Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHẠM THỊ THÙY NHUNG KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN CHẾ PHẨM CÓ KHẢ NĂNG KÌM HÃM ALPHA AMYLASE VÀ ALPHA GLUCOSIDASE Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS QUẢN LÊ HÀ Hà Nội – Năm 2013 Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật MỤC LỤC MỤC LỤC .2 LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .6 DANH MỤC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan bệnh đái tháo đường (tiểu đường) 12 1.2 Tổng quan enzyme Amylase, enzyme Alpha glucosidase chất có khả kìm hãm chúng .17 1.2.1 Tổng quan Amylase: 17 1.2.2 Alpha glucosidase 19 1.3 Chất kìm hãm α-glucosidse (alpha glucosidase inhibitors – AGIs) .21 I.3.1 Cơ chế tác dụng AGIs điều trị tiểu đường type 21 1.3.2 Nguồn sản xuất AGIs 24 1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng AGIs 28 1.4.1 Trên giới .28 1.4.2 Tại Việt Nam .29 1.5 Tổng quan đậu đen Nấm mốc Aspergillus oryzae 29 1.5.1 Tổng quan đậu đen 29 1.5.2 Tổng quan nấm mốc Aspergillus oryzae 30 1.6 Tổng quan sản phẩm lên men douchi 33 1.6.1 Douchi lên men truyền thống .33 1.6.2 Vật liệu cho sản phẩm douchi truyền thống .34 1.6.3 Asperillus oryzae sản phẩm lên men từ đậu 35 1.7 Phương pháp tách chiết AGIs 40 1.8 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm AGIs 42 1.8.1 Đối với α-glucosidase 42 1.8.2 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-amylase 44 I.8.3 Giá trị IC50 45 Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1 Vật liệu nghiên cứu 46 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 46 2.1.2 Thiết bị 46 2.1.3 Hóa chất .47 2.1.4 Môi trường chuẩn bị nấm mốc 47 2.2 Phương pháp 48 2.2.1 Qui trình thu nhận sản phẩm ĐSLM 48 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-amylase dịch chiết đậu lên men .50 2.3 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase dịch chiết ĐSLM .53 2.4 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết 55 2.5 Khảo sát hoạt tính kìm hãm enzyme sản phẩm ĐSLM sấy khô 55 2.6 Kiểm tra mức độ kìm hãm cồn ethanol enzyme 56 2.7 Qúa trình tinh mẫu 56 2.7.1 Hấp thụ qua than hoạt tính 56 2.7.2 Lọc qua màng 57 2.7.3 Cô đặc mẫu 57 2.7.4 Sấy sản phẩm 57 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1 Nghiên cứu khả kìm hãm α-amylase dịch chiết ĐSLM 58 3.1.1 Đánh giá khả kìm hãm α-amylase phương pháp định tính 58 3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian ủ đến khả kìm hãm α-amylase 60 3.1.3 Lựa chọn phương pháp tách chiết hoạt tính kìm hãm α-amylase từ ĐSLM 63 3.1.4 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết 64 3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng hoạt tính kìm hãm α-amylase sản phẩm sấy khô ĐSLM 65 3.1.6 Kết mẫu khử mầu với than hoạt tính xác định hoạt tính kìm hãm α-amylase 66 3.1.7 Khả kìm hãm α-amylase dịch chiết