thuật ngữ" chất kháng sinh" lần Pasteur Joubert (1877) sử dụng để mô tả tượng kìm hãm khả gây bệnh vi khuẩn Bacillus anthracis động vật nhiễm bệnh tiêm vào động vật số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác Liên tiếp sau phát khác của: Babes (1885) nêu định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn chủng đặc tính tổng hợp hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm chủng đối kháng Nicolle (1907) người phát hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis có liên quan đến trình hình thành bào tử loại trực khuẩn Gratia đồng nghiệp (1925) tách từ nấm mốc chế phẩm sử dụng để điều trị hiệu bệnh truyền nhiễm da cầu khuẩn Mặc dù vậy, thực tế tới năm 1929 thuật ngữ "Chất kháng sinh" Alexander Fleming mô tả cách đầy đủ thức báo cáo chi tiết penicillin 1.2 Định nghĩa kháng sinh: Chất kháng sinh hiểu chất hoá học xác định, chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong phổ biến từ vi sinh vật), với đặc tính nồng độ thấp (hoặc thấp) có khả ức chế mạnh mẽ tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh mà đảm bảo an toàn cho người hay động vật điều trị 1.3 Cơ chế tác dụng: Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay đối tượng gây bệnh khác gọi tắt mầm bệnh) chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy http://www.ebook.edu.vn thuộc vào chất kháng sinh đó; đó, kiểu tác động thường gặp làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức điều tiết trình vận chuyển vật chất màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả trình sinh tổng hợp protein, rối loạn trình tái ADN, tương tác đặc hiệu với giai đoạn định chuyển hóa trao đổi chất Hình Vị trí tác dụng số chất kháng sinh 1.4 Đơn vị kháng sinh: Năng lực tích tụ kháng sinh chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường biểu thị đơn vị : mg/ml, μg/ml, hay đơn vị kháng sinh UI/ml (hay UI/g, International Unit http://www.ebook.edu.vn II CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN 2.1 Lịch sử phát sản xuất penicillin: Penicillin phát tình cờ vào năm 1928 Alexander Fleming, nhận thấy hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm Ông sử dụng tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh (1929) Sau đó, Mỹ triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931) Tuy nhiên, khoảng thời gian nỗ lực nhằm tách tinh chế penicillin từ dịch lên men thất bại không bảo vệ hoạt tính kháng sinh chế phẩm tinh chế vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên Năm 1938 Oxford, tìm lại tài liệu khoa học công bố, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh Fleming ông đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu Ngày 25/05/1940 penicillin thử nghiệm thành công chuột Năm 1942, tuyển chọn chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) sau biến chủng P chrysogenum Wis Q - 176 (chủng xem chủng gốc hầu hết chủng công nghiệp sử dụng toàn giới ); thành công việc điều chỉnh đường hướng trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944) http://www.ebook.edu.vn Hình Các tác giả giải thưởng Nobel y học năm 1945 công trình penicillin Penicillin xem loại kháng sinh phổ rộng, ứng dụng rộng rãi điều trị sản xuất với lượng lớn số chất kháng sinh biết Chúng tác dụng lên hầu hết vi khuẩn Gram dương thường định điều trị trường hợp viêm nhiễm liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ viêm màng não, viêm tai - mũi - họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu