BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU TRANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn Ths Nguyễn Văn Lâm Nơi thực Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội môn Bào chế tạo điều kiện cho em làm khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo trường dìu dắt giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập suốt năm qua Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tri ân đến ThS Nguyễn Văn Lâm Là người thầy tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Bào chế, trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người quan tâm động viên, khích lệ giúp em hoàn thành khóa luận Hà Nội, tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thu Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .7 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ .8 ĐẶT VẤN ĐỀ .1 Chương TỔNG QUAN 1.1 Doxorubicin 1.1.1 Đại cương doxorubicin 1.1.2 Một số chế phẩm doxorubicin thị trường 1.2 Đại cương liposome .4 1.2.1 Khái niệm 1.2.2.1 Ưu điểm 1.2.2.2 Nhược điểm 1.2.3 Phân loại 1.2.3.1 Theo kích thước số lớp 1.2.3.2 Theo cấu trúc lớp vỏ 1.2.4 Phương pháp bào chế 1.2.4.1 Phương pháp Batzri Korn .7 1.2.4.2 Phương pháp Bangham .8 1.2.4.3 Phương pháp Deamer Bangham .8 1.3 Bào chế liposome phương pháp pha loãng ethanol 1.4 Một số nghiên cứu liposome doxorubicin 11 1.4.1 Một số nghiên cứu liposome doxorubicin giới .11 1.4.2 Một số nghiên cứu liposome doxorubicin Việt Nam 12 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu phương tiện nghiên cứu 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .14 2.1.2 Nguyên vật liệu 14 2.1.3 Phương tiện nghiên cứu 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin 15 2.2.2 Phương pháp đánh giá liposome doxorubicin 15 2.2.2.1 Phương pháp đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân phân bố kích thước tiểu phân 15 2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng doxorubicin toàn phần hiệu suất liposome hóa 16 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 17 2.2.4 Điều kiện thí nghiệm .17 Chương KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 Kết xây dựng đường chuẩn 18 3.2 Xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml phương pháp pha loãng ethanol 19 3.2.1 Quy trình bào chế chung 19 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thông số kỹ thuật quy trình bào chế đến kích thước tiểu phân hiệu suất liposome hóa 20 3.2.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi 20 3.2.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ .24 3.2.3 Đánh giá vai trò giai đoạn làm giảm kích thước tiểu phân quy trình bào chế .27 3.2.3 Đề xuất quy trình bào chế đánh giá số tiêu liposome doxỏubicin 2mg/ml phương pháp pha loãng ethanol 29 3.2.3.1 Quy trình bào chế .29 3.2.3.2 Đánh giá số tiêu liposome tạo 30 3.3 Bàn luận 32 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT 10 11 12 13 14 15 Viết tắt CHL HSPC SPC HEPES Từ/cụm từ đầy đủ Cholesterol Phosphatidyl dầu đậu nành hydrogen hóa Phosphatidylcholin dầu đậu nành Dung dịch đệm N-2-hydroxy ethyl piperazin – N – – ethan sulfonic acid PDI Chỉ số đa phân tán DOX Doxorubicin DOX.HCl Doxorubicin hydroclorid KTTP Kích thước tiểu phân TCCS Tiêu chuẩn sở TKKH Tinh khiết hóa học USP Dược điển Mỹ DĐVN Dược điển Việt Nam TMT-LS Liposome tác động vào khối u di EE Hiệu suất liposome hóa PEG Polyethylen glycol DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu sử dụng 14 Bảng 3.1 Kết đo mật độ quang mẫu dung dịch doxorubicin bước sóng 233 481 