ĐSLM mẫu lọc qua màng lọc 68 3.1.8 Đánh giá khả kìm hãm mẫu ĐSLM sau sấy .68 3.2 Nghiên cứu khả kìm hãm α-glucosidase từ dịch chiết ĐSLM 70 3.2.1 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết 70 Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng hoạt tính kìm hãm α-glucosidase sản phẩm sấy khô ĐSLM 71 3.2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ than hoạt tính đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 71 3.2.4 Khả kìm hãm α-glucosidase dịch chiết ĐSLM mẫu lọc qua màng lọc 72 3.2.5 Đánh giá khả kìm hãm α-glucosidase mẫu ĐSLM sau sấy 73 3.3 Đề xuất quy trình .74 PHẦN IV KẾT LUẬN 76 PHẦN V KIẾN NGHỊ .77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC 84 3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng hoạt tính kìm hãm α-amylase sản phẩm sấy khô ĐSLM 86 a) Ảnh hưởng tỷ lệ than hoạt tính đến khả khử mầu dịch chiết ĐSLM 87 3.1.10 Mức độ kìm hãm nồng độ cồn α-amylase 89 3.2 Nghiên cứu khả kìm hãm α-glucosidase từ dịch chiết ĐSLM 89 3.2.1 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết 89 3.2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ than hoạt tính đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 89 HÌNH ẢNH QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY, LÊN MEN, Ủ VÀ SẤY .93 LỜI CAM ĐOAN Tôi Phạm Thị Thùy Nhung xin cam đoan nôi dung luận văn với đề tài “Khảo sát điều kiện bảo quản chế phẩm có khả kìm hãm alpha amylase alpha glucosidase” công trình nghiên cứu sáng tạo thực hướng dẫn PGS.TS Quản Lê Hà –Bộ môn Công nghệ Sinh học Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy cô giáo, gia đình bạn bè Trước hết, xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Quản Lê Hà - Viện Công Nghệ Sinh Học & Thực Phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo suốt trình hoàn thành luận văn này, Tôi xin chân thành cảm ơn tới cô giáo thuộc môn Công nghệ Sinh học– Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Đồng thời xin chân thành cảm ơn gia đình, thầy cô bạn học viên, sinh viên làm việc phòng thí nghiệm thuộc Viện Công nghệ Sinh học & Thực Phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, với lòng biết ơn sâu sắc tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Học viên Phạm Thị Thùy Nhung DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu AGIs AAIs IC50 4-NPG v/ph PP ĐSLM DNS DALY Tên đầy đủ alpha glucosidase inhibitors Alpha amylase inhibitors 50% inhibitor concentration 4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside Vòng/phút Phương pháp Đậu sau lên men Dinitrosalicylic acid Năm sống tàn tật hiệu chỉnh (Disability – adjusted life years) Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật DANH MỤC BẢNG, BIỂU STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang Bảng1.1: Sự đa dạng thành phần amino axit đậu douchi 35 (mg/100g) Bảng 