Thời gian đầu penicillin ứng dụng điều trị hiệu Tuy nhiên, vài năm sau xuất trường hợp kháng thuốc tượng ngày phổ biến Vì 1959, Batchelor đồng nghiệp tách axit 6aminopenicillanic Đây nguyên liệu để sản xuất hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Đối với Việt Nam, năm 1946, giáo sư Đặng Văn Ngữ thành công việc sản xuất nước lọc penicillin môi trường nước ngô góp phần đáng kể vào việc cứu chữa thương bệnh binh Bác Hồ thưởng Huân chương Lao động hạng ba cho thành tựu kỳ diệu chưa làm 2.2 Công thức cấu tạo penicillin: Penicillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm vòng thiazolidine, vòng β-lactam, nhóm amino có gắn với CO2 mạch bên (R) Tất penicillin dẫn suất acid 6-aminopenicillanic Sự thay R http://www.ebook.edu.vn tạo nhiều acid amin khác hầu hết penicillin phân phối dạng muối natrii muối kali Hình Cấu tạo chung phân tử penicillin Ngày giới sản xuất 500 chế phẩm penicillin ( lên men trực tiếp hai sản phẩm penicillin V penicillin G) tiếp tục triển khai để sản xuất chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Hình 2: Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum Cấu trúc không gian Penicillin http://www.ebook.edu.vn 2.3 Những vi sinh vật sản sinh Penicillin đặc điểm dinh dưỡng chúng: Những vi sinh vật sinh penicillin thuộc giống nấm mốc penicillium Aspergillus Nhưng chúng thuộc nhóm Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum có hoạt lực cao dùng công nghiệp kháng sinh Những chủng nuôi cấy phương pháp bề mặt sở chất tự nhiên tạo thành 10-15đv/ml kháng sinh Penicilillium chrysogenum môi trường Raistrik tạo thành hai kiểu khuẩn lạc: Kiểu 1: khuẩn lạc tròn trặn, nếpnăhn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt có màu xanh, theo rìakhuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm khuẩn ty bạc trắng bào tử, khuẩn ty chất màu nâu, chất màu không hòa vào môi trường Kiểu 2: Khuẩn lạc có khuẩn ty màu trắng phát triển yếu, khuẩn ty chất có màu nâu Khuẩn lạc kiểu cho hoạt lực cao, kiểu thường xuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp Vì cần phải tách khuẩn lạc kiểu môi trường thường xuyên kiểm tra để chọn khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ đặc tính giống Các chủng penicillium nuôi cấy đĩa petri http://www.ebook.edu.vn chủng Penicillium nuôi cấy đĩa petri Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại ổn định Đặc tính đặt cho nhà vi sinh vật nhiệm vụ khó khăn: tạo khả sinh kháng sinh cao nhất, giữ ổn định trình nghiên cứu sản xuất Nhiệm vụ có ý nghĩa lớn công nghiệp, giống bảo vẹ kệ, trạng thái đông khô tới năm, đất vô trùng năm Ngày nhờ di truyền học tạo giống ổn định, sau hệ không làm giảm hoạt tính kháng sinh Penicillin thường biến đổi hình thái giảm khả sinh kháng sinh Khi xảy biến đổi sinh hàng loạt chủng từ giống nhiệm vụ nhà vi sinh vật lúcnày phải chọn lại khuẩn lạc khỏe có nhiều ưu điểm, cần phải tiến hành biện pháp bảo quản thích hợp Trong trình nuôi cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải qua sáu giai đoạn phát triển: Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ, tế bào chất chưa phân hóa Thỉnh thoảng không bào có hạt nhỏ bắt màu đỏ trung tính Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, hạt nhỏ không bào biến Ở cuối giai đọan xuất giọt chất béo nhỏ Giai đoạn III: Tạo thành giọt chất béo to, không không bào, tế bào chất ưa kiềm http://www.ebook.edu.vn Giai đoạn IV: Xuất không bào