PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN F.VIII GÂY BỆNH HEMOPHILLIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR Chủ nhiệm đề tài: ThS Bùi Thị Minh Phượng Giảng viên môn Hóa sinh Trường Đại học Y Dược Thái Bình MỤC LỤC MỤC LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .2 DANH MỤC BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu .2 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu hóa chất 2.3 Phương pháp kỹ thuật nghiên cứu .2 2.3.1 Quy trình lấy mẫu 2.3.2 Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi 2.3.3 Xác định đột biến gen F8 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 3.2 Tỷ lệ phát đột biến 3.2.1 Tỷ lệ bệnh nhân theo kết phát đột biến .4 3.2.2 Tỷ lệ đột biến theo thể bệnh nhóm phát nhóm không phát 3.3 Kết phát dạng đột biến gen F8 3.3.1 Kết xác định đột biến đảo đoạn 3.3.2 Kết phát đột biến exon phản ứng PCR 3.3.3 Kết phát đột biến phương pháp giải trình tự 3.4 Mối liên quan thể bệnh đột biến khác bệnh nhân hemophillia A 10 3.4.1 Tỷ lệ dạng đột biến phát bệnh nhân hemophillia A 10 3.4.2 Tỷ lệ dạng đột biến thể bệnh 11 3.4.3 Tỷ lệ đột biến bệnh nhân hemophilia A thể nặng .11 CHƯƠNG 12 BÀN LUẬN 12 4.1 Đặc điểm chung đối tượng .12 4.2 Tỷ lệ phát đột biến .12 4.2.1 Tỷ lệ bệnh nhân theo kết phát đột biến 12 4.2.2 Các dạng đột biến gây bệnh hemophillia A Việt Nam .12 4.3 Mối liên quan thể bệnh đột biến khác bệnh nhân hemophillia A 14 KẾT LUẬN 15 KIẾN NGHỊ 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ bệnh nhân chia theo thể bệnh Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ đột biến theo thể bệnh nhóm phát nhóm chưa phát .4 Biểu đồ 3.3: Các dạng đột biến phát bệnh nhân hemophilia A 10 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ dạng đột biến thể bệnh 11 Biểu đồ 3.5: Tỷ lệ đột biến bệnh nhân Hemophillia A thể nặng 11 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh hemophilia A hay gọi bệnh rối loạn đông máu Đây bệnh di truyền gen lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X, bệnh gây nên thiếu hụt hay bất thường chức yếu tố VIII Việt Nam nước có tỷ lệ mắc bệnh hemophillia cộng đồng cao Theo nghiên cứu Đỗ Trung Phấn năm 1996 tỷ lệ mắc bệnh khoảng 25 – 60/1.000.000 người Hiện có khoảng 6000 bệnh nhân hemophilia Việt Nam có 30% phát điều trị, phương pháp điều trị chủ yếu sử dụng yếu tố VIII máu toàn phần (truyền trực tiếp tách chiết) tốn hiệu không cao, đặc biệt có nguy cao bệnh lây truyền qua đường máu Trên giới, nhà khoa học phân tích gen bệnh nhân hemophilia A nhiều dạng đột biến gen yếu tố VIII (F8) công bố Các nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác gây kiểu hình đặc trưng khác Bệnh nhân hemophilia A thể nặng thường gặp dạng đột biến đảo đoạn Itron 22 (chiếm 45-50%), đột biến điểm chiếm đa số bệnh nhân hemophilia A thể nhẹ trung bình (chiếm 90-95%).Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu bệnh hemophilia A chủ yếu nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, đánh giá tỷ lệ mắc bệnh hay nghiên cứu đánh giá hiệu điều trị bệnh chế phẩm thay Chưa có công trình nghiên cứu toàn diện đột biến gen mã hóa yếu tố VIII người Việt Nam Với tiến kỹ thuật sinh học phân tử, nhà khoa học phân tích DNA người bệnh để xác định xác tổn thương gen gây bệnh hemophilia A, kiểm soát bệnh tốt nhờ phát người phụ nữ mang gen bệnh tư vấn di truyền trước hôn nhân, tăng hiệu việc phòng ngừa bệnh tật đông thời nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng Mục tiêu đề tài Xác định số đột biến phổ biến gen F8 gây bệnh hemophilia A Mối liên quan thể bệnh đột biến gây bệnh hemophilia A Việt Nam 2 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Nhóm đối chứng: gồm 20 người (10 nam, 10 nữ) khỏe mạnh, tiền sử gia đình người mắc bệnh di truyền Nhóm nghiên cứu: 60 bệnh nhân chẩn đoán xác định hemophillia A viện Nhi Trung Uơng viện huyết học truyền máu Trung Ương Tiêu chuẩn lựa chọn: - Lâm sàng: + Chảy máu: Chảy máu khó cầm sau chấn thương, va chạm hay chảy máu tự nhiên + Vị trí: Chảy máu khớp, số vị trí khác + Tính chất: Thường chảy máu tái phát + Tiền sử: có tiền sử chảy máu kéo dài gia đình có người thân bị chảy máu khó cầm - Cận lâm sàng: + APTT kéo dài + Định lượng yếu tố FVIII giảm 30% + Thời gian máu chảy bình thường + Số