BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ TIẾN HÓA GIỮA CÁC LOÀI ỐC CỐI (CONUS SPP.) VÀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA LOÀI ỐC CỐI CONUS TEXTILE Ở VÙNG BIỂN NAM TRUNG BỘ - VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đặng Thúy Bình TS Trương Quốc Phong Hà Nội - 2012 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Thúy Bình (Viện phó – Viện nghiên cứu công nghệ sinh học môi trường, Trường ĐH Nha Trang), TS Trương Quốc Phong (Trung tâm Nghiên cứu Phát triển CNSH, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩmTrường ĐH Bách Khoa Hà Nội), người tận dìu dắt hướng dẫn suốt trình hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học môi trường – ĐH Nha Trang giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo cán công tác Viện Công nghệ sinh học thực phẩm, Viện đào tạo sau đại học – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập Và cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân bạn bè nhiệt tình động viên, giúp đỡ trình học tập hoàn thiện luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 09 năm 2012 Học viên Lê Thị Thu Hà LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu bảo thầy cô hướng dẫn giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu Bộ môn Sinh học phân tử - Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học môi trường - ĐH Nha Trang Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Lê Thị Thu Hà BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AFLP ATP BI bp BT cDNA CLC CO1 cs D-loop DNA dNPT ĐVTM EST ITS kb LS ML MP mt DNA NADH PCR PIC PP RAPD rDNA RFLP SC SNP SSR TBE VP ESTs NMDA Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều đoạn nhân bản) Adenosine triphosphate Bayesain inference Base pair (cặp bazơ) Giá trị bootstrap Complementary DNA Cù Lao Chàm Oxidase cytochrom c subunit Cộng Displacement loop Deoxyribonucleic acid Deoxynucleotide triphosphate Động vật thân mềm Expressed sequence tags Internal Transcribed Space Kilo base Lý Sơn Maximum likelihood Parsimony Mitochondrial DNA (DNA ti thể) Nicotinamide adenine dinucleotide Polymerase Chain Reaction Polymorphic Information Content (Chỉ số thông tin đa hình mồi) Posterior probability (độ tin cậy) Randomly Amplified Polymorphic DNA (Đa hình đoạn DNA khuyếch đại ngẫu nhiên) Ribosomal DNA Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) Sông Cầu Single Nucleotide Polymorphism (đa hình nucleotide đơn) Simple Sequence Repeats (Sự lặp lại trình tự đơn giản Tris-Boric acid-EDTA Vân Phong Expressed sequence tags N-methyl-D-aspartate DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 2.1 Bảng 2.2 Bảng 2.3 Bảng 2.4 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Các nhóm peptide độc ốc cối, vùng đặc hiệu biểu nhóm ốc cối khác Sự khác mã di truyền nhân ty thể Trình từ đoạn mồi sử dụng phản ứng PCR Chu trình nhiệt phản ứng PCR Các thông số trình phân tích trình tự mô hình tiến hóa phân tích đa dạng loài ốc cối Các thông số trình phân tích trình tự mô hình tiến hóa phân tích di truyền quần thể Conus textile Các trình tự gen 16S, CO1 mtDNA chế độ ăn loài ốc cối Các nhóm loài ốc cối phân loại từ phương pháp MP, ML BI Giá trị tương đồng haplotype trình tự gen CO1 mtDNA Conus textile Mã số đoạn gen 16S CO1 mẫu ốc cối đăng ký ngân hàng gen quốc tế Genbank DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 2.1 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình thái vỏ ốc cối (Conus spp.) Các dạng hình thái vỏ khác ốc cối (Conus spp.) Cấu trúc hệ gen ty thể Conus textile Cấu trúc trình tự DNA ribosome Quy trình tách chiết ADN, khuếch đại gen giải trình tự Vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA ốc cối Ảnh kết điện di DNA tổng số Ảnh chụp kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA (A) CO1 mt DNA (B) số mẫu ốc cối Cây phát sinh loài dựa gen 16S mtDNA ốc cối Cây phát sinh loài dựa gen CO1 mtDNA ốc cối Cây phát sinh loài theo phương pháp BI dựa gen CO1 mtDNA ốc cối Cây phát sinh loài dựa gen CO1 mtDNA ốc cối Conus textile MỞ ĐẦU Đa dạng sinh học yếu tố đóng vai trò quan trọng sống người, nguồn tài nguyên lớn quốc gia Ở mức độ trì sinh quyển, hay cung cấp nguyên vật liệu cho ngành công – nông nghiệp nhu cầu thiết yếu khác người Tuy nhiên, thực tế cho thấy gia tăng dân số hoạt động khai thác mức người làm cho nguồn tài nguyên thiên nhiên dần cạn kiệt Việc sử dụng hợp lý bảo tồn đa dạng sinh học trở nên thiết hết Ở nước ta, ốc nguồn lợi hải sản có mức độ phong phú thành phần loài, có giá trị thực phẩm kinh tế cao Song năm gần đây, tình trạng khai thác vô tội vạ cộng với ô nhiễm môi trường làm cho nguồn lợi ốc có chiều hướng suy giảm nghiêm trọng Nhiều loài thân mềm có giá trị cao có nguy tuyệt chủng ốc tù và, ốc đụn, ốc bàn tay, trai tai tượng, ốc vú nàng [96] Nhiều loài ốc có nguy tuyệt chủng đe dọa bị tuyệt chủng liệt kê danh mục loài cần bảo tồn [97] Ốc cối loại động vật thân mềm, có nọc độc, sống chủ yếu sống vùng biển nhiệt đới rạn san hô Chúng biết đến loài có giá trị kinh tế cao nhờ màu sắc hoa văn đẹp mắt Vỏ ốc cối khai thác để làm đồ trang sức, mỹ nghệ, đồ lưu niệm nhiều người ưa chuộng Ở Việt Nam có 76 loài ốc cối [45] khoảng 500 - 700 loài ghi nhận toàn giới [67,22] Ốc cối thường khai thác để làm hàng mỹ nghệ nguồn thực phẩm cao cấp số quốc gia Vanuatu, New