với hạt dễ bắt màu đỏ trung tính, hạt chất béo nhỏ giai đọan III, tính ưa kiềm giảm Giai đoạn V: Khuẩn ty có hình trống có chứa không bào, có một vài hạt lớn Các hạt chất béo biến Tính ưa kiềm tiếp tục giảm Giai đoạn VI: Khuẩn ty giữ hình dạng hình trống hạt bắt màu trung tính, không bào bắt màu da cam hoặcmàu hồng đồng Các hạt chất béo không Xuất tế bào riêng biệt bắt đầu tự phân Quá trình lên men penicillin thuộc vào loại lên men hai pha: pha sinh trưởng (ứng với giai đoạn I, II, III) pha sinh penicillin ( giai đoạn IV, V, VI ) Nguồn carbon lên men penicillin nấm penicillium chrysogenum glucuza, sacaroza, lactoza, tinh bột, dextrin, axit hữu (lactic, axetic, formic), axit amin…đường lactoza cho hiệu xuất penicillin cao thường dùng công nghiệp nấm thường sử dụng lactoza chậm vậy, thực tế lactoza dùng phối hợp đường khác (glucoza, sacaroza…) môi trường dinh dưỡng Trong pha lên men thứ giống phát triển mạnh, sử dụng glucoza axit lactic cao ngô Sau lactoza đựoc sử dụng ( chủ yếu pha tạo penicillin) Khi môi trường cạn lactoza không bổ sung chất dinh dưỡng, hệ sợi nấm bắt đầu tự phân, tiếp tục lên men nồng độ pecicillin giảm, thực tế cần kết thúc trước thời điểm Nguồn nitơ: hợp chất hữu (axit amin, pepton, protein) vô (amoniac, muối amon nitrat) Amoniac nấm penicillium chrysogenum đồng hóa nhanh trình nuối cấy N-NH3 tạo thành từ cao ngô phản ứng khử amin hợp chất nitơ Nấm mốc sử dụng NNH3 trước tiên nồng độ chất thời gian đầu tăng lên, tốc độ sinh trưởng, phát triển nấm mốc tiếp tục giảm hệ sợi mốc tự phân Tốc độ sử dụng amoniac phụ thuộc nguồn carbon môi trường Trong trường hợp nguồn carbon glucoza, sacaroza nguồn carbon dễ tiêu hóa khác, http://www.ebook.edu.vn 10 Giống penicillium chrysogenum Chuẩn bị môi trường nhân giống Nhân giống Nguyên liệu Chuẩn bị môi trường lên men Lên men Tách tinh chế Sản phẩm penicillin SƠ ĐỒ CÔNG NGHỆ LÊN MEN NỔI PENICILLIN • Quá trình nhân giống Quá trình nhân giống giống có ống nghiệm Trong nhà máy, lần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm ống Một ống dùng kiểm tra trước sản xuất, ống dùng để sản xuất ống dùng để bảo quản Song song đó, người ta chuẩn bị bình tam giác dung tích 200 – 250 ml chuẩn bị 50 g môi trường phần trình bày Môi trường trùng làm nguội đến 30oC Đổ 10ml trùng làm nguội vào ống giống, dùng que thủy tinh đánh cho bào tử hòa trộn với nước Bằng biện pháp vô trùng (thực tủ nuôi cấy vô trùng) chuyển toàn vào bình tam giác lắc cho thật chuyển chúng sang tủ ấm 30 – 37oC Nuôi điều kiện chi đến bào tử nấm xuất phát triển khắp môi trường Ta gọi trình thực trình nhân giống cấp Cứ thực tiếp ta có giống cấp 2, cấp 3…cho đến đủ – 10% giống cho sản xuất http://www.ebook.edu.vn 22 Mỗi cấp độ nhân giống từ cấp sang cấp khác, khối lượng môi trường tăng từ 10 – 15 lần trường hợp ký người ta nuôi khay Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh nay, thuờng dùng chủng biến đổi gen Công nghệ biến đổi gen tạo hcủng siêu tổng hợp kháng sinh Theo Talaro (0993), từ chủng penicillin chrysogenum đẩu tiên có khả tồng hợp 6mg/ml, người ta có chủng biến đổi gen từ chủng gốc có khả sinh tồng hợp 85000mg/ml penicillin • Quá trình lên men Đối với phương pháp lên men nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sung đường lactose), môi trường khử trùng làm nguội đến 30oC, tiến hành trộn giống vào với tỷ lệ từ – 10% Các khay xếp chồng lên giá đỡ có khoảng cách định để thoáng khí thoáng nhiệt Quá trình lên men