nm (pH 4) 18 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến KTTP hiệu suất liposome hóa 20 Bảng 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến KTTP, phân bố KTTP liposome 21 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến KTTP hiệu suất liposome hóa 23 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến KTTP hiệu suất liposome hóa 25 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến KTTP hiệu suất liposome hóa So sánh giai đoạn quy trình bào chế liposome doxorubicin phương pháp khác Ảnh hưởng trình làm giảm KTTP đến KTTP hiệu suất liposome hóa Kết KTTP hiệu suất liposome hóa 25 27 28 31 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Công thức hóa học doxorubicin hydroclorid Hình 1.2 Cấu trúc liposome Hình 1.3 Kích thước số loại liposome Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống kim phun tạo dòng Hình 3.1 Mối tương quan mật độ quang nồng độ doxorubicin 18 Hình 3.2 Liposome doxorubicin bào chế theo tỷ lệ dung môi khác 21 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn thay đổi PDI (A) KTTP (B) theo tỷ lệ dung môi 21 Hình 3.4 Đồ thị phân bố KTTP theo thể tích mẫu trước (A) sau (B) lọc tiếp tuyến 24 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn thay đổi KTTP, PDI (A) hiệu suất liposome hóa (B) theo tỷ lệ dung môi 23 Hình 3.6 Đồ thị biểu diến thay đổi KTTP, PDI (A) hiệu suất liposome hóa (B) theo nhiệt độ 26 Hình 3.7 Sơ đồ quy trình bào chế 30 Hình 3.8 Ảnh chụp TEM liposome 31 Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, liposome lĩnh vực nghiên cứu đẩy mạnh ứng dụng nhiều ngành nghề khoa học khác sinh học, hóa sinh, dược phẩm, mỹ phẩm, hóa trị liệu ung thư, enzym trị liệu đặc biệt lĩnh vực đưa thuốc tới đích Trong bào chế đại, liposome thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học giới với ưu điểm bật như: khả hướng đích thụ động tế bào ung thư, tăng hiệu điều trị khoảng điều trị, tăng khả ổn định dược chất bao gói, tránh tác dụng tế bào lành, cải thiện dược động học, giảm chuyển hóa tăng thời gian tuần hoàn, bắt cặp linh động với vị trí phối tử đặc biệt để đạt tác dụng hướng đích… Trên giới liposome bào chế nhiều phương pháp khác nhau, đưa vào sản xuất với nhiều chế phẩm sử dụng rộng rãi thị trường dạng thuốc tiêm liposome doxorubicin Trong nước nghiên cứu liposome nhiều hạn chế, chưa có chế phẩm đưa vào sản xuất Các nghiên cứu liposome Việt Nam chủ yếu sử dụng phương pháp hydrat hóa film, nhiên phương pháp có nhiều nhược điểm như: liposome thu không đồng nhất, kích thước lớn đa lớp, sử dụng dung môi hữu độc hại với môi trường, thời gian quy trình bào chế kéo dài (12 – 14h), khó áp dụng quy mô công nghiệp… Yêu cầu đặt cần có phương pháp bào chế thay hạn chế nhược điểm phương pháp nói Do đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml phương pháp pha loãng ethanol” tiến hành nhằm mục đích: Bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml phương pháp pha loãng ethanol Đánh giá số tiêu chất lượng liposome tạo Chương TỔNG QUAN 1.1 Doxorubicin 1.1.1 Đại cương doxorubicin - Công thức phân tử: C27H29NO11 HCl - Khối lượng phân tử: 579,99 Hình 1.1 Công thức hóa học doxorubicin hydroclorid - Tên khoa học: (8S, 10S)-10-((3-amino-2, 3, 6-trideoxy-α-L-lyxo-hexopyranosyl) oxy) -7, 8, 9, 10-tetrahydro-6, 8, 11- tri hydroxyl-8-(2-hydroxy acetyl)-1-methoxy-5, 12-napthacenedion [22] - Tính chất: điều kiện thường tồn dạng tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam không mùi, tan nước, methanol, acetonotril, tetrahydrofuran