Caledonia, Philippines Gần đây, ốc cối biết đến loại dược liệu quí để chữa đau mãn tính, ung thư nhiều bệnh khác [71,88,79] Chính điều làm tăng mối đe dọa cho loài ốc cối người tiếp tục khai thác mức mà biện pháp bảo vệ Những nghiên cứu ốc cối Việt Nam phần lớn thực mức độ khảo sát, thu thập mẫu tư liệu liên quan [45], phân loại, mô tả đặc điểm hình thái [68]; xác định độc tính kiểm chứng tính chất số độc tố [94] Từ năm 2008-2010, Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học môi trường, Đại học Nha Trang tiến hành khảo sát, phân loại, mô tả đặc điểm hình thái, xây dựng môi quan hệ tiến hóa bước đầu khảo sát độc tính loài ốc cối thu vùng biển Nam Trung [3] Tuy nhiên, nghiên cứu sâu đặc điểm di truyền, mối quan hệ tiến hóa rât hạn chế Xuất phát từ lý trên, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa loài ốc cối (Conus spp.) đa dạng di truyền loài ốc cối Conus textile vùng biển Nam Trung Bộ - Việt Nam” Mục đích nghiên cứu đề tài Xác định mối quan hệ tiến hóa loài ốc cối (Conus spp.) nghiên cứu đa dạng di truyền, cấu trúc quần thể loài ốc cối Conus textile vùng biển Nam Trung Bộ, làm sở cho công tác bảo tồn loài có nguy tuyệt chủng Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài  Ý nghĩa khoa học đề tài Ốc cối (Conus spp.) bao gồm khoảng 700 loài, phân bố rộng rãi vùng biển nhiệt đới vùng biển ấm [67] Các loài thuộc họ ốc có chứa tuyến độc tố sản xuất dạng độc tố với đa dạng cao (ước tính 70.000 peptide độc tố), tác động đến thụ thể thần kinh nhiều loài động vật Điều giúp cho chúng có khả săn mồi cao phân bố rộng Điều tạo điều kiện thuận lợi cho biến dị loài hình thành loài [17] Hiện nay, phân loại ốc cối chủ yếu dựa vào kích thuớc vỏ, kiểu, hoa văn màu sắc hay vân vỏ, cụ thể đường gờ hay phần lồi vỏ Bên cạnh đó, mô tả dải kitin coi tiêu phân loại quan trọng Tuy nhiên, đặc điểm hình thái chịu tác động môi trường, biến dị cá thể loài (Intraspecific) khác loài (Interspecific), dễ gây nhầm lẫn trình phân loại Do đó, việc phân tích mối quan hệ tiến hóa dựa việc giải mã thông tin di truyền việc cần thiết  Ý nghĩa thực tiễn đề tài Xây dựng phát sinh chủng loại 26 loài ốc cối tìm thấy ven biển Nam Trung Bộ - Việt Nam Từ xác định mối quan hệ loài chế độ ăn chúng trình tiến hóa Nắm thông số trình tự mô hình tiến hóa phân tích đa dạng loài ốc cối (Conus spp.) di truyền quần thể loài Conus textile vùng biển Nam Trung Bộ - Việt Nam dựa đặc điểm di truyền gen 16S CO1 DNA ti thể Những dẫn liệu nguồn lợi, đa dạng sinh học, cấu trúc quần thể đa dạng di truyền sở khoa học nguồn số liệu đầu vào cho việc tư vấn, đề xuất vấn đề quản lý sử dụng hợp lý nguồn lợi ốc cối vùng biển Việt Nam CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI (CONUS SPP.) VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG 1.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI (CONUS SPP.) Giống ốc cối thuộc họ Conidae giống có số lượng loài lớn ngành động vật thân mềm Cho đến nay, giới người ta xác định có khoảng 500 - 700 loài Ốc cối loại động vật ăn thịt, săn mồi sống có nọc độc Thức ăn chúng cá, giun biển ĐVTM Nhiều loài họ Conidae có vỏ đẹp mặt hàng mỹ nghệ có giá trị Ngoài số loài họ ốc có tuyến độc nguy hiểm gây chết người Do chúng thu hút ý nhà nghiên cứu động vật thân mềm từ hàng trăm năm 1.1.1 Hệ thống phân loại ốc cối (Conus spp.) Hệ thống phân loại ốc cối dùng phổ biến [95]: Ngành: Mollusca (Linnaeus, 1758) Lớp: Gastropoda (Cuvier, 1795) Bộ: Sorbeoconcha (Ponder & Lindberg, 1997) Tổng họ: Conoidea (Fleming, 1822) Họ: Conidae (Rafinesque, 1815) Giống: Conus (Linnaeus, 1758) 1.1.2 Đặc điểm sinh thái phân bố Ốc cối phân bố khắp nơi giới, chúng thường phân bố vùng vĩ độ 400 Bắc 400 Nam, số loài phân bố vĩ độ 40 Nam Phi, Nam Australia, Nam Nhật Bản biển Địa Trung Hải Ngoài chúng phân bố vùng biển nhiệt đới vùng biển ấm Philippine, Indonesia, Australia, Mexico, Florida, Hawaii Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy số loài thích ứng với thay đổi điều kiện môi trường vùng biển nóng mũi Cape, Nam Phi hay vùng biển lạnh phía tây Califonia, Hoa Kỳ Trong đó, số loài cận nhiệt đới tìm thấy vùng triều độ sâu 10 – 30m tảng đá vùng triều nông [84] Một số loài sống rừng ngập mặn, sống vùng nước sâu đến 400 m Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu vùng ven biển thuộc khu vực Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang quanh hải đảo Hylleberg Kilburm (2003) khuôn khổ dự án Tropical Marine Molluscs Program công bố 76 loài ốc cối tìm thấy vùng biển Việt Nam dựa việc thu thập mẫu, khảo sát tập bảo tàng sinh vật biển Việt Nam [45] 1.1.3 Đặc điểm hình thái ốc cối  Đặc điểm hình thái Ốc cối có hình dạng trái tim với kích cỡ khác nhau, loài có kích cỡ lớn có chiều cao vỏ đến 23cm [80] Các loài ốc cối thường có màu sắc sặc sỡ với hoa văn đẹp mắt Vỏ thuôn dài, đá vôi, chắc, nặng, xoắn theo chiều kim đồng hồ Đầu có xúc tu (râu), toàn thân bao bọc lớp vỏ dày vững Ốc cối động vật ăn thịt, chúng ăn mồi sống, chúng thường săn mồi ăn loại giun, ĐVTM, cá nhỏ trí số loài ốc cối khác Để phân loại ốc cối người ta thường dựa vào màu sắc hoa văn vỏ, dạng khác vỏ tiêu phân loại hình thái mô tả hình 1.1 Hình 1.1: Hình thái vỏ ốc cối (Conus spp.) [92] 10 Bảng 3.3: Giá trị tương đồng (%) haplotyp e trình tự gen CO1 mtDNA Conus textile thu vùng địa lý Sông Cầu (SC) Vân Phong (VP), Lý Sơn (LS) Cù Lao Chàm (CLC) 61 3.5 XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU Trình tự đoạn gen 16S CO1 mẫu ốc cối đăng ký ngân hàng gen quốc tế Genbank có mã số sau: Bảng 3.4: Các trình tự gen 16S, CO1 mtDNA chế độ ăn loài ốc cối (P: ăn cá; P+V: ăn cá động vật thân mềm; P+V: ăn cá giun biển; V: ăn giun biển; M: ăn động vật thân mềm); U: chưa nghiên cứu (unknow) STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Loài Conus achatinus Conus arenatus Conus bandanus Conus betulinus Conus capitaneus Conus caracteristicus Conus distans Conus cf distans** Conus eburneus* Conus flavidus Conus cf flavidus* Conus generalis** Conus imperialis Conus leopardus Conus literatus Conus lividus Conus lynceus** Conus magus Conus marmoreus Conus miles Conus mustelinus* Conus quercinus Conus striatus Conus testulatus Conus terebra** Conus textile Conus tulipa Conus varius** Conus vexillum Trình tự 16S/CO1 FJ868053/HM89802 HM212491/HM 89804 HQ234757/HM 898405 HQ234758/ HM 898407 HM212492/ HM 898408 HM212493/ HM 898409 HM212494/ HM 898412 HQ234762/ HM 898708 HM899518 HM 898715/ HM 895876 HM 892389 HQ234761 HQ234755/HQ343852 HQ374675/HQ385794 HM212495/HQ391485 HQ234760/HQ394115 HM886932 HM212496/HQ386449 HQ234759/HQ482376 HQ234756/HQ446722 HQ448546 HM212497/ HQ438565 HM212498/HQ475974 HM212499/ HQ897659 HQ886752 HM212500/ HQ897498 HQ978592/ HQ895667 HQ896748 HM212501/ HQ894285 (*): Loài có trình tự gen CO1 mtDNA (**): Loài có trình tự gen 16S mtDNA 62 Chế độ ăn U V M V P+V U V U P&M V U V V V V V U P&V M V V V P&V V V M P+M V M CHƯƠNG IV – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN KẾT LUẬN Từ kết đạt đề tài, chúng tối đưa kết luận sau: Khuếch đại đoạn gen 16S mtDNA CO1 mtDNA 26 loài ốc cối Kích thước đoạn gen tương ứng 530bp (16S mtDNA) 750bp (CO1 mtDNA) Cây phát sinh loài dựa vào gen 16S mtDNA cho thấy loài ốc cối xắp sếp thành nhóm loài (nhóm 1-7) với giá trị BT độ tin cậy tương đối (>70%), loài (nhóm 4) có vị trí phân loại không xác định (Conus sulcatus) Theo cách phân loại này, hầu hết loài nhóm có chế độ ăn khác Cây phát sinh loài dựa vào gen CO1 mtDNA cho thấy loài ốc cối xắp sếp thành 10 nhóm loài (nhóm 1-10) với giá trị BT độ tin cậy tương đối (>70%), loài (nhóm 4, 10) có vị trí phân loại không xác định (Conus lynceus C generalis) Khác với gen 16S, phân loại xây dựng từ gen CO1 cho thấy mối quan hệ rõ nét chế độ ăn ốc cối Các loài có chế độ ăn nhóm chung vói Quần thể C textile vùng địa lý cho thấy đa dạng di truyền cao có phân tách theo vùng địa lý: haplotype/15 cá thể Vân Phong Sông Cầu, khác biệt trình tự khoảng 0,2 – 1%; haplotype/10 cá thể Lý Sơn haplotype/5 cá thể Cù Lao Chàm phát hiện; trình tự khác biệt 0,2% - 1% 0,2% - 0,5% Cây đa dạng loài quần thể C textile (vùng biển Nam Trung Bộ - Việt Nam) cho thấy có hai nhóm xác định tiến hóa Trong nhóm (giá trị BT cao, MP 100%, ML 100% BI 100%), quần thể Vân Phong/ Sông Cầu xếp nhóm gần gũi (sister clade) với quần thể Cù Lao Chàm Quần thể Lý Sơn thể mối quan hệ gần gũi nhánh thứ hai với giá trị BT trung bình (MP 90%, ML 60%, BI 80%) Đăng ký ngân hàng quốc tế Genebank trình tự gen 16S (20) CO1 (25) Tư liệu hóa mặt hình thái loài ốc thu thập 63 KIẾN NGHỊ Khảo sát chi tiết đa dạng sinh học loài sinh vật biển Việt Nam, đặc biệt đối tượng quí hiếm, có nguy có tuyệt chủng Sử dụng nhiều loại thị phân tử khác nhau; sử dụng kết hợp thị DNA nhân DNA ti thể để làm sáng tỏ mối quan hệ tiến hóa đa dạng di truyền loài ốc cối (Conus spp.) Mở rộng hướng khảo sát mối tương quan đặc điểm tiến hóa phương thức dinh dưỡng ốc cối Xây dựng liệu đa dạng loài ốc cối Việt Nam Mở rộng hướng nghiên cứu chuyên độc tố, đặc biệt nghiên cứu di truyền gen qui định độc tố ốc cối Đây hướng nghiên cứu cộng đồng nhà khoa học giới quan tâm ứng dụng rộng lớn dược phẩm sinh học thần kinh 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Mạnh Cường, (2007), Công nghệ sinh học chọn tạo giống ngô, Nhà xuất nông nghiệp Ngô Đăng Nghĩa, (2010), Báo cáo tổng kết dự án ”Bảo tồn tiềm di truyền loài thủy hải sản Việt Nam” Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trường (2008, 2009), Báo cáo tổng kết dự án “Bảo tồn tiềm di truyền loài thủy hải sản Việt Nam”, Đại học Nha Trang, Khánh Hòa TÀI LIỆU TIẾNG ANH Adams,M.D., Kelley,J.M., Gocayne,J.D., Dubnick,M., Polymeropoulos,M.H., 10 Xiao,H., Merril,C.R., Wu,A., Olde,B., Moreno,R.F., Kerlavage,A.R., McCombie,W.R., Venter,J.C., (1991), Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project, Science (252), pp 16511656 Allen,J.W.,Herbertsson,K., McCumber,D.,Wagstaff,J D., Layer,R.T.,McCabe, R.T., and Yaksh,T L (2006), An assessment of the antinociceptive efficacy of intrathecal and epidural contulakin-G in rats and dogs, Anesth Analg, 104(6):1505-13 Bandyopadhyay,P.K., Bradford,J.S., John-Paul,O., Matthew,T.C., Maren,W., Baldomero, M.O., (2008), The mitochondrial genome of Conus textile, coxI– coxII intergenic sequences and Conoidean evolution, Molecular Phylogenetics and Evolution (46), pp 215-223 Barbier J., Lam Thanh H.,F Le Gall , Favreau P and Benoit E et al, (2004), A delta-conotoxin from Conus ermineus venom inhibits inactivation in vertebrate neuronal Na+ channels but not in skeletal and cardiac muscles, J Biol Chem, (279), pp 4680- 4685 Becker,S and Terlau,H., (2008), Toxins from cone snail : properties, applications and biotechnological production, Appl Microbiol Biotechnol., (79), pp 1-9 Benzie, J.A., Ballment, E., Forbes, A.T., Demetriades, N.T., Sugama, K., Moria, S., (2002), Mitochondrial DNA variation in Indo-Pacific populations of the giant tiger prawn, Penaeus monodon, Mol Ecol., (11), pp 2553– 2569 Beuzen, N.D., Stear, M.J., Chang, K.C., 2000 Molecular markers and their use in animal breeding Vet J., (160), 42–52 Beyene Y., Botha A M and Myburg A.A., (2005), A comparative study of molecular and morphological methods of describing genetic relationships in traditional Ethiopian highland maize, African Journal of Biotechnology, 4(7), pp 586-595 65 11 Biggs, J.S., Watkins, M., Cornel,P.S., Olivera, B M., (2010), Defining a clade 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 by morphological, molecular, and toxinological criteria: distinctive forms related to Conus praecellens A Adams, 1854 (Gastropoda: Conidae), The nautilus, 124(1):1-19 Bingham,J.P., Jones,A., Lewis,R.J., Andrews,P.R., Alewood,P.F., (1996), Conus venom peptides (conopeptides): inter-species, intra-species and within individual variation revealed by ion-spray mass spectrometry In: Lazarovici P, Spiro M, Zlotkin E (eds) Biochemical aspects of matines pharmacology, Alaken, Inc Fort Collins, Co, pp: 13-27 Bingham,J.P, Mitsunaga,E., Bergeron,Z.L., (2010), Drugs from slugs-Past, present and future perspectives of ω-conotoxin research, Chemico-Biological Interactions (183), pp 1-18 Blaxter,M., Elsworth,B., Daub,J., (2004), DNA taxonomy of a neglected animal phylum: an unexpected diversity of Tardigrades Proc R Soc Lond B (Suppl.) (271), pp 189-192 Bulaj,G et al (2005), Novel conotoxins from Conus striatus and Conus kinoshitai selectively block TTX-resistant sodium channels Biochemistry, 44(19), pp 7259-7265 Bulaj, G., Zhang,M.M., Green, B R., Fiedler, B., Layer, R T.,Wei, S.,Nielsen, J.S.,Low,S.J.,Klein,B.D.,Wagstaff,J.D.,Chicoine,L.,Harty,T.P.,Terlau,H.,Yoshika mi, D., Olivera,B.M., (2006), Synthetic muO-conotoxin MrVIB blocks TTXresistant sodium channel NaV1.8 and has a long-lasting analgesic activity, Biol.Chem., 45: 7404–7414 Conus Linnaeus, (1758), World Register of Marine Species, accessed 20 May 2010 Craig,A.G., Norberg,T.,Griffin,D., Hoeger,C., Akhtar,M., Schimidt,K., Low,W., Dykert J., Richelson, E., Navarro,V., Mazella J., Watkins,M., Hillyard, D., Imperial J., Cruz L.J and Olivera B.M., (1999), Contulakin, an O-glycosylated Conus peptide J Biol Chem (274), pp 13752-13759 Cronin,M.A., Spearman,W.J., Wilmot,R.L., Patton,J.C., Bickham, J.W., (1993), Mitochondrial DNAvariation in chinook (Oncorhyncus tshawytscha) and chum salmon (O keta) detected by restriction enzyme analysis of polymerase chain reaction (PCR) products Can J Fish Aquat Sci., (50), pp 708– 715 Cruz, L.J., Johnson, D.S and Olivera, B.M., (1987), A characterization of the omega-conotoxin target evidence for tissue-specific heterogeneity in Ca 2+ channel types, Biochemistry (26), pp 820-824 Cunha, R L, Tenorio, M.J., Afonso, C., Castiho R., Zardoya, R., (2008), Replaying the tape: recurring biogeographical pattens in Cape Verde Cunus after 12 million years, Molecular Ecology, (17), pp 885 – 901 Cunha,R.L.,Castilho,R., Ruber,L., Zardoya,R., (2005), Patterns of Cladogenesis in the Venomous Marine Gastropod Genus Conus from the Cape Verde Islands, Systematic Biology (54), pp 634-650 66 23 Danzmann,R.G.,(1997), PROBMAX: a computer program for assigning unknown 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 parentage in pedigree analysis from known genotypic pools of parents and progeny J Heredity (88), pp 333 Duda.,T.F Jr., Chang,D., Lewis,B.D., Lee,T., (2009), Geographic variation in venom allelic composition and diets of the widespread predatory marine Gastropod Conus ebraeus PLoS ONE 4(7):e6245.doi:10.1371/journal.pone 0006245 Duda,T.F.JR., Rolán,E., (2005), Explosive radiation of Cape Verde Conus, a marine species flock Molecular Ecology, (14), pp 267-272 Duda, T.F Jr., Kohn, A J (2005), Species-level phylogeography and evolutionary history of the hyperdiverse marine gastropod genus Conus, Molecular Phylogenetics and Evolution, (34), pp 257-272 Duda, T.F Jr., Palumbi S R., (2004), Gene expression and feeding ecology: evolution of piscivory in the venomous gastropod genus Conus, Proceedings of the Royal Society of London Series B, Biological sciences (1544), pp 1165-1674 Duda,T.F.Jr., Kohn,A.J., Palumbi,S.R., (2001), Origins of diverse feeding ecologies within Conus, a genus of venomous marine gastropods Biol J Linnean Soc, (73), pp 391–409 Duda, T.F.Jr., Lessions, H.A., (2009), Connectivity of populations within and between major biogeographic regions of the tropical Pacific in Conus ebraeus, a widespread marine gastropod, Coral Reefs, (28), pp 651-659 Duda,T.F.Jr.,Palumbi,S.R., (1999), Molecular genetics of ecological diversification: Duplication and rapid evolution of toxin genes of the venomous gastropod Conus The Proceedings of the National Academy of Sciences USA, (96), pp 6820–6823 Espiritu,D.J.D.,Cruz,L.J.,Cartier,G.E.,Olivera,B.M., (2002), Venomous gastropods: Conus, conoideans and other neogastropod families, Bolletino Malacologico Supplement, (4), pp 147–160 Espiritu, D J.D., Watkins, M, Dia-Monje, V, Cartier, E., Cruz, L.J