2.1 Khả kìm hãm α-amylase dịch chiết theo thời 60 gian ủ, % Bảng 2.2 Mẫu dịch chiết ĐSLM cho hoạt tính kìm hám α-amylase 64 nồng độ khác Bảng 2.3 Tổng phần trăm kìm hãm α-amylase thu theo tỷ 65 lệ chiết Bảng 2.4 Phần trăm khử mầu than hoạt tính với mẫu ĐSLM 67 Bảng 2.5 Hoạt tính kìm hãm α-amylase theo nồng độ khử mầu 61 than hoạt tính Bảng 2.6 Khảo sát mẫu lọc qua màng mẫu không lọc 68 Bảng 2.7 Kết phần trăm kìm hãm α-amylase dịch chiết 69 ĐSLM sau sấy Bảng 2.8 Ảnh hưởng tỷ lệ chiết khác tới hoạt tính kìm hãm 71 10 11 12 α-glucosidase Bảng 2.9 Tổng % kìm hãm thu theo tỷ lệ chiết 71 Bảng 2.10: Kết kìm hãm α-glucosidase dịch chiết ĐSLM 72 Bảng 2.11 Kết hoạt tính kìm hãm α-glucosidase với mẫu sau 72 13 14 lọc than hoạt tính Bảng 2.12 Kết hoạt tính kìm hãm với mẫu sau lọc màng Bảng 2.13 Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase qua mẫu sấy 73 74 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ, đồ thị Hình 1.1: Cấu trúc phân tử Amylose Hình 1.2: Cấu trúc phân tử Amylopectin Hình 1.3 Cấu trúc phân tử α – maltase Hình 1.4 Ảnh hưởng chất kìm hãm α-glucosidase đến trình Trang 17 18 21 23 trao đổi đường thể Hình 1.5: Cấu trúc phân tử Acarbose Hình 1.6: Cấu trúc phân tử Miglitol 26 27 Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 10 11 12 13 14 15 16 Hình 1.7: Cấu trúc phân tử volibose Hình 1.8: Hình thái vi học A ozyrae Hình 1.9: Quy trình sản xuất touchi từ đậu tương đen (black soybean) Hình 1.10: Quá trình lên men đậu đen Hình 1.11: Khái quát trình chiết xuất Hình 1.12: Quy trình chuẩn bị cho sản phẩm douchiba Hình 13: Quy trình thu nhận sản phẩm ĐSLM Hình 1.14: Phương trình tạo màu đường khử DNS acid Hình 2.1: Kết thử nghiệm phương pháp định tính Hình 2.2 Khả kìm hãm α-amylase dịch chiết ĐSLM 17 PP1 Hình 2.3 Khả kìm hãm α-amylase dịch chiết ĐSLM 62 18 PP Hình 2.4 Khả kìm hãm α-amylase dịch chiết ĐSLM 62 19 PP Hình 2.5 Khả kìm hãm α-amylase dịch chiết ĐSLM 63 20 21 PP khác sau 19 ngày ủ Hình 2.6 Khả kìm hãm α-amylase dịch chiết ĐSLM Hình 3.1 Quy trình sản xuất ĐSLM thành phẩm Phạm Thị Thùy Nhung 27 31 37 37 38 39 49 52 60 61 66 75 Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật LỜI MỞ ĐẦU Đã từ lâu người biết đái tháo đường (ĐTĐ) hay bệnh tiểu đường bệnh rối loạn chuyển hóa, biến chứng mà gây gần làm sáng tỏ Từ năm 90 kỷ 20, chuyên gia y tế dự báo “Thế kỷ 21 kỷ bệnh rối loạn chuyển hoá” Bệnh ĐTĐ gây nhiều biến chứng nguy hiểm nguyên nhân hàng đầu gây nhồi máu tim, đột quỵ, suy thận giai đoạn cuối mù lòa… làm tăng tỷ lệ tử vong lên gấp 2-4 lần so với người không bị ĐTĐ Trên giới, bệnh đái tháo đường có tất chấu lục, vùng lãnh thổ, nước có điều kiện kinh tế xã hội khác Bệnh ngày phổ biến tuổi thọ ngày tăng, ăn uống ngày nhiều thức ăn có chiều hướng dung thức ăn chế biến sẵn, giàu chất dinh dưỡng, chất xơ (1) Bệnh đái tháo đường chiếm