Không tan chloroform, aceton, ethyl ether, benzen [22] - Doxorubicin bền dung dịch có pH gần [10] - Doxorubicin chất nhạy cảm với ảnh sáng nồng độ thấp, nhiên nồng độ điều trị doxorubicin cho không bị phân hủy đáng kể ánh sáng, không thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ Thực tế dung dịch doxorubicin NaCl 0,9% ổn định 24 ngày bảo quản lọ PVC 25oC, lâu bảo quản xylanh làm polypropylen 4oC [22] - Cơ chế tác dụng: doxorubicin gắn vào DNA làm ức chế enzym cần thiết để chép phiên mã DNA, đặc biệt gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào giai đoạn phân bào S giai đoạn gián phân [2] - Dược động học: sau tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng phân bố đến mô phổi, gan, tim, lách, thận, bị chuyển hóa gan tạo thành doxorubicinol 28 Tuy nhiên để đánh giá cần thiết trình làm giảm KTTP đến quy trình bào chế liposome DOX phương pháp pha loãng ethanol, tiến hành bố trí thí nghiệm sau: + công thức M761 bào chế phương pháp pha loãng ethanol, lọc tiếp tuyến để cô đặc giảm thể tích, không sử dụng biện pháp làm giảm KTTP, đổi đệm, nạp dược chất, xác định hàm lượng DOX toàn phần hiệu suất liposome hóa + công thức M762 bào chế phương pháp pha loãng ethanol, lọc tiếp tuyến giảm thể tích, đùn qua màng 200 nm, 100 nm thiết bị extrusion làm giảm KTTP, đổi đệm, nạp dược chất, xác định hàm lượng DOX toàn phần, hiệu suất liposome hóa Kết - Hình thức: + Hệ liposome thu sau bào chế mẫu thu hỗn dịch đồng màu trắng đục + Hệ liposome DOX hỗn dịch đục mờ màu đỏ cam, để lâu xuất hiện tượng lắng cặn dễ dàng phân tán trở lại lắc nhẹ - Kết KTTP, phân bố KTTP liposome hiệu suất liposome hóa trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng trình làm giảm KTTP đến KTTP hiệu suất liposome hóa Giai đoạn bào chế liposome chưa mang dược chất Công Sau lọc tiếp tuyến thức PDI Zaverage (d.nm) Giai đoạn sau nạp dược chất Sau nén qua màng polycacbonat PDI Zaverage (d.nm) PDI Zaverage (d.nm) Hàm lượng toàn phần (mg/ml) EE (%) M761 0,183 149,9 - - 0,213 175,1 2,04±0,06 90,52±1,00 M762 0,188 165,9 0,116 142,1 0,205 168,0 2,01±0,04 90,51±1,54 - Nhận xét: 29 + Với liposome chưa nạp dược chất, mẫu cho hệ có kích thước nhỏ sau trình làm giảm KTTP nén qua màng (Zaverage < 150 nm), hệ đồng với số đa phân tán PDI nhỏ ( < 0,12) Khi so sánh với mẫu ta nhận thấy: hai hệ cho kích thước tương đương nhau, khác biệt thực quan sát thấy rõ giá trị PDI hệ Chứng tỏ mẫu M762 đồng mẫu M761 Có thể dự đoán trình làm giảm kích thước tiểu phân thực có ý nghĩa việc làm tăng độ đồng hệ + Hệ liposome DOX thu sau nạp dược chất khác biệt nhiều hai mẫu Cả hai mẫu cho kết cảm quan, số liệu KTTP, PDI, hàm lượng DOX toàn phần hiệu suất liposome hóa tương đương KTTP < 200 nm, PDI~0,2, hiệu suất liposome hóa > 90% Như khác biệt đáng kể liposome DOX có không trải qua trình làm giảm KTTP nén qua màng Do liposome bào chế phương pháp pha loãng ethanol không cần thiết phải trải qua trình làm giảm KTTP nén qua màng Do lựa chọn quy trình bào chế liposome DOX không trải qua giai đoạn nén qua màng để làm giảm KTTP 3.2.4 Đề xuất quy trình bào chế đánh giá số tiêu liposome doxorubicin 2mg/ml phương pháp pha loãng ethanol 3.2.4.1 Quy trình bào chế Từ trình thực nghiệm nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng kết hợp tài liệu tham khảo đề xuất quy trình cụ thể bào chế liposome DOX 2mg/ml phương pháp pha loãng ethanol Công thức bào chế Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC) Cholesterol Ethanol 100 mg 30 mg 7ml Đệm citrat pH 100 