and Olivera, B.M., (2001), Venomous cone snails: molecular phylogeny and the generation of toxin diversity Toxicon, (39), pp 1899-1916 Folmer, O,, Black M,, Hoeh W,, Lutz R,, Vrijenhoek R., (1994), DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates Molecular Marine Biology and Biotechnology, (3), pp 294-299 Franco, G.R., Adams, M.D., Bento, S.M., Simpson, A.J.G., Venter, J.C., Pena, S.D.J., (1995), Identification of new Schistosoma mansoni genes by the EST strategy using a directional cDNA library Gene (152), pp 141– 147 Franklin,J.B, Fernando,S.A., Chalke,B.A, Krishnan,K.S.,(2007), Radular morphology of Conus (Gastropoda: Caenogastropod: Conidae) from India Molluscan Research, 27(3), pp 111-122 Grande,C., Templado,J., Zardoya, R., (2008), Evolution of gastropod mitochondrial genome arrangements BMC Evolutionary Biology, (8), pp 61 67 37 Hall, T.A., (1999), BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 and analysis program for Windows 95/98/NT, Nucleic Acid Symposium Series, (41), pp 95–98 Hansen, T.A., (1980), Influence of larval dispersal and geographic distribution on species longevity in neogastropod, Paleobiology, (6), pp 193-207 Hanski I., Ovaskainen O., (2000), The metapopulation capacity of a fragmented landscape, Nature, (404), pp 755-758 Hebert, P.D.N., Cywinska, A., Ball, S.L., deWaard, J.R., (2003b), Biological identifications through DNA barcodes Proceedings of the Royal Society of London Series B, Biological Sciences, (270), pp 313-321 Hebert, P.D.N., Ratnasingham, S., deWaard, J.R., (2003a), Barcoding animal life: cytochrome c oxydase subunit divergences among closely rerated species Proceedings of the Royal Society of London Series B, Biological Sciences, (270), pp 96-99 Hillyard, D.R, Monje, V.D,, Mintz, I.M,, Bean, B.P,, Nadasdi, L., Ramachandran, J., Miljanich, G., Azimi-Zoonooz, A., McIntosh, J.M., Cruz, L.J., Imperial, J.S., and Olivera, B.M., (1992), A new Conus peptide ligand for mammalian presynaptic Ca2+ channels, Neuron (9), pp 69-77 Hillyard, D.R., Olivera, B.M., Woodward, S., Corpuz, G.P., Gray, W.R., Ramilo, C.A and Cruz, L.J., (1989), A molluscivorous Conus toxin: conserved frameworks in conotoxins, Biochemistry, (28), pp 358-361 Huelsenbeck, J P., Ronquist, F., (2001), MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees, Bioinformatics, (17), pp 754–755 Hylleberg, J and Kilburm, R.N., (2003), Marine Molluscs of Vietnam, Proceeding of 16th International Congress and Workshop, Tropical Marine Molluscs Program (TMMP) Jacobsen R, Jimenez E.C, Grilley, M., Watkins, M., Hillyard, D., Cruz, L.J., Olivera, B.M., (1998), The contryphans, a d-tryptophan-containing family of Conus peptides: interconversion between conformers, J Peptide Res (51), pp 173-179 Jacobsen, R., Jimenez, E.C., De la Cruz, R.G.C, Gray, W.R., Cruz, L.J, Olivera B.M (1999), A novel d-leucine-containing Conus peptide: diverse confomational dynamics in the contryphan family, J Peptide Res (54), pp 93-99 Jimenez, E.C, Craig A.G, Watkins M, Hillyard D.R, Gray W.R, Gulyas J, Rivier J.E, Cruz L.J, Olivera B.M., (1997), Bromocontryphan: post-translational bromination of tryptophan, Biochemistry, (36), pp 989-994 Jimenez, E.C, Olivera, B.M, Gray W.R, and Cruz L.J., (1996), Contryphan is a Dtryptophan-containing Conus peptide J Biol Chem., (281), pp 28002-28005 Jimenez, E.C, Olivera, B.M., (2010), Divergent M- and O-superfamily peptides from venom of fish-hunting Conus parius, Peptides (31), pp 1678-1683 Jimenez, E.C., Watkins, M., Juszczak, L.J., Cruz, L.J., Olivera, B.M., (2001) Contryphan from Conus textile venom ducts, Toxicon, (39), pp 803-808 Kim, S.J., Rodriguez-Lanetty, M., Song, J.I., 2003, Genetic population structure of Littorina brevicula around Korean water, Hydrobiologia, (505), pp 41-48 68 53 Kipling, W.W and Daniel, R., (2004), Myth of the molecule: DNA barcodes for 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 species cannot replace morphology for identification and classification, Cladistics, (20), pp 47-55 Kohn, A.J, (1961), Studies on spawning behavior, egg masses, and larval development in the gastropod genus Conus PartI – Observations on nine species in Hawaii Pacif Sci, 15(2), pp 163-179 Kohn, A.J., (1999), Snail spears and scimitars: a character analysis of Conus radular teeth, J molluscan Stud., (65), pp 385-398 Lewis, R.J (2009), Conotoxins: molecular and therapeutic targets Prog Mol Subcell Biol., (46), pp 45-65 Liu Zhuguo, Ning Xu, Jie Hu, Chongjia Zhao, Zheng Yu, Qiuyun Dai, (2009), Identification of novel I-superfamily conopeptides from several clades of Conus species found in the South China Sea, Peptides, (30), pp 1782-1787 Liu, Z.J and Cordes, J.F., (2004), DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics, Aquaculture, (238) Liu, Z.J and Cordes, J.F., (2004), DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics, Aquaculture, (238), pp 22 Lubbers, N L., Campbell, T J., Polakowski, J S., Bulaj, G., Layer, R T., Moore, J., Gross, G J., and Cox, B F 2005 Postischemic administration of CGX-1051, a peptide from cone snail venom, reduces infarct size in both rat and dog models of myocardial ischemia and reperfusion J Cardiovasc Pharmacol 46: 141–6 Luo Sulan, Dongting Zhangsun, Ben Zhang, Xin Chen, Jianchen