tỉ lệ 4-7% dân số nhiều nước giới Lứa tuổi 15 mắc bệnh chiếm khoảng 4-5% Các nước chấu Âu, châu Mỹ có tỉ lệ mắc bệnh đái tháo đường 2-8%, nước châu Mỹ La tinh 4,5-6,9%, nước châu Á từ 1% đến gần 5% Theo tổ chức Y tế giới, năm 1985 giới có 30 triệu người mắc bệnh đái tháo đường đây, Hội nghị giới lần thứ 15 đái tháo đường (tháng 11 năm 1994) Kobe – Nhật Bản thống kê số người bị đái tháo đường 120 triệu (1) Năm 2000, số người mắc bệnh tiểu đường khắp giới 170 triệu người ước tính đến năm 2030 số 366 triệu người (20) Với gia tăng số bệnh nhân mắc bệnh, kéo thao hàng loạt hệ lụy thách thức cho phát triển kinh tế xã hội việc phòng điều trị đái tháo Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật đường vấn đề cấp thiết nay.Y học có nhiều phương pháp loại thuốc để điều trị bệnh tiểu đường như: tiêm insulin; dùng loại thuốc nhóm Sulfonylurea, Biguanid, dẫn chất Thiazolidinedion, chất ức chế Aldose reductase, chất ức chế α-glucosidase (alpha glucosidase inhibitors – AGIs) thuốc uống chống đái tháo đường thuộc nhóm Glymidin, Gôm guar, Repaglinid… Có nhiều chất có tác dụng ức chế alpha glucosidase Hiện có số chất lưu hành thị trường acabose, miglitol, emiglitat.Tuy nhiên, loại thuốc có nhiều tác dụng phụ như: hạ đường huyết, dị ứng thuốc, rối loạn tiêu hóa, rối loạn chức gan thận [65] Trên giới có nhiều công trình nghiên cứu đưa vào sản xuất thực phẩm chức có khả kìm hãm alpha amylase alpha glucosidase từ nhiều nguồn nguyên liệu thực vật khác có sử dụng đậu tương lên men Ở nước ta, nghiên cứu tổng hợp AGIs AAIs từ đậu đen lên men có ghi nhận đáng kể vài năm trở lại Các nhà khoa học tin tưởng chất kìm hãm enzyme alpha amylase alpha glucosidase giúp ích việc kiểm soát hiệu lượng đường máu mục tiêu đặt phải khảo sát điều kiện bảo quản nhằm tối ưu hóa hoạt tính enzym kìm hãm để tạo chế phẩm dễ sử dụng chứa hoạt tính cao Trước tình hình thực tế trên, tiến hành thự đề tài: “Khảo sát điều kiện bảo quản sản phẩm chứa chất kìm hãm enzym amylase alpha glucosidase» Mục đích nội dung đề tài bao gồm: Mục đích đề tài: - Xác định công thức phối trộn thích hợp để tạo chế phẩm chứa enzyme kìm hãm alpha -amylase alpha –glucosidase - Khảo sát điều kiệm bảo quản tìm điều kiện bảo quản thích hợp cho dạng chế phẩm xác định 10 Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 41 Song, J.M and Ju, H.R (2002) The New Edition for Processing Technology of Soybean fuctions’.Shandong University Press 186-196 42 Tanasorn Tunsaringkarn1, Anusorn Rungsiyothin1, Nijsiri Ruangrungsi1,2; alpha glucosidase inhibitory activity of Thai mimosaceous plant extracts; 1College of Public Health Pharmacognosy, Sciences, Faculty Chulalongkorn of University; Pharmaceutical Sciences, Department of Chulalongkorn University, Bangkok 10330 43 Tanasorn Tunsaringkarn, Anusorn Rungsiyothin Nijsiri Ruangrungsi; αglucosidase inhibitory activity of Thai Mimosaceous plant extracts; (2008) pp: 29-33 44 World Health Organization (2006), “Definition and diagnosis of Diabetes mellitus and intermediate hyperglycaemia”, report of a WHO/IDF consultion, pp 1, 2, 3, 10, 27, 37.] 