ml Đệm HEPES pH 7,4 vừa đủ Doxorubicin hydroclorid 20 mg 30 Hòa tan HSPC: CHL (tỷ lệ kl 100: 30) o 7ml ethanol/50 C Bơm nhanh kết hợp khuấy trộn tốc độ cao Nhiệt độ: 60°C Tốc độ: 4000 v/p Thời gian: 10 phút 100ml đệm citrat pH4 Lọc tiếp tuyến giảm thể tích Đổi đệm bên liposome lọc Màng PS 10kD Diện tich lọc: 28cm2 100ml đệm HEPES pH 7,4 tiếp tuyến Đun cách thủy 50°C Hòa tan DOX.HCl, ủ 50oC/10p Bảo quản – 8oC Hình 3.7 Sơ đồ quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml phương pháp pha loãng ethanol 3.2.4.2 Đánh giá số tiêu liposome tạo - Hình thức: liposome DOX thu sau bào chế phương pháp pha loãng ethanol hỗn dịch đục mờ màu đỏ cam Để thời gian lâu có xuất lắng cặn nhiên lắc nhẹ, hệ dễ dàng phân tán trở lại - KTTP, phân bố KTTP liposome liposome DOX, hiệu suất liposome hóa cho bảng 3.9 31 Bảng 3.9 Kết KTTP hiệu suất liposome hóa M7611 Liposome sau lọc Liposome DOX tiếp tuyến Zaverage Zaverage PDI PDI (d.nm) (d.nm) 0,173 140,3 165,4 0,201 M7612 0,182 149,7 175,4 0,205 2,07 91 M7613 Trung bình 0,198 139,7 188,7 0,208 2,07 89 0,184 143,2 176,5 0,205 2,05 ± 0,04 90,03 ± 1,00 Giá trị Hàm lượng toàn phần (mg/ml) EE (%) 2,01 90,08 - Hình dạng cấu trúc liposome đánh giá thông qua hình ảnh chụp TEM cho hình 3.8 Hình 3.8: Ảnh chụp TEM liposome - Nhận xét: + Liposome thu từ mẫu có KTTP nhỏ (< 150 nm), hệ thu có độ đồng cao, PDI nhỏ (< 0,3) Liposome sau nạp dược chất có kích thước độ đồng thay đổi không nhiều so với trước nạp (Zaverage < 200 nm, PDI~0,2) 32 + Hàm lượng DOX toàn phần cho giá trị cao đạt mục tiêu bào chế đặt Hiệu suất liposome hóa mẫu thu lớn 88%, kết định lượng tương đương kết thu từ nghiên cứu tham khảo trước [1], [6] + Hình ảnh chụp TEM cho thấy: sau lọc tiếp tuyến liposome thu có kích thước nhỏ (70 – 120 nm) đồng Tuy nhiên số tiểu phân có kích thước lớn (300 – 400 nm) liposome có kích thước vượt 500 nm Khi quan sát hình ảnh ta nhận thấy số liposome chứa thêm cấu trúc đa khoang đa lớp số khoang số lớp không nhiều (dưới khoang hay lớp liposome) Hiện tượng đa khoang đa lớp ảnh hưởng đến độ ổn định khả mang dược chất hệ Khi dựa vào tiêu đánh giá hình thái cấu trúc liposome ta đề xuất thêm trình nén qua màng (extrusion) đồng hóa áp lực cao để chuyển liposome thành liposome nhỏ đơn lớp Với liposome tạo thành phương pháp pha loãng ethanol có KTTP nhỏ, đồng nhất, kết hợp thêm giai đoạn làm giảm KTTP nén qua màng cho thấy ưu điểm vượt trội tiết kiệm chi phí thời gian quy trình bào chế cần nén qua hai màng 200, 100nm, 10 chu kỳ màng Quy trình bào chế đặc tính liposome DOX thu cho thấy ưu điểm vượt trội phương pháp pha loãng ethanol tính khả thi phương pháp nghiên cứu 3.3 Bàn luận - Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi: Sau trình khảo sát nhận thấy tỷ lệ dung môi chủ yếu ảnh hưởng đến KTTP, phân bố KTTP liposome liposome DOX thu mà ảnh hưởng đến hàm lượng DOX toàn phần hay hiệu suất liposome hóa Giá trị KTTP số đa phân tán PDI thu kể phù hợp với kết tham khảo từ nghiên cứu trước cho thấy nồng độ phospholipid ethanol nhỏ, kích thước tiểu phân hệ có xu hướng giảm xuống, tức tỷ lệ ethanol/ nước lớn, liposome thu có kích thước nhỏ, hệ đồng Độ lặp lại cao giá trị KTTP, phân bố KTTP thể rõ ràng [11] Tuy nhiên tỷ lệ ethanol sử dụng 33 khuyến cáo nhỏ 7,5/100 [17] Không thế, lượng ethanol tồn dư chế phẩm gây trở ngại cho việc phát triển dạng thuốc tiêm, gây đau, gây hoại tử vị trí tiêm [18] Ngoài yếu tố tỷ lệ dung môi, nghiên cứu tham khảo trước nồng độ phospholipid dung dịch ethanol yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến KTTP số đa phân tán hệ thu Miquel Pons cộng cho nồng độ phospholipid/ethanol nên giới hạn 40 mg/ml đảm bảo liposome tạo có kích thước nhỏ, đồng nhất, tiểu phân kích thước nhỏ chiếm phần lớn thể tích hệ [17] Trong phạm vi nghiên cứu chưa tiến hành khảo sát ảnh hưởng yếu tố nồng độ phospholipid/ethanol - Ảnh hưởng giai đoạn lọc tiếp tuyến: Liposome thu trước sau lọc tiếp tuyến nhận thấy có khác biệt KTTP phân bố KTTP Điều lý giải trình lọc tiếp tuyến loại lượng ethanol tồn dư hệ dẫn đến trình tái cấu trúc làm thay đổi KTTP phân bố KTTP hệ Nhược điểm liposome bào chế phương pháp pha loãng ethanol bị pha loãng nhiều so với liposome bào chế phương pháp khác giới hạn độ tan phospholipid ethanol Hàm lượng phospholipid có 100ml liposome bào chế theo phương pháp tương đương với hàm lượng phospholipid có 10ml liposome bào chế phương pháp hydrat hóa màng film Do trình lọc tiếp tuyến có ảnh hưởng đến KTTP, phân bố KTTP mà giai đoạn cần thiết để cô đặc hệ, đạt nồng độ phospholipid theo yêu cầu Ngoài trình lọc tiếp tuyến sử dụng để đổi hệ đệm bên liposome tạo chênh lệch pH cho trình nạp dược chất vào liposome, tiếp tục loại lượng dung môi ethanol lại hệ Xét mặt lý thuyết, ethanol bị loại hoàn toàn sau trình loc tiếp tuyến nhiên cần phải đánh giá lượng ethanol tồn dư để xem xét loại ethanol biện pháp khác - Ảnh hưởng nhiệt độ: nhiệt độ trì trình khuấy trộn kết hợp hai pha ảnh hưởng đến độ linh động phospholipid ảnh hưởng đến khả tạo tái tạo liposome Xu hướng cho thấy nhiệt độ tăng (40oC – 60oC) độ linh động phospholipid tăng thu liposome có KTTP nhỏ đồng 34 nhiên nhiệt độ tăng đến 80oC, liposome thu lại có KTTP tăng đồng So với mốc nhiệt độ chuyển pha Tc phospholipid HSPC (53oC) thấy đặc tính KTTP phân bố KTTP liposome có liên quan tới nhiệt độ Do nhận thấy trình bào chế cần trì nhiệt độ cao nhiệt độ chuyển pha phospholipid không cao tránh làm ảnh hưởng tới KTTP phân bố KTTP hệ Kết phù hợp với kết tham khảo nghiên cứu tiến hành trước [25] Tuy nhiên điều kiện giới hạn thời gian phương tiện, nghiên cứu chưa thể tiến hành khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ khoảng hẹp quanh nhiệt độ chuyển pha phospholipid tới KTTP hiệu suất liposome hóa - Ảnh hưởng trình làm giảm KTTP nén qua màng: Liposome tạo phương pháp pha loãng ethanol cần trải qua trình cô đặc lọc tiếp tuyến đạt KTTP số đa phân tán PDI tương đương với liposome bào chế phương pháp khác sử dụng biện pháp làm giảm kích thước tiểu phân khác siêu âm hay nén qua màng với KTTP nhỏ (nằm khoảng 150nm), đồng (PDI 0,1-0,2) Tuy nhiên ảnh chụp TEM liposome cho thấy tượng đa khoang đa lớp liposome thu bàn luận Do đề xuất bổ sung thêm giai đoạn nén qua màng quy trình bào chế.Trong khuôn khổ hạn chế thời gian, nghiên cứu chưa thể tiến hành đánh giá ảnh hưởng giai đoạn nén qua màng tới độ ổn định chế phẩm Mặc dù ta nhận thấy kết hợp thêm giai đoạn nén qua màng quy trình bào chế tiêu tốn lượng chi phí so với quy trình bào chế tiến hành trước - Về lựa chọn thông số kỹ thuật quy trình bào chế: Quy trình bào chế liposome phương pháp pha loãng ethanol đơn giản, chế hình thành liposome chủ yếu trải qua giai đoạn là: + Giai đoạn 1: Phospholipid hòa tan với nồng độ phù hợp tồn trạng thái tự ethanol + Giai đoạn 2: dung dịch ethanol tiêm nhanh vào môi trường nước Ethanol nhanh chóng bị pha loãng dung môi nước, phospholipid chuyển nhanh 35 sang pha nước Trong pha nước để làm giảm sức căng bề mặt phân tử phospholipid có xu hướng tập hợp tạo thành lớp kép + Giai