kéo dài – ngày nhiệt độ 24 – 28oC Nấm penicillinum qúa trình phát triển thường tạo nhiệt nấm Aspergillus Tuy nhiên, để tăng cường khả phát triển sinh tổng hợp, người ta thường thổi khí quạt gió có lắp hệ thống làm Trong lên men bề mặt người ta sử dụng môi trường lỏng môi trường lỏng dùng nuôi cấy bề mặt thu nhận penicillin bao gồm: Cao ngô (bắp) 50g Lactose 30g NaNO3 3g KH2PO4 0.5g MgSO4 0.25g Nước 1000g C6H5CH2COOH 0.2g ZnSO4 0.044g Ưu điểm phương pháp đường lactose nấm mốc đồng hóa chậm nên không xảy tượng dư thừa đường tế bào, dịch nước chiết ngô cung cấp cho nấm mốc nguồn thức ăn nitơ, chất khoáng chất sinh trưởng, phenylalanin bị thủy phân tạo thành phenylacetic cung cấp tiền chất tạo mạch nhánh cho phân tử penicillin Khi lên men môi trường lỏng, áp dụng công nghệ bổ sung liên tục phenylacetic vào môi trường lên men, hàm lượng bổ sung phụ thuộc pH môi trường thường 0,2-0,8 kg phenylacetic/m3 dịch lên men Dung dịch lên men sau khử trùng phân phối vào khay có kích thước giống khay nuôi cấy bề http://www.ebook.edu.vn 23 mặt với môi trường bán rắn Ở đáy khay không đục lỗ phải chứa môi trường lỏng Chiều cao dung dịch môi trường khay – cm người ta tiến hành lên men khoảng thời gian – ngày nhiệt độ lên men 24 – 28oC Tiến hành lên men điều kiện môi trường lỏng này, lượng penicillin G tổng hợp tăng rõ rệt hàm lượng penicillin khác giảm Để hạn chế trình oxy hóa tiền chất, thường phải bổ sung vào môi trường lượng nhỏ axit axetic Trong kỹ thuật lên men lỏng gián đoạn không điều chỉnh pH môi trường thường tăng nhẹ, sau tương đối ổn định vào cuối trình lên men thường khoảng pH = 6,8 – 7.4 Khi sử dụng chất lactose, người ta xác định penicillin tổng hợp tích tụ mạnh mẽ môi trường nấm mốc sử dụng đường lactose có dấu hiệu cạn kiệt sợi nấm bắt đầu tự phân Vì người ta thường kết thúc trình lên men vào thời điểm hết đường lactose 3.3.2 Kỹ thuật lên men chìm: Kỹ thuật len men chìm kỹ thuật áp dụng hầu hết cở sản xuất penicillin công nghiệp thay dần kỹ thuật lên men docó ưu đểm thường vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay bán liên tục) hay vài cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại phần hệ sợi mẻ lên men trước (hoặc không) Trong phương pháp lên men chìm môi trường sử dụng môi trường lỏng, người ta dùng cao ngô, glucose, hydrol,lactose, muối amon, thiosufat, photphat kali Natri, muối sufat magie, natri, đồng… • Quá trình nhân giống Trong trình lên men chìm người ta nhân giống môi trường lỏng Mục đích trình nhân giống thu nhận số lượng tế bào cao (thường tính tổng lượng tế bào/ml) Quá trình nhân giống bắt đầu việc chuyển giống từ ống nghiệm sang bình tam giác chứa sẵn môi trường nhân giống Người ta thường nhân giống vào bình lên men dung tích từ lít hàng ngàn lít Nhiệt độ http://www.ebook.edu.vn 24 trình nhân giống trì khoảng 26 ± 1oC thời gian nhân giống cấp độ khoảng 72 Người ta nhân giống penicillin mội reường với cácthành phần sau: Cao ngô 2% Nitrat amon 0.125% Kaliphotphat monoboric 0.2% Glucose 2% Sunfat magie 0.025% Lactose Sunfat natri 0.05% CaCO3 0.5% 0.5% • Quá trình lên men Quá trình lên men môi trường lỏng phương pháp lên men chìm để sản xuất penicillin vận hành theo phương pháp lên men hai pha: - Pha thứ nuôi thu sinh khối khoảng – ngày Trong pha hệ sợi phát triển mạnh chất dinh dưỡng dễ đồng hóa tế bào hấp thụ mạnh, tốc độ sinh sản nấm xảy nhanh, tạo thành penicillin bắt đầu - Pha thứ hai lên men thu sản phẩm Ở pha hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần đạt đến giá trị khoảng – 7,5 Trong pha penicillin tạo thành với mức độ cực đại Giống nấm mốc penicillium chrysogenum loại hiếu khí bắt buộc, nhiên trình tổng hợp penicillin xảy điều kiện hiếu khí mạnh nên suốt trình lên men việc thổi khí điều cần thiết Trong hầu hết trường hợp, lên men, người ta thay phần lớn (hoặc hoàn toàn) đường lactose đường glucose Lượng glucose bổ sung liên tục hay bán liên tục phải giám sát chặt chẽ nồng độ glucose suốt trình vận hành pha để trì nồng độ glucose mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều penicillin Trong thực tiễn, để tránh xảy thiếu hụt thời glucose , người ta kết hợp bổ sung lượng nhỏ đường lactose (khi đó, chưa bổ sung kịp glucose nấm mốc tự điều chỉnh để sử dụng đường lactose nên không xảy tượng tự phân hệ sợi) Ngoài nguồn nitơ nước chiết ngô, người ta thường sử dụng phối hợp (NH4)2SO4 để vừa cung cấp thức ăn N S, vừa sử dụng để điều chỉnh pH trình lên men (pH dịch len men ban đầu thường điều chỉnh http://www.ebook.edu.vn 25 khoảng pH = 6,5 – 6,8 dung dịch NaOH H3PO4); nồng độ NH4 + thường khống chế khoảng 0,3 – 0,4 kg/m3 dịch lên men Chất phá bọt thường sử dụng loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám…Tiền chất tạo nhánh phenylacetic lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic lên men sản xuất penicillin V) bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) suốt thời gian pha lên men penicillin, để trì nồng độ khoảng 0,1 – 1,0 kg/m3 dịch (nếu nấm mốc tổng hợp đồng thời nhiều penicillin khác, nhiều gây độc cho nấm tăng cường thúc đẩy trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin) Nhiệt độ lên men pha đầu khống chế 30oC, sau sang pha sau giữ 22 – 25oC Tốc độ sục khí khuấy trộn điều chỉnh để trì nồng độ oxy hòa tan dịch khoảng 30% Trong điều kiện thời gian lên men mẻ thường kéo dài khoảng 144 – 180 Kết thúc trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh chuyển sang công đoạn trích ly tinh chế thu penicillin * Đặc điểm thiết bị lên men chìm: Quá trình lên men sản xuất penicillin ngày chủ yếu tiến hành thiết bị lên men chìm chế tạo nhóm thép chịu ăn mòn CT2 với khuấy trộn kiểu tuốc-bin (gồm nhiều tầng cánh khuấy), kết hợp bố trí hệ vách dẫn dòng thùng) Công suất khuấy trộn tiêu hao thiết kế khoảng 3kW/m3/h Không khí nén vô khuẩn cấp vào qua hệ ống phân phối kiểu vòng xoáy hay kiểu rẻ quạt đục lỗ lắp đặt sát đáy (hay phía cánh tuốc-bin) Bên thiết bị lắp đặt nhiều tầng ống trao đổi nhiệt kiểu vòng xoắn kết hợp đồng thời với trao đổi nhiệt qua thành thiết bị hai lớp vỏ, đảm bảo điều nhiệt hiệu suốt trình lên men Dung tích thiết bị phổ biến khoảng 150 – 300m3, hệ số đổ đầy thường chọn khoảng 80%V (phụ thuộc vào kỹ thuật thiết bị phá bọt) Thiết bị nhân sản xuất giống có dung tích khoảng 10%V thiết bị len men, thiết kế tương tự thường ghép cứng với thiết bị lên men Toàn thiết bị lên men sản xuất, thiết bị nhân giống lớn hệ thống trang thiết bị phụ trợ thiết kế lắp đặt đảm bảo vệ sinh thao tác vận hành theo chế độ vô khuẩn cao (tốt nên bố trí cho áp dụng chế độ trùng đồng thời cho toàn hệ http://www.ebook.edu.vn 26 thiết bị này) Các thông số kiểm tra trình lên men bao gồm: pH môi trường, nồng độ oxy hòa tan, nhiệt độ, hàm lượng sinh khối tốc độ biến thiên lượng sinh khối, số lượng, kích thước cấu trúc pellet, nồng độ cấu tử chất, nồng độ penicillin, thành phần khí thải tiêu kiểm tra vi sinh vật Việc giám sát