45 Yong-Mu Kim, Myeong-Hyeon Wang and Hae-Ik Rhee (2004), “A novel aglucosidase inhibitor from pine bank”, Carbohydrate Research 339, pp.715717 46 Yamaki, K., & Mori, Y (2006) Evaluation of alpha-glucosidase inhibitory activity in Colored Foods: A trial using slope factors of regression curves Nippon Shokuhin Kagaku Kaishi, 53(4), 229-231 (in Japanese)] 47 Yunping Zhu, Xiuting Li, Zhigang Huang, Lite Li, Yicheng Su; Improving Antiα-Glucosidase Activity of Douchi Koji Using a Newly Isolated Strain of Bacillus subtilis B2 48 Yaqiong LIU, Lijun WANG, Yongqiang CHENG, Masayoshi SAITO, Kohji YAMAKI, Zhihong QIAO and Lite LI; “Isoflavone content and Antiacetylcholinesterase activity in Commercial Douchi (a Traditional Chinese Saltfermented Soybean Food)”; pp 301-307 (2009) http://www.jicas.affrc.go.jp] Tài liệu Internet: 49 http://3tpharma.com.vn/5897/benh-tieu-duong-type-1-la-gi/ 50 http://3tpharma.com.vn/5912/benh-tieu-duong-type-2-la-gi/ 82 Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 51 http://benhdaiduong.suckhoevietnam.info/cac-loai-thuoc-uong-dieu-tri-dai-thao- duong/ 52 http://www.duoclieu.org/2011/12/au-en-hat-vigna-cylindrica.html 53 http://dantri.com.vn/c7/s162-471238/bien-chung-nguy-hiem-cua-benh-tieu54 55 56 57 58 59 duong.htm http://tintuccaonien.com/docs/docs_4/4_2_36.htm http://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_oryzae http://science.marshall.edu/murraye/alpha_amylase.htm http://www.mpbio.com/detailed_info.php?family_key=05220192&country=230 http://en.wikipedia.org/wiki/Alpha-glucosidase http://www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2011/MB_cgi?mode=&term=alpha- Glucosidases 60 http://en.wikipedia.org/wiki/Alpha-glucosidase_inhibitor 61 http://nippon-sapuri.com/english/product_t.html 62 http://en.wikipedia.org/wiki/Acarbose 63 Glyset miglitol tables for Oral Use; (2008); page http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/020682s008lbl.pdf 64 http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%E1%BA%ADu_%C4%91en 65 http://suckhoe68.com/thuoc-va-suc-khoe_1/thuoc-tay-y/tac-dung-phu-cua- thuoc-tri-benh-tieu-duong.html 83 Phạm Thị Thùy Nhung 3; Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật PHỤ LỤC 3.1 Nghiên cứu khả kìm hãm α-amylase từ dịch chiết ĐSLM 3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian ủ đến khả kìm hãm α-amylase Touchi ủ ngày: OD1 PP chiết 0.399 0.399 0.399 Touchi ủ ngày 0.399 0.399 0.399 Touchi ủ ngày 0.399 0.399 0.399 Touchi ủ ngày OD3 OD2 Hoạt tính kìm PP PP PP 0.183 0.191 0.188 0.533 0.534 0.484 hãm (%) 12.2807 