Feng, (2006), Direct cDNA cloning of novel conotoxins of the T-superfamily from Conus textile, Peptiedes, (27), pp 2640-2646 Malmberg, A B., Gilbert, H., McCabe, R T., Basbaum, A I 2003 Powerful antinociceptive effects of the cone snail venom-derived subtype-selective NMDA receptor antagonists conantokins G and T Pain 101: 109–116 McIntosh, J.M, Olivera, B.M, Cruz, L.J., and Gray, W.R., (1984), γCarboxyglutamate in a neuroactive toxin, J Biol Chem (259), pp 14343-14346 McIntosh, J.M., Jones, R.M., (2001), Cone venom from accidental stings to deliberate injection, Toxicon, (39), pp 1447-51 Miljanich GP., (1997), Venom peptides as human pharmaceuticals, Science Med, pp 6-15 Miljanich, G P 2004 Neutronal calcium chanel blocker for treating severe chronic pain Curr Med Chem 11: 3029–3040 Nam, H.H., Corneli, P.S., Watkins, M., Olivera, B., Bandyopadhyay, P., (2009), Multiple genes elucidate the evolution of venomous snail-hunting Conus species Molecular Phylogenetics and Evolution Nguyen Ngoc Thach, (2002), Recently collected shells of Vietnam L ‘Informator Piceno & N.N.T Italy Nielsen, C K., Lewis, R J., Alewood, D., Drinkwater, R., Palant, E., Patter-son, M., Yaksh, T L., McCumber, D., and Smith, M T., (2005), Anti-allodynic efficacy 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 of the chi-conopeptide, Xen2174, in rats with neuropathic pain, Nielsen CK, RJ Pain., 118: 112–124 Nylander, J A (2004), Mr Modeltest v2 Program distributed by the author Evolutionary Biology Centre, Uppsala University, Uppsala, Sweden Olivera B.M., (2002), Conus venom peptides: relections from the biology of clades and species, Annual Review of Ecology and Systematics, (33), pp 25-47 Olivera, B.M, Cruz L.J and Yoshikami, D., (1999), Effects of Conus peptides on the behavior of mice, Current Opinions Neurobiol, (9), pp 772-777 Olivera, B.M., (2006), Conus peptides: biodiversity-based discovery and exogenomics, J Biol Chem., (281), pp 31173-31177 Olivera, B.M., Cruz, L.J., V de Santos, G Le Cheminant, D Griffin, R Zeikus, McIntosh J.M., R Galyean, J Varga, Gray W.R and J Rivier, (1987) Neuronal Ca 2+ channel antagonists Discrimination between Ca2+ channel subtypes using omegaconotoxin from Conus magus venom, Biochemistry, (26), pp 2086-2090 Page, R.D 1996 TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers Computer Application Bioscience, 12: 357–358 Peng, C., Han, Y., Sanders, T., Chew, G., Liu, J., Hawrot, E., Chi, C., Wang, C., (2008), Alpha4/7-conotoxin Lp1.1 is a novel antagonist of neuronal nicotinic acetylcholine receptors, Peptides, 29 (10), pp 1700-1707 Pi, C., Liu, J., Peng, C., Liu, Y., Jiang, X., Zhao, Y., Tang, S., Wang, L., Dong, M., Chen, S., et al., (2006), Diversity and evolution of conotoxins based on gene expression profiling of Conus litteratus, Genomics 88 (6), pp 809-819 Posada, D., Crandall, K.A., (1998), Modeltest: testing the model of DNA substitution, Bioinformatics, (14), pp 817–818 Puillandre, N., Watkins, M., Olivera, B.M (2010), Evolution of Conus Peptide genes: Duplication and positive selection in the A-superfamily [in press] Röckel, D., Korn, W., Kohn, A.J., (1995), Manual of the Living Conidae (Vol I: Indo- Pacific Region) Verlag Christa Hemmen, Wiesbaden, Germany Satkunanathan, N., Livett, B., Gayler, K., Sandall, D., Down, J., and Khalil, Z., (2005),Alpha-conotoxin Vc1.1 alleviates neuropathic pain and accelerates functional recovery of injured neurones, Brain Research 1059: 149–158 Schander,C., Willassen, E., (2005), What can biological barcoding for marine biology?, Marine Biology Research, (1), pp 79-93 Smith, M T., Cabot, P J., Ross, F B., Robertson, A D., Lewis, R J., (2002), The novel N-type calcium channel blocker, AM336, produces potent dose-dependent antinociception after intrathecal dosing in rats and inhibits substance P release in rat spinal cord slices Pain 96: 119–127 Stewart J and Gilly W.F., (2005) Piscivorous Behavior of a Temperate Cone Snail, Conus californicus, Biological Bulletin (209), pp 146-153 Stoeckle, M (2003), Taxonomy, DNA, and the bar code of life, BioScience, (53), pp 796 – 797 Sullivan,J., Abdo,Z., Joyce, P., Swofford, D.L., (2005), Evaluating the performance of a successive-approximations approach to parameter optimization in maximum- 70 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 likelihood phylogeny estimation, Molecular Biology Evolution (22), pp 386– 1392 Swofford, D.L., (2001), PAUP: Phylogenetic analysis using parsimony (and other methods), Sinauer Associates, Sunderland MA Terlau, H, Olivera, B.M., (2004), Conus venoms: a rich source of novel ion channel-targeted peptides, Physiol Rev., 84(1): 41-68 Wang Cheng-Zhong, Hui Jiang, Zhou-Luo Ou, Ji-Sheng Chen, Cheng-Wu Chi, (2003), cDNA cloning of two A-superfamily conotoxins from Conus striatus, Toxicon, (42), pp 613-619 http://vnexpress.net/GL/Khoa-hoc/2002/07/3B9BE578/ http://www.environment.gov.au/biodiversi-ty/tradeuse/invitecomment/pubs/ cone-snails.pdf http://www.theconesnail.com/explore-cone-snails/shell-anatomy http://www.theconesnail.com/explore-cone-snails/venom http://www.vnio.org.vn/ http://zipcodezoo.com/Key/Animalia/Conus_Genus.asp http://www.baomoi.com/Home/DuLich/cand.com.vn/ http://www.sinhhocvietnam.com/vn/ 71 PHỤ LỤC So sánh trình tự DNA