điều chỉnh trình lên men xây dựng sở khai thác hai kiểu tương tác trực tuyến (online control) tương tác không phản hồi theo quy luật (offline control), phụ thuộc vào khả đáp ứng hệ thiết bị có Đồng thời xu hướng máy tính hóa kiểm tra giám sát trình lên men dần chiếm ưu sản xuất công nghiệp Hình Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất penicillin * Hiệu kinh tế chung trình lên men chìm Năng lực sinh tổng hợp tích tụ penicillin dịch lên men kết mối tương tác đồng thời hàng loạt yếu tố công nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp chúng, công nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị lực đáp ứng yêu cầu công nghệ thiết bị, chế độ giám sát điều chỉnh thông số công nghệ, lực kỹ vận hành công nhân Với nguồn chất glucoza lên men theo phương pháp chìm, hệ số phân bổ nguyên liệu dự tính khoảng 25% glucoza nấm mốc sử dụng để tổng hợp hệ sợi, 65% đường sử dụng để trì sống sót hệ sợi, lại khoảng 10% nấm mốc sử dụng để tổng hợp penicillin Hệ số sử dụng thức ăn nitơ lưu huỳnh để tổng hợp penicillin tương ứng 20% 80% Nồng độ penicillin G http://www.ebook.edu.vn 27 dịch lên men năm 80 - 90 kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng suất khoảng 40 - 50 kg penicillin G/ m3 dịch lên men ) 3.4 Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên: Có ba phương pháp thu nhận tinh chế penicillin từ môi trường nuôi cấy, là: • Trích ly dung môi hữu • Hấp phụ • Trao đổi ion Trong ba phương pháp phương pháp trích ly dung môi hữu sử dụng nhiều phương pháp dựa ưu điểm sau: • Muối penicillin dễ tan nước • Acid penicillic dễ tan dung môi hữu Công đoạn xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên tóm tắt, bao gồm công đoạn sau đây: http://www.ebook.edu.vn 28 Dịch lên men Lọc sợi nấm Dung môi, phụ gia, axit Sinh khối nấm Trích ly pH 2,0-2,5 Hấp phụ than hoạt tính Lọc than Dung dịch đệm pH= 7,2-7,5 Trích ly Kali acetat Natri acetat Than hoạt tính Kết tinh Lọc tinh thể Dung môi Rửa tinh thể Tinh chế thu hồi penicillin http://www.ebook.edu.vn 29 3.4.1 Lọc dịch lên men : Mục đích: Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm tự phân Thiết bị lọc: phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng quay Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết tủa phần protein lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng để chế biến thức ăn gia súc 3.4.2 Trích ly : Penicillin thường trích ly dạng axít khỏi dịch lọc dung môi amylacetat butylacetat pH = 2,0 - 2,5, nhiệt độ - 30C Nhằm hạn chế lượng penicillin bị phân huỷ, trình trích ly thực thời gian ngắn thiết bị trích ly ngược dòng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh Đồng thời, thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ thông số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô khuẩn để hạn chế tổn thất phân huỷ penicillin Dịch lên men sau lọc bơm trộn đồng thời với dung dịch H2SO4 H3PO4 loãng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ bơm song song với dung môi trích ly vào thiết bị Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn khoảng - 10V dịch lọc /1V dung môi Trong số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta áp dụng phương pháp trích ly hai lần dung môi, với lần đầu trích ly penicillin amylacetat butylacetat; penicillin lại trích ly ngược sang dung dịch đệm pH = 7,2 - 7,5, thường dung dịch KOH loãng dung dịch NaHCO3; sau penicillin lại trích ly sang dung môi lần thứ 2, với lượng dung