đoạn 3: lớp kép phospholipid lớn dần kích thước + Giai đoạn 4: lớp kép đóng vòng tạo liposome Mỗi giai đoạn có ảnh hưởng quan trọng đến hình thành liposome Bất kỳ thay đổi giai đoạn nói ảnh hưởng đến đặc tính thu liposome Quá trình nghiên cứu tiến hành đánh giá ảnh hưởng số thông số khảo sát nhận thấy: tỷ lệ dung môi lựa chọn 7/100 để hạn chế tồn dư ethanol chế phẩm cuối đảm bảo tạo liposome có KTTP nhỏ, đồng Nhiệt độ trình khuấy trộn hai pha giữ cao nhiệt độ chuyển pha phospholipd nhiên không nâng cao để đảm bảo phospholipid tồn trạng thái linh động dễ dàng tạo lớp kép đóng vòng tạo liposome, nghiên cứu lựa chọn 60oC Đồng thời đề xuất kết hợp thêm trình làm giảm KTTP nén qua màng để làm giảm tượng đa khoang đa lớp liposome thu - Đánh giá tiêu chất lượng liposome: phạm vi thời gian nghiên cứu có hạn điều kiện thí nghiệm sẵn có, nghiên cứu tiến hành lựa chọn đánh giá số đặc tính liposome như: KTTP, số đa phân tán, phân bố KTTP, hình ảnh chụp TEM đánh giá hình thái cấu trúc liposome Những thông số nói thông số để đánh giá cấu trúc, kích thước có khả chứng minh sản phẩm tạo phương pháp nói liposome, liposome tạo có KTTP nhỏ, đồng Một số tiêu khác đặc tính liposome hàm lượng phospholipid, dung môi tồn dư, Zeta… đề xuất đánh giá nghiên cứu tiếp theo, để đánh giá độ ổn định, khả giải phóng dược chất, tác dụng dược lý chế phẩm bào chế Đồng thời sở để tiếp tục nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bào chế liposome DOX phương pháp pha loãng ethanol - Về tiềm phương pháp: quy trình bào chế liposome DOX phương pháp pha loãng ethanol tiến hành nhằm khắc phục hạn chế 36 phương pháp tiến hành nghiên cứu trước [1], [5], [6], [7] thời gian quy trình bào chế dài, thiết phải sử dụng biện pháp đồng hóa làm giảm KTTP…nhưng đảm bảo liposome tạo thành đạt đặc tính tương đương tối ưu nghiên cứu tiến hành trước với PDI ~ 0,2, KTTP < 200 nm, hiệu suất liposome hóa đạt 90% Với kết đạt quy trình bào chế đặc tính liposome DOX thu được, phương pháp pha loãng ethanol mang lại hướng khả quan nghiên cứu nhằm bào chế liposome DOX để đạt kích thước nhỏ, đồng nhất, hiệu suất nạp thuốc cao, quy trình bào chế đơn giản tiết kiệm thời gian chi phí Mặc dù cần tiếp tục đánh giá thêm tiêu chất lượng khác liposome liposome DOX làm sở tiến hành khảo sát ảnh hưởng khác quy trình bào chế nhằm tối ưu hóa quy trình 37 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Nghiên cứu đạt mục tiêu đề với kết sau: Xây dựng quy trình bào chế liposome DOX 2mg/ml phương pháp pha loãng ethanol: + Công thức bào chế giữ nguyên so với nghiên cứu trước + Đánh giá ảnh hưởng số yếu tố nhiệt độ, tỷ lệ thể tích, ảnh hưởng trình làm giảm KTTP tới KTTP, hiệu suất liposome hóa + Đề xuất quy trình bào chế liposome DOX 2mg/ml phương pháp pha loãng ethanol với số thông số khảo sát Đánh giá liposome tạo thành + Đưa phương pháp đánh giá số đặc tính liposome + Đánh giá số tiêu chất lượng liposome tạo thành phương pháp pha loãng ethanol: KTTP, phân bố KTTP, hình dạng cấu trúc liposome, hàm lượng DOX toàn phần hiệu suất liposome hóa Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa thông số quy trình bào chế - Tiếp tục hướng nghiên cứu để đánh giá thêm số tiêu liposome DOX bào chế 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Chí Đức Anh (2012), Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr – 30 Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB Y học, tr 1225 – 1234 Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2005), Một số chuyên đề bào chế đại, NXB