số loài ốc cối có đặc điểm hình thái giống Hình 1: So sánh trình tự gen 16S mt DNA Conus marmoreus C bandanus Ký tự có đánh dấu khác biệt nucleotid C marmore C bandanu GTTTACCAAA AACATGGCTT CGTGTTAGTG TTAAGATACG AAGTCGGACC TGCCCAGTGA GTTTACCAAA AACATGGCTT CATGTTAGTA TTAAGATACG AAGTCGGACC TGCCCAGTGA C marmore C bandanu ATTTTAAACG GCCGCGGTAC TCTGACCGTG CAAAGGTAGC ATAATCATTT GCCTTATAAT ATTTTAAACG GCCGCGGTAC TCTGACCGTG CAAAGGTAGC ATAATCATTT GCCTTATAAT C marmore C bandanu TGAAGGCTGG AATGAATGGT TTGACAAGAA TACACCTGTC TCTTTTAGAT TGCTTAGAAT TGAAGGCTGG AATGAATGGT TTGACAAGAA TACACCTGTC TCTTTTAGAT TGCTTAGAAT C marmore C bandanu TTTATCTCTG GATGAAAAAG TCTAGATATA ATTAAAAGAC AAGAAGACCC TATCGAGCTT TTTATCTCTG GATGAAAAAG TCTAGATATA ATTAAAAGAC AAGAAGACCC TATCGAGCTT C marmore C bandanu TAGAAGAATT AGTAGATTTA ATTTAGATCT ATATAAGTAA AAGAAAAACT ATTAAATACT TAGAAGAATT AGTAGATTTA ATTTAAATCT ATATAAGTAA AAGAAAAGCT ATTAAACACT C marmore C bandanu TTGGTTGGGG CAACCGAGGA GTAAATAAAG CCTCCTTTAG AATAATAAAT CTTACTTGTG TTGGTTGGGG CAACCGAGGA GTAAATAAAG CCTCCTTTAG AATAATAAAT CTTGCTTGTG C marmore C bandanu TTGATCCAAA ATTTTTGATC AAAGGAATTA GTTACCGTAG GGATAACAGC ATTATCTTTT TTGATCCAAA ATTTTTGATC AAAGGAATTA GTTACCGTAG GGATAACAGC ATTATCTTTT C marmore C bandanu TTGAGAGCTC ATATCGAAAA AAAGGTTTGT GACCTCGATG TTGGACCAGA ATGTCCTAAA TTGAGAGCTC ATATCGAAAA AAAGGTTTGT GACCTCGATG TTGGACCAGA ATGTCCTAAA C marmore C bandanu GATGCAGAAG TCTTTAAGGG TTGGTCTGTT CGACCATTAA AATTCTACGT GATCTGAGTT GATGCAGAAG TCTTTAAGGG TTGGTCTGTT CGACCATTAA AATTCTACGT GATCTGAGTT C marmore CAGACCGG C bandanu CAGACCGG Hình 2: So sánh trình tự gen 16S Conus litteratus, C leopardus C eburneus Ký hiệu có đánh dấu khác biệt nucleotide C littera C leopard C eburneu TTTTAAACGG CCGCGGTACT CTGACCGTGC AAAGGTAGCA TAATCATTTG CCTTATAATT TTTTAAACGG CCGCGGTACT CTGACCGTGC AAAGGTAGCA TAA ATTTG CCTTATAATT TTTTAAACGG CCGCGGTACT CTGACCGTGC AAAGGTAGCA TAATGATTTG CCTTATAATT C littera C leopard C eburneu GAAGGCTGGA ATGAATGGTT TGACAAGAAT ATACCTGTCT CCATTAGATT ATTTAGAATT GAAGGCTGGA ATGAATGGTT TGACATGAAT ATTACTGTCT CCCTTAGGTT ATTTAGAATT GAAGGCTGGA ATGAATGGTT TGACAAGAAT AC-CCTGTCT CTTTTAGATT CTATAGAATT C littera C leopard C eburneu TTATTTTTGG ATGAAAAAGT CCAGATGTAA TTAAAAGACA AGAAGACCCT ATCGAGCTTC TTATTTCTGG ATGAAAAAGT CTAGATATTA TTAAAAGACA AGAAGACCCT ATCGAGCTTT TTATTTTTGG ATGAAAAAGC CTAGATTGAA TTAAAAGACA AGAAGACCCT ATCGAGCTTT C littera C leopard C eburneu AGAAAAATTA GTAGACTT TGTAAATCAA TATAATTAAA AGAAAAGCTA TTAAATACTT AGAAAAATTA ATAGGCTTAG TGTAAATCAA TATAAGTAAA AGAAAGGCTA TTAAATACAT AGAGAAGTTA ATAGACTTAG TGTAAATCAA TATAAGTAAA AGAAAAACTA TTAAATACTT C littera C leopard C eburneu TGGTTGGGGC AACCGAGGAG TAATTAAAGC CTCCTCT-GA GTTATAAATC GTACTTGTGT TGGTTGGGGC AACCGAGGAG TAATTAAAGC CTCCTTTGTA TTTGTGAATC TCGCTTGAGT TGGTTGGGGC AACCGAGGAG CAAGTAAAGC CTCCTCT-CA GTGATAAGTC TTACTTGTGT 72 C littera C leopard C eburneu TGATCCAGTA -ATTTTGATC AAAGGAATTA GTTACCGTAG GGATAACAGC ATTATCTTTT TGATCCAAAG AATTTTGATC AAAGGAATTA GTTACCGTAG GGATAACAGC ATAATCTTTT TGATCCAAAC -TTTTTGATC AAAGGAATTA GTTACCGTAG GGATAACAGC ATTATCTTTT C littera C leopard C eburneu TCAAGAGCCC ATATCGAAAA AAAGGTTTGT GACCTCGATG TTGGACCAGA ATGACCTAAA TCAAGAGCTC ATATCGAAAA AAAGGTTTGT GACCTCGATG TTGGACCAGA ATGTCCTAAA TCAAGAGTCC ATATCGAAAA AAAGGT -CTCGATG TTGGACCAGA ATGTC - C littera C leopard C eburneu GATGCAG GATGCAG GATGCAG Hình 3: Trình tự gen 16S mtDNA Conus capitaneus C mustelinus Ký hiệu đánh dấu khác biệt nucleotide C.capitaneus C.mustelinus GTTTACCAAA AACATGGCTT CGTGTCCTCT GTAAATACGA AGTCGGACCT GCCCAGTGAG GTTTACCAAA AACATGGCTT CGTGTTGTTT ATAAATACGA AGTCGGACCT GCCCAGTGAG C.capitaneus C.mustelinus TTTTAAACGG CCGCGGTACT CTGACCGTGC AAAGGTAGCA TAATCATTTG CCTTATAATT TTTTAAACGG CCGCGGTACT CTGACCGTGC AAAGGTAGCA TAATCATTTG CCTTATAATT C.capitaneus C.mustelinus GAAGGCTGGA ATGAATGGTT TGACAAGAAT ACACCTGTCT CTTCATGATT ACTTAGAATT GAAGGCTGGA ATGAATGGTT TGACAAGAAT ACATCTGTCT CTTTATGATT GTTTAGAATT C.capitaneus C.mustelinus TTATTTCTAG ATGAAAAAGT CTAGATATTA TTAAAAGACA AGAAGACCCT ATCGAGCTTG TTATTTTTAG ATGAAAAAGT CTAGATATTA TTAAAAGACA AGAAGACCCT ATCGAGCTTG C.capitaneus C.mustelinus AGAAAAATTA ACAGGCATAT TAGAGCTCAA TATTAGTAAA AGAAAAGCTG TTAAACACTT AGAGAAATTA ACAGGTATAT TAGAGCTCAA TATTAGTAAA AGAAAGGCTG TTAAATACTT C.capitaneus C.mustelinus TGGTTGGGGC AACCTGGGAG TAAGTAAAGC CTCCTAATTA TAACAAGTCG GACCTGCGTT TGGTTGGGGC AACCTAGGAG TAAGTAAAGC CTCCTAATTA TGATAAGTCG GACTTGCGTT C.capitaneus C.mustelinus GATCCAGTTG TATTGATCAA AGGAATTAGT TACCGTAGGG ATAACAGCAT TATCTTTTTC GATCCAACCA TATTGATCAA AGGAATTAGT TACCGTAGGG ATAACAGCAT TATCTTTTTC C.capitaneus C.mustelinus AAGAGCCCAT ATCGAAAAAA AGGTTTGTGA CCTCGATGTT GGACCAGAAT GTCCTAAAGA AAGAGCCCAT ATCGAAAAAA AGGTTTGTGA CCTCGATGTT GGACCAGAAT ATCCTAAAGA C.capitaneus C.mustelinus TGCAGAAGTC TTTAAGGGTT GGTCTGTTCG ACCATTAAAA TTCTACGTGA TCTGA TGCAGAAGTC TTTAAGGGTT GGTCTGTTCG ACCATTAAAA TTCTACGTGA TCTGA Hình 4: So sánh trình tự gen 16S mtDNA Conus distans (từ Genbank) Conus cf distans Ký hiệu đánh dấu khác biệt nucleotide C._distans C.cf.dista GGCTTTGTGT TAGTGTTAAG ATACGAAGTC GGACCTGCCC AGTGAATTTT TAAACGGCCG GGCTTCATGT TAAACCTAAA ATATGAAGTC GGACCTGCCC AGTGAGTTTT -AAACGGCCG C._distans C.cf.dista CGGTACTCTG ACCGTGCAAA GGTAGCATAA TCATTTGCCT TATAATTGAA GGCTGGAATG CGGTACTCTG ACCGTGCAAA GGTAGCATAA TCATTTGCCT TATAATTGAA GGCTGGAATG C._distans C.cf.dista