môi http://www.ebook.edu.vn 30 3.4.3 Tẩy màu : Để tẩy màu loại bỏ số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứa penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến than hoạt tính Sau than hoạt tính tách rửa lại sử dụng thiết bị lọc hút băng tải thiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc đưa chưng thu hồi dung môi xử lý hoàn nguyên, phục vụ cho mẻ sau 3.4.4 Kết tinh, lọc, rửa sấy thu penicillin tự nhiên: Việc kết tinh penicillin V hay penicillin G dạng muối thực đơn giản, cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau tẩy màu lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) người ta trích ly lại sang dung dịch KOH loãng (hay NaOH loãng), tiến hành cô chân không nhiệt độ thấp, sau bổ sung BuOH để penicillin tự kết tinh Các thông số công nghệ có ảnh hưởng lớn đến hiệu qủa kết tinh : nồng độ penicillin, nồng độ muối acetat, pH dung môi hay pH dung dịch cô đặc, nhiệt độ kết tinh Sau kết tinh, tinh thể penicillin lọc tách máy lọc hút thùng quay Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, tiến hành hòa tan kết tinh lại penicillin Khi sản phẩm đạt độ tinh theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không 99,5%, chúng lọc tánh tinh thể; rửa làm khô sơ dung môi kỵ nước izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi máy lọc băng tải sấy không khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Sản phẩm này, phần sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; lại, phần lớn sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm penicillin cephalosporin bán tổng hợp khác Ngoài ra, để sản xuất sản phẩm penicillin có độ tinh khiết cao, người ta cần phải sử dụng phối hợp thêm số giải pháp công nghệ khác phương pháp phân tán tĩnh điện nguyên tắc phương pháp sử dụng hiệu điện cao (lên đến 25 kV) để tạo vi giọt dung dịch chứa penicillin 3.5 Sản xuất axit 6- aminopenicillanic sản xuất penicillin bán tổng hợp Axit 6- aminopenicillanic hoạt tính kháng khuẩn, sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp nhiều loại penicillin khác http://www.ebook.edu.vn 31 cephalosporin Để sản xuất axit 6- aminopenicillanic, đường hiệu lên men sản xuất penicillin G (hoặc penicillin V); sau áp dụng phương pháp hóa học hay sử dụng enzym acylaza để phân cắt mạch nhánh bên xem sơ đồ hình 2.11 Hình 2.11 Sơ đồ tổng hợp axit 6- aminopenicillanic từ penicillin G Phương pháp hóa học có hiệu suất chuyển hóa cao, tới 90-95%, tốc độ phản ứng nhanh, song lại tiêu hao nhiều lượng, nhiều dung môi chứa đựng nguy ô nhiễm môi trường cao Trong đó, phương pháp enzym, hiệu chuyển hóa thấp điều kiện phản ứng êm dịu mang lại hiệu kinh tế cao nên triển khai phổ biến thực tiễn sản xuất công nghiệp Đồng thời, nhờ ưu trên, phương pháp enzym hoàn thiện liên tục ngày đạt ưu vượt trội so với phương pháp hóa học 3.6 Tình hình sản xuất penicillin giới: Thuốc kháng sinh chiếm khoảng 30% thị phần dược phẩm giới Các tập đoàn dược phẩm Mỹ, Anh, Đức, Pháp, Nhật Bản, Italia, Hà Lan, Trung Quốc, ấn Độ, Đài Loan, Hàn Quốc, Áo… chiếm vị trí hàng đầu lĩnh vực Ví dụ: công ty DSM có trụ sở thành phố Delf (Hà Lan) hàng năm sản xuất 15.000 http://www.ebook.edu.vn 32 penicillin, chiếm 30% sản lượng loại thuốc sản xuất toàn giới Ngoài DSM sản xuất tiền chất ADCA (9.000 tấn), APA (hàng ngàn tấn), với ampicillin, amocixillin, cephalexin, cefađroxin, cefradin Tập đoàn dược phẩm Hoa Bắc Thạch Gia Trang Trung Quốc sản xuất năm 4.000 penicillin