Y học, tr 158 – 187 Phạm Thị Minh Huệ, Võ Xuân Minh (2013), Kỹ thuật nano liposome ứng dụng dược học mỹ phẩm, NXB Y học, tr 50 – 93 Nguyễn Văn Lâm (2012), Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin đánh giá tác dụng động vật, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội tr – 32 Lê Phương Linh (2013), Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng liposome doxorubicin, khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr – 41 Đào Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr – 42 Tài liệu Tiếng Anh Abraham S A et al (2005), “The liposome formulation of doxorubicin”, Methods in enzymology, 391, p 71 Accardo A et al (2012), “Peptide – modified liposomes for selective targeting of bombesin receptors overexpressed by cancer cells: a potential theranostic agent”, International journal of nanomedicine, 7, p 2007 10 Beijnen J H., Wiese G., Underberg W J M (1985), “Aspect of the chemical stability of doxorubicin and seven other anthracydines in acidic solution”, Pharmaceutisch Weekblad, 7(3), pp 109 – 116 39 11 Domazou A S., Luisi P L (2002), “Size distribution of spontaneously formed liposomes by the alcohol injection method”, Journal of Liposomes Research, 22(1), pp 205 – 220 12 Gentine P et al (2011), “Manufacture of liposomes by isopropanol injection characterization of the method”, Journal of Liposome Research, 22(1), pp 18 – 30 13 Huckriede A et al (2005), “The virosome concept for influenza vaccines”, 23(1), pp 26 – 38 14 Jaafar M C., Charcosset C., Fessi H (2010) “A new method for liposome preparation using a membrane contactor”, Journal of Liposome Research, 21(3), pp 213 – 220 15 Jaafar M C et al (2009), “Ethanol injection method for hydrophilic and lipophilic drug loaded liposome preparation”, Journal of Liposome Research, 20(3), pp 228 – 243 16 Johnson M J W et al (2008), “Influence of drug to lipid ratio on drug release properties and liposome integrity in liposomal doxorubicin formulations”, Journal of Liposome Research, 18(2), pp 145 – 157 17 Pons M., Foradada M., Estelrich J (1993), “Liposomes obtained by the ethanol injection method”, International journal of Pharmaceutics, 95(1-3), pp 51 – 56 18 Ray A (2012), “Liposome drug delivery system”, Asian Journal of Research in Pharmaceutical Sciences, 2(2), p 19 Riaz M (1996), “Liposome preparation methods”, Pakistan journal of pharmaceutical sciences, 9(1), pp 65 – 77 20 Samad A., Sultana Y., Aqil M (2007), “Liposome drug delivery systems: An update review”, Current drug delivery, 4(4), pp 297 – 305 21 Storm G., Crommelin D J A (1998), “Liposome: quo vadis”, Pharmaceutical Science & Technology today, 1(1), pp 19 – 31 22 Sweetman S C (2009), “Martindale the complete drug reference Pharmaceutical Press”, pp 712 – 714 40 23 Torchlin V P (2005), “Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers”, Nature reviews drug discovery, 4(2), p 15 24 Wang Z et al (2012) “The use of a tumor metastasis targeting peptide to delivery doxorubicin-containing liposomes to highly metastatic cancer”, Biomaterials 25 Vorauer-Uhl et al (2002), “The crossflow injection technique: an improvement of the ethanol injection method”, Journal of liposome research, 12(3), pp 259 – 270 26 Yeh M K (2012), “Clinically proven liposome based drug delivery: formulation, characterization and therapeutic efficacy”, Open acess scientific reports, 1(3), p 41 PHỤ LỤC Phụ lục Đồ thị phân bố KTTP theo thể tích trước sau lọc tiếp tuyến mẫu với tỷ lệ dung môi khác 42