AATGGTTTGA CAAGAATACA CCTGTCTCTT TTTGATTGCT TAGAATTTTA TCTCTGGATG AATGGTTTGA CAAGAATATA ACTGTCTCTC TATGACTACT TAGAATTTTA TTTTTGGATG C._distans C.cf.dista AAAAAGTCTA GATATAATTA AAAGACAAGA AGACCCTATC GAGCTTTAGA AGAATTAGTA AAAAAGTCCA GATTAAATTA AAAGACAAGA AGACCCTATC GAGCTTTAGA GAAATTAGAG C._distans Conus_dist GATTTAATTT AAATTTATAT AAGTAAAAGA AAAA-CTATT AAACACTTTG GTTGGGGCAA GATTTAAATT AA-TTAATAT TTTATAAAAA ATAGACTTCT ATAAACATTG GTTGGGGCAA C._distans C.cf.dista CCGAGGAGTA AATAAAGCCT CCTTTAGAAT A-ATAAATCT TACTTGTGTT GATCCAAAAT CCTGGGAGTA TATAAAGCCT CCTTTA-ATT GTATAAGTCT TACAAGTATT GATCCAAACT 73 C._distans C.cf.dista TTTTGATCAA AGGAATTAGT TACCGTAGGG ATAACAGCAT TATCTTTTTT GAGAGCTCAT TTTTGATCAA AGGAATTAGT TACCGTAGGG ATAACAGCAT TATCTTTTTT GAGAGCCCAT C._distans C.cf.dista ATCGAAAAAA AGGTTTGTGA CCTCGATGTT GGACCAGAAT GTCCTAAAGA TGCAGAAGTC ATCGAAAAAA AGGTTTGTGA CCTCGATGTT GGACCAGAAT GTCCTGAAGA TGCAGAAGTC C._distans C.cf.dista TTTAAGGGTT GGTCTGTTCG ACCATTAAAA TTCT TTCAAGGGTT GGTCTGTTCG ACCATTAAAA TTCT Hình 5: So sánh trình tự gen CO1 mt DNA Conus marmoreus C bandanus Ký tự có đánh dấu khác biệt nucleotid C bandnus C marmore CATAAAGATA TTGGGACATT ATATATTTTA TTTGGAATGT GATCTGGTTT GGTTGGAACT CATAAAGATA TCGGGACATT ATATATTTTA TTTGGAATGT GATCTGGTTT GGTTGGAACT C bandnus C marmore GCTCTCAGTT GTTAATTCGT GCAGAGTTAG GACAACCAGG TGCTTTGCTT GGGGACGATC GCTCTCAGTT GTTAATTCGT GCAGAATTAG GACAACCAGG TGCTTTGCTT GGGGACGATC C bandnus C marmore AACTATATAA TGTAATTGTA ACAGCTCATG CTTTTGTTAT AATTTTTTTC TTAGTGATGC AACTATATAA TGTAATTGTA ACAGCTCATG CTTTTGTTAT GATTTTTTTT TTAGTAATGC C bandnus C marmore CTATAATGAT TGGGGGTTTT GGGAATTGAT TAGTACCATT AATATTAGGG GCTCCGGATA CTATAATGAT TGGGGGTTTT GGGAATTGAT TAGTACCATT AATATTAGGG GCTCCGGATA C bandnus C marmore TGGTATTTCC AGTTTAAATA ATATAAGTTT TTGATTATTG CCTCCTGCAC TTTTGCTTCT TAGTATTTCC GGTTTGAATA ATATAAGTTT TTGATTATTA CCTCCTGCAC TTTTGCTTCT C bandnus C marmore TTTGTCATCT GCTGCGGTAG AAAGTGGAGT GGGTACGGGG TGAACTGTGT ATCCGCCATT TTTGTCATCT GCTGCAGTAG AAAGTGGAGT TGGTACGGGG TGAACTGTGT ATCCACCATT C bandnus C marmore AGCTGGAAAT CTAGCACATG CTGGTGGGTC AGTAGACCTA GCAATTTTTT CTTTACATCT AGCCGGAAAT CTAGCACATG CTGGCGGGTC GGTAGACCTA GCAATTTTTT CCTTACATCT C bandnus C marmore TGCTGGTGTT TCTTCTATTT TAGGGGCAGT AAACTTTATT ACTACAATTA TTAATATACG TGCTGGTGTT TCTTCTATTT TAGGGGCAGT AAATTTTATT ACTACAATTA TTAATATACG C bandnus C marmore ATGACAGGGA ATAAAATTTG AACGTCTTTC GTTGTTTGTC TGATCTGTGA AAATTACAGC ATGACAGGGA ATAAAATTTG AACGTCTTTC GTTATTTGTG TGATCTGTGA AGATTACAGC C bandnus C marmore AATTTTGCTT CTTTTGTCTT TACCTTATTG GCCGGTGCAA TTACTATACT TTTGACTGAT AATTTTGCTT CTTTTGTCTT TACCTTATTG GCTGGTGCAA TTACTATACT TTTGACTGAT C bandnus C marmore CGAAATTTCA ATACTGCTTT TTTTGATCCG GCAG CGAAATTTCA ATACTGCTTT TTTTGATCCG GCAG Hình 6: So sánh trình tự gen CO1 mtDNA Conus litteratus, C leopardus C eburneus Ký hiệu có đánh dấu khác biệt nucleotide C eburneu C leopard C littera CATAAAGATA TTGGGACATT ATATATTTTA TTTGGAATGT GATCTGGTTT GGTTGGAACT CATAAAGATA TTGGGACATT GTACATTTTA TTTGGAATAT GGTCTGGTTT AGTTGGGACT CATAAAGATA TTGGGACATT ATACATTTTG TTTGGTATGT GGTCTGGGTT GGTTGGAACT C eburneu C leopard C littera GCTCTCAGTT GTTAATTCGT GCAGAATTAG GACAACCAGG TGCTTTGCTT GGGGACGATC GCGTTAAGCT ATTAATCCGT GCGGAGTTAG GACAGCCTGG TGCTCTTCTT GGGGATGATC GCTTTAAATT ATTGATTCGT GCGGAGCTAG GACAGCCTGG TGCTTTACTC GGAGACGATC C eburneu C leopard C littera AACTATATAA TGTAATTGTA ACAGCTCATG CTTTTGTTAT GATTTTTTTT TTAGTAATGC AGCTATATAA TGTGATTGTG ACGGCTCATG CCTTTGTTAT GATTTTTTTC TTAGTAATAC AGCTATATAA TGTAATTGTG ACAGCTCATG CTTTTGTAAT GATTTTTTTC TTAGTAATAC C eburneu C leopard CTATAATGAT TGGGGGTTTT GGGAATTGAT TAGTACCATT AATATTAGGG GCTCCGGATA CTATAATAAT TGGGGGTTTT GGGAATTGAT TGGTACCATT GATGTTGGGG GCTCCGGATA 74 C littera CAATGATAAT TGGGGGTTTT GGGAATTGGT TGGTACCTCT AATATTAGGA GCTCCAGATA C eburneu C leopard C littera TAGTATTTCC GGTTTGAATA ATATAAGTTT TTGATTATTA CCTCCTGCAC TTTTGCTTCT TGGTATTTCC AGATTGAATA ATATAAGTTT CTGATTGCTC CCTCCTGCTC TTTTACTACT TGGTGTTTCC AGGTTAAATA ATATGAGTTT CTGACTTCTT CCTCCTGCTC TTTTATTGCT C eburneu C leopard C littera TTTGTCATCT GCTGCAGTAG AAAGTGGAGT TGGTACGGGG TGAACTGTGT ATCCACCATT TTTATCGTCG GCTGCTGTGG AAAGTGGGGT CGGTACGGGT TGAACTGTGT ATCCACCTTT TCTATCTTCA GCTGCTGTGG AAAGTGGAGT AGGTACGGGA TGAACTGTTT ATCCACCTTT C eburneu C leopard C littera AGCCGGAAAT CTAGCACATG CTGGCGGGTC GGTAGACCTA GCAATTTTTT CCTTACATCT GGCTGGGAAT TTGGCTCATG CTGGTGGGTC TGTAGATCTG GCGATTTTTT CTTTACATCT AGCGGGGAAC TTGGCTCATG CTGGTGGATC AGTAGATTTA GCGATTTTTT CTTTACACCT C eburneu C leopard C littera TGCTGGTGTT TCTTCTATTT TAGGGGCAGT AAATTTTATT ACTACAATTA TTAATATACG TGCTGGGGTG TCTTCTATTT TAGGTGCTGT AAATTTTATT ACTACTATTA TTAATATACG TGCTGGTGTG TCTTCTATTC TAGGGGCTGT AAATTTTATT ACTACTATTA TTAATATACG C eburneu C leopard C littera ATGACAGGGA ATAAAATTTG AACGTCTTTC GTTATTTGTG TGATCTGTGA AGATTACAGC ATGGCAGGGA ATGAAGTTTG AGCGTCTTTC TTTGTTTGTA TGATCGGTGA AAATTACGGC ATGGCAGGGA ATAAAATTTG AGCGTCTTTC ATTATTTGTA TGATCTGTGA AAATTACGGC C eburneu C leopard C littera AATTTTGCTT CTTTTGTCTT TACCTTATTG GCTGGTGCAA TTACTATACT TTTGACTGAT TATTTTGCTT CTTCTGTCTT TGCCTTATTA GCAGGTGCTA TTACTATACT CTTGACTGAT TATTTTACTT TTATTGTCTT TACCTTTTTA GCTGGTGCAA TTACTATGCT TTTAACTGAT C eburneu C leopard C littera CGAAATTTCA AT-ACTGCTT TTTTTGATCC GGCAG CGGAATTTTA ATTGCTGCTT TTTTTGCT-T ACAAG CGAAATTTTA AT-ACTGCTT TCTTCGACCC AGCAG 75