14.03509 25.81454 PP PP PP 0.183 0.200 0.200 0.519 0.523 0.480 15.78947 19.04762 29.82456 PP PP PP 0.156 0.241 0.248 0.49 0.548 0.484 16.29 23.06 40.85 84 Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP 0.399 PP 0.399 PP 0.399 PP Touchi ủ 11 ngày 0.436 PP 0.436 PP 0.436 PP Touchi ủ 13 ngày 0.399 PP 0.399 PP 0.399 PP Touchi ủ 15 ngày 0.399 PP 0.410 PP 0.399 PP Touchi ủ 17 ngày 0.424 PP 0.424 PP 0.424 PP Touchi ủ 19 ngày 0.424 PP 0.424 PP 0.424 PP Touchi ủ 21 ngày 0.4185 PP 0.4185 PP 0.4185 PP Touchi ủ 23 ngày 0.4198 PP 0.4198 PP 0.4198 PP Touchi ủ 25 ngày 0,420 PP 0,420 PP 0,420 PP Touchi ủ 27 ngày 0,423 PP 0,423 PP 0,423 PP Touchi ủ 29 ngày Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 0.241 0.249 0.25 0.548 0.514 0.478 23.06 33.58 42.85 0.594 0.633 0.501 0.861 0.888 0.749 38.76 41.51 43.12 0.593 0.568 0.519 0.808 0.716 0.716 46.11 51.63 50.63 0.568 0.588 0.507 0.716 0.774 0.683 51.63 54.63 55.88 0.357 0.481 0.454 0.540 0.646 0.591 56.83 61.08 67.69 0.56 0.578 0.51 0.687 0.681 0.595 70.05 75.71 79.95 0.456 0.494 0.421 0.607 0.621 0.535 63.91 69.65 72.76 0.433 0.484 0.401 0.607 0.631 0.525 58.55 64.98 70.46 0.425 0.494 0.381 0.619 0.665 0.515 53.81 59.23 68.10 0.409 0.459 0.361 0.563 0.605 0.485 63.59 65.48 70.69 85 Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP 0.414 0.414 0.414 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật PP PP PP 0.399 0.459 0.358 0.563 0.6 0.48 60.39 65.94 70.53 3.1.4 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết Tỷ lệ chiết Phương pháp chiết 1:02 PP PP PP PP PP PP PP PP PP PP PP PP PP PP PP 1:04 1:06 1:08 1:10 Giá trị OD 540nm OD1 OD2 OD3 0.4198 0.253 0.254 0.4185 0.311 0.311 0.4185 0.218 0.218 0.4198 0.556 0.547 0.4185 0.563 0.558 0.4185 0.452 0.452 0.4198 0.657 0.518 0.4185 0.684 0.602 0.4185 0.576 0.559 0.4198 0.628 0.461 0.4185 0.738 0.64 0.4185 0.522 0.466 0.4198 0.594 0.411 0.4185 0.751 0.61 0.4185 0.51 0.389 Hoạt tính kìm hãm (%) 100.00 100.00 100.00 97.85 98.81 100.00 66.84 80.40 95.93 60.16 76.58 86.61 56.34 66.30 71.08 3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng hoạt tính kìm hãm α-amylase sản phẩm sấy khô ĐSLM Tỷ lệ pha loãng Phương pháp chiết 1:0 PP PP PP PP PP PP PP PP PP PP 1:0.25 1:0.5 1:0.75 Giá trị OD 540nm OD1 OD2 OD3 0.400 0.585 0.585 0.756 0.756 0.702 0.702 0.400 0.754 0.754 0.825 0.803 0.789 0.689 0.400 0.623 0.585 0.783 0.644 0.731 0.537 0.400 0.61 0.496 86 Phạm Thị Thùy Nhung Hoạt tính kìm hãm (%) 100.00 100.00 100.00 100.00 83.70 75.04 90.50 65.41 51.07 71.25 Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật PP PP PP PP PP 1:1 0.400 0.747 0.692 0.577 0.7 0.659 0.549 0.454 0.418 0.459 0.407 50.50 40.55 60.25 39.84 37.12 3.1.6 Kết mẫu khử mầu với than hoạt tính xác định hoạt tính kìm hãm αamylase a) Ảnh hưởng tỷ lệ than hoạt tính đến khả khử mầu dịch chiết ĐSLM