Tập đoàn dược phẩm Thành Đô năm sản xuất 3.000 penicillin, 500 APA 200 ADCA THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG SẢN XUẤT PENICILLIN Thiết bị sấy chân không Thiết bi lọc sinh học http://www.ebook.edu.vn 33 thiết bị lọc than hoạt tính thiết bi sấy http://www.ebook.edu.vn 34 Thiết bị sấy số sản phẩm IV SẢN PHẨM: 1.Penicillin nhóm G: Đây nhóm penicillin cổ điển, tìm thấy Đa số trích từ nấm số bán tổng hợp penicillin Gcó tac dụng với khuẩn gram dương cầu khuẩn gram âm Sau60 năm sử dụng penicillin G phần hiệu lực tạo nhiều chủng lờn thuốc Đa số penicillin G bị acid dịch vị phá hủy nên dùng để tiêm mà không uống Thuốc chọn lọc để trị phế cầu, liên cầu, tụ cầu không tiếc penicillinaz, clostridium, neisseria, khuẩn kị khí miệng , xoắn cầu G.1_ Benzylpenicillin = penicillin G Bột màu trắng, mùi vị đặc biệt, dễ tan nước Dung dịch thuốc dễ bị thủy phân Chỉ pha dùng Dược điền qui định dung dịch penicillin G tồn trữ ngày tủ lạnh Nhiệt độ cao dễ bị hỏng G.2_ Penicillin G-procain Đây benzylpenicillin-procain có tác dụng chậm Đặc chế: đepocilin, allocillin, duracillin,hydracillin, luetoben, novocillin, solucillin Bột trắng , không hút ẩm, tan nước G.3_Bipenicillin Vì penicillin-procain khuếch tán chậm người ta kết hợp penicillin G với penicillin procain để có tác dụng vừa tức thời vừa lâu bền G.4_Benzathin-penicillin Benzathin-penicillin = benzathin-benzylpenecillin Đặc chế: extencillin, benapen, leomyben, benadin, tadocillin Kết hợp phân tử penicillin G với phân tử dibenzyl-etylendiamin G.5_Benethamin-penicillin Bột kết tinh, tan nước Tác dụng chậm, trung bình G.6_Clemizol-penicillin Đặc chế: lacgobenyl, neocuro Clemizol chết kháng-histamin, muối clemizol acid benzylpenicillinic dạng thuốc có tác dụng chậm diện clemizol làm giảm bớt dị ứng nguy gây tai biến G.7_Penethacillin Đặc chế neobenyl, leocillin, extoben, bronchocillin Bột trắng tan nước http://www.ebook.edu.vn 35 G.8_Penicilln V = Phenomycillin = phenoxymethyl- penicillin Đặc chế: oracillin, alphacillin, berocillin, calciopen K, iciben, isocillin, oracil, oragen, penigen, sumagen, pantogen, calcipen V, penavlon V G.9_Phenethycillin = phenoxyethyl-penicillin Đặc chế: proxyl, chemipen, maxipen, syncillin G.10_Propicillin = phenoxypropyl Đặc chế: baycillin G.11_Clomethocillin Tác dụng lâu dài penicillin uống khác Penicillin nhóm M ( lấy meticillin làm bản) Năm 1957, J.C Sheehan đãtổng hợp penicillin Năm 1929, Doyle Robinson đưa vào sản xuất công nghiệp bẳng cách thay đổi dây ngang R, người ta tìm nhiều chất có hoạt phổ rộng, gây trở ngại dùng, tạo chủng đề kháng… điều đáng ý tổng hợp chất kháng penicillinaz tụ cầu tiết penicillin uống tốt penicillin V Penicillin nhóm M có chất meticillin clozalin Chúng không bị thủy phân penicillinaz Do chất dùng để trị bệnh tụ cầu Tuy nhiên khoảng 20-25% chủng tụ cầu đề kháng với nhóm penicillin M, đề kháng nhiễm thể Do penicillin chưa có giá trị tuyệt tụ cầu Hiệu lực kháng khuẩn 1/10 penicillin G với khuẩn nhạy cảm với penicillin Oxacillin, cloxacilin, diclozacilin độc tính meticillin Meticillin dùng chất khác uống Penicillin nhóm A ( lấy ampicillin làm bản): Đây penicillin bán tổng hợp, hoạt phổ rộng penicillin trước kia: diệt khuẩn gram dương âm, cầu khuẩn gram âm, lại trị không hi hữu tụ cầu Người ta chia thành nhóm nhỏ Aminopenicillin: amicillin chất dẫn Carboxypenicillin: carbonycillin dẫn xuất Ureidopenicillin imidinopenicillin http://www.ebook.edu.vn 36