Nồng độ than % khử mầu 0.0% 0.00 0.2% 80.15 0.4% 90.96 0.6% 94.88 0.8% 98.52 1.0% 98.71 b) Hoạt tính kìm hãm dịch chiết ĐSLM: OD540nm 3.652 (= 0.913x4) 0.725 0.330 0.187 0.054 0.047 Nồng độ than Hoạt tính kìm hãm (%) OD540nm OD1 OD2 0.349 0.666 0.349 0.678 0.349 0.69 0.349 0.702 0.349 0.712 0.349 0.721 0.0% 0.2% 0.4% 0.6% 0.8% 1.0% OD3 0.658 0.606 0.602 0.601 0.589 0.585 97.70 79.36 74.78 71.06 64.75 61.03 3.1.7 Khả kìm hãm α-amylase dịch chiết ĐSLM mẫu lọc qua màng lọc Tỷ lệ chiết Điều xử lý kiện Gía trị OD 540nm OD1 OD2 OD3 87 Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP 1:2 1:2 1:6 1:6 Qua lọc Chưa lọc Qua lọc Chưa lọc Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 0.385 0.385 0.385 0.385 0.475 0.454 0.785 0.781 0.450 0.454 0.706 0.72 93.51 100.00 79.48 81.16 3.1.8 Đánh giá khả kìm hãm mẫu ĐSLM sau sấy Tỷ lệ pha (mg/ml) Giá trị OD 540nm Hoạt tính kìm hãm (%) OD1 OD2 OD3 Mẫu 40 0.456 0.674 0.467 54.61 22 0.562 0.300 42.54 Acarbose 0.470 0.133 26.10 0.450 0.067 16.01 0.8 0.422 0.032 14.47 Mẫu 100 C 50 0.499 0.249 45.18 25 0.519 0.148 18.64 10 0.466 0.065 12.06 0.461 0.032 5.92 0.457 0.021 4.39 Mẫu 80 C 50 0.343 0.212 71.27 25 0.40 0.155 46.27 10 0.479 0.049 10.09 0.465 0.032 5.04 0.455 0.020 4.61 Mẫu sấy 50 0.702 0.645 87.50 25 0.843 0.600 48.68 đồng khô 10 0.670 0.367 33.55 0.561 0.203 21.49 0.501 0.109 14.04 Mẫu sấy 50 0.342 0.429 0.377 84.80 25 0.434 0.278 54.39 phun 10 0.422 0.134 15.79 0.374 0.71 11.40 0.352 0.018 2.34 3.1.9 Mẫu chiết cồn sau loại cồn khỏi dịch chiết Dịch chiết Cồn 80% OD540nm OD1 OD2 0.407 0.567 88 Phạm Thị Thùy Nhung % kìm hãm OD3 0.331 42.01 Viện CNSH& TP Chiết cồn→loại cồn Chiết nước cất Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 0.614 0.645 0.363 0.390 38.33 37.34 3.1.10 Mức độ kìm hãm nồng độ cồn α-amylase Trong phương pháp tách chiết (PP3) dung môi tách chiết cồn 80%, nồng độ cao có ảnh hưởng đến hoạt tính thủy phân enzyme, nên nghiên cứu tiến hành nhằm loại trừ yếu tố gây biến tính cồn enzyme Quá trình chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu thể rõ mục 2.6 A1 0.419 50% 60% 70% 80% 90% 0.396 0.376 0.352 0.35 0.348 Qua bảng ta thấy cồn có khả kìm hãm α-amylase, mức độ kìm hãm cồn enzyme tụy tạng cao 16.46% dịch chiết cồn ĐSLM Vậy mẫu ĐSLM chiết với cồn 80% cần trừ % kìm hãm cồn α-amylase 3.2 Nghiên cứu khả kìm hãm α-glucosidase từ dịch chiết ĐSLM 3.2.1 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết Tỷ lệ chiết 1:02 1:04 1:06 1:08 1:10 Giá trị OD 405nm A1 A2 A3 0.700 1.043 0.949 0.96 0.766 0.783 0.571 0.76 0.502 0.615 0.347 Hệ số pha Chiết nước loãng (lần) 3 3 46.29 16.86 9.14 -10.57 -14.86 3.2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ than hoạt tính đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase Tỷ lệ than (%) 0.2 0.4 0.6 0.8 Giá trị OD 405nm A1 A2 A3 0.345 0.525 0.256 0.374 0.099 0.299 0.045 0.268 0.020 89 Phạm Thị Thùy Nhung Hoạt tính kìm hãm (%) 22.03 20.29 26.37 28.12 Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 1.0 0.276 0.014 24.05 0.0 2.424* 2.211** 38.26 Mẫu: *, ** mẫu pha loãng lần trước đo, có giá trị tương đương là: B1=0.808; B2= 0.737 3.2.4 Khả kìm hãm α-glucosidase dịch chiết ĐSLM mẫu lọc qua màng lọc Tỷ lệ chiết 1:2 1:2 1:6 1:6 Điều kiện Gía trị OD 405nm A1 A2 A3 xử lý Qua màng 0.345 0.930 0.872 Không lọc 0.345 0.941 0.888 Qua màng 0.345 0.651 0.545 Không lọc 0.345 0.685 0.585 Hoạt tính kìm hãm (%) 32.75 38.55 7.83 13.04 Mẫu chiết 1:2, thí nghiệm B1 B2 mẫu pha loãng lần trước đo Mẫu B1 B2 pha lần trước đo 3.2.5 Đánh giá khả kìm hãm α-glucosidase mẫu ĐSLM sau sấy Mẫu phản Tỷ lệ pha Giá trị OD 540nm A1 A2 A3 ứng (mg/ml) Mẫu 40 1.283 0.157 0.099 22 1.283 0.200 0.099 Acarbose 1.283 0.328 0.052 0.790 0.480 0.095 0.8 0.790 0.463 0.052 Mẫu 1000C 50 1.283 7.301 6.734 25 1.283 4.080 3.192 10 1.283 2.580 1.338 Mẫu 80 C 50 1.283 0.974 0.732 Mẫu sấy 50 1.283 1.880 1.262 25 1.283 1.422 0.640 đồng khô 10 1.283 1.148 0.273 1.283 1.096 0.158 1.283 1.223 0.077 Mẫu sấy 50 0.853 2.934 2.43 phun 90 Phạm Thị Thùy Nhung Hoạt tính kìm hãm (%) 95.48 91.43 78.49 51.27 47.97 45.18 18.64 12.06 24.55 51.83 39.05 31.80 26.89 10.68 40.91 Viện CNSH& TP 25 10 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 0.853 0.853 0.853 0.853 1.808 1.127 0.989 0.82 1.22 0.504 0.263 0.074 31.07 26.96 14.89 12.54 Chú thích giá trị tính toán: Mẫu sấy Mẫu sấy 1000C Mẫu sấy 800C Mẫu sấy đông khô Mẫu sấy phun Tỷ lệ pha Số lần pha Giá trị OD sau pha A2 A3 (mg/ml) loãng (lần) 50 1.043 0.962 25 1.078 0.798 10 0.860 0.446 50 0.974 0.732 50 0.940 0.631 25 0.711 0.320 50 0.978 0.81 25 0.904 0.61 3.2.6 Mức độ kìm hãm nồng độ cồn alpha-glucosidase Tỷ lệ cồn pha (%) Nước cất (0.0 cồn) Cồn 50 Cồn 60 Cồn 70 Cồn 80 Cồn 90 Giá trị OD 405nm 0.354 0.012 0.007 0.006 0.004 0.000 Hoạt tính kìm hãm (%) 96.61 98.02 98.30 98.87 100.00 Kết bảng cho thấy cồn hoạt tính kìm hãm α-glucosidase tới (96 100%), riêng mẫu ĐSLM chiết với cồn tiến hành nghiên cứu cho kết không đáng tin cậy 3.2.7 Mẫu touchi chiết cồn loại cồn khỏi dịch Mẫu chiết Giá trị OD 405nm A1 A2 A3 91 Phạm Thị Thùy Nhung Hoạt tính kìm hãm (%) Viện CNSH& TP Cồn 80% Dịch loại cồn Chiết nước Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 0.735 0.377 1.043 1.300 92 Phạm Thị Thùy Nhung 0.377 0.373 0.63 100.00 8.84 8.84 Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật HÌNH ẢNH QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY, LÊN MEN, Ủ VÀ SẤY Đậu sau hấp chín Đậu sau lên mốc Quá trình ủ 50o C 93 Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật 94 Phạm Thị Thùy Nhung Viện CNSH& TP Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Sản phẩm sau ủ ĐSLM sau sấy 95 Phạm Thị Thùy Nhung