lượng tiểu cầu độ tập trung tiểu cầu bình thường 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu hóa chất 2.3 Phương pháp kỹ thuật nghiên cứu Đối với bệnh nhân thể nặng, xác định tượng đảo đoạn phương pháp Inversion PCR Không có đột biến đảo đoạn Intron 22, xác định đảo đoạn Itron phương pháp Multiplex PCR Nếu không xác định ta khuyếch đại toàn 26 exon để tìm đột biến exon Nếu đột biến, phân tích đột biến điểm phương pháp giải trình tự gen Đối với bệnh nhân thể vừa nhẹ sử dụng phương pháp PCR để xác định đột biến exon, không đột biến giải trình tự gen trực tiếp để phát dạng đột biến điểm 3 2.3.1 Quy trình lấy mẫu Bệnh nhân chẩn đoán hemophilia A lấy 5ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đông EDTA với hàm lượng 1,5mg/mL Quy trình lấy máu đảm bảo vô trùng tuyệt đối 2.3.2 Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi 2.3.3 Xác định đột biến gen F8 2.3.3.1 Xác định đột biến đảo đoạn Itron 22 kỹ thuật Inversion PCR Kỹ thuật Inversion PCR (I-PCR) gồm bước: (1) Cắt DNA enzyme BclI, (2) Nối T4 ligate, (3) Khuyếch đại phản ứng multiplex PCR Phương pháp I-PCR có ưu điểm dễ tiến hành enzyme BclI tác dụng đặc hiệu nên sản phẩm cắt enzyme có tính đặc hiệu cao Sản phẩm PCR khuyêchs đại dễ dàng thời gian khoảng 30 phút đoạn DNA có kích thước ngắn ( 487 559pb) Như xét nghiệm phân tích gen tiến hành nhanh chóng , kết thu có độ tin cậy cao, dễ thực 2.3.3.2 Phát đột biến đảo đoạn Itron kỹ thuật multiplex PCR Kỹ thuật multiplex PCR: Thiết kế hai phản ứng multiplex PCR phát bệnh nhân bị đột biến: phản ứng có chứa cặp mồi đặc hiệu cho int1h1cộng với mồi đặc hiệu cho chuỗi in1h2, phản ứng chứa cặp mồi đặc hiệu int 1h2 cộng với mồi đặc hiệu cho int1h1 Dựa vào kích thước khác đoạn DNA sau điện di để phat đột biến Trường hợp đột biến đảo đoạn itron1, phản ứng có mồi int1h1 bắt cặp cho kích thước 190bp, phản ứng có mồi đặc hiệu cho int1h2 bắt cặp cho kích thước 1191bp Nếu đột biến xảy ra, mồi int1h1 bắt cặp với int1h2 hai phản ứng cho kích thước 1323bp 1776bp tương ứng phản ứng phản ứng 2.3.3.3 Phat đột biến exon kỹ thuật PCR 2.3.3.4 Phát đột biến điểm kỹ thuật giải trình tự gen 4 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ bệnh nhân chia theo thể bệnh Nhận xét: 45/60 bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng thể nặng chiếm tỷ lệ 75%, 10/60 bệnh nhân thể trung bình chiếm tỷ lệ 16,67%, 5/60 bệnh nhân thể nhẹ chiếm tỷ lệ 8,33% 3.2 Tỷ lệ phát đột biến 3.2.1 Tỷ lệ bệnh nhân theo kết phát đột biến Nghiên cứu phát 54/60 trường hợp bệnh nhân có đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A chiếm tỷ lệ 90% Số bệnh nhân chưa phát 6/60 chiếm tỷ lệ 10% 3.2.2 Tỷ lệ đột biến theo thể bệnh nhóm phát nhóm không phát Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ đột biến theo thể bệnh nhóm phát nhóm chưa phát Nhận xét - Thể nặng: 41/45 bệnh nhân phát đột biến chiếm tỷ lệ 91.1% 4/45 bệnh nhân không phát đột biến chiếm tỷ lệ 8.9% - Thể trung bình: 9/10 bệnh nhân phát đột biến chiếm tỷ lệ 90% 1/10 bệnh nhân không phát đột biến chiếm tỷ lêh 10% - Thể nhẹ: 4/5 bệnh nhân phát đột biến chiếm tỷ lệ 80%, 1/5 bệnh nhân không phát đột biến chiếm 20% 3.3 Kết phát dạng đột biến gen F8 3.3.1 Kết xác định đột biến đảo đoạn 3.3.1.1 Kết xác định đột biến đảo đoạn Itron 22 kỹ thuật Inversion PCR 45 bệnh nhân hemophilia A chẩn đoán lâm sàng thể nặng xét nghiệm đột biến đảo đoạn Itron 22 phương pháp Inversion PCR Kết có 19/45 bệnh nhân có đột biến đảo đoạn chiếm tỷ lệ 42.2% Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR xác định đột biến đảo đoạn intron 22 Nhận xét: DNA người bình thường mẫu đối chứng dương (+) khuếch đại phản ứng multiplex PCR có băng kích thước tương ứng 487 bp Nếu đột biến xảy ra, khuếch đại cho đoạn kích thước 559 bp Như vậy, vị trí giếng tương ứng với bệnh nhân mã số HA33, HA38 đảo đoạn intron 22 có vạch DNA kích thước 487 bp Ở giếng mã số HA02, HA07, HA12, HA20, HA55 bệnh nhân hemophilia A có đột biến đảo đoạn intron 22 (hình 3.1) điện di có vạch DNA kích thước 559bp 6 3.3.1.2 Xác định đột biến đảo đoạn intron phương pháp Multiplex PCR Có 19/45 bệnh nhân hemophilia A thể nặng bị đột biến đảo đoạn intron 22, 26/45 bệnh nhân hemophilia A thể nặng lại tiếp tục sàng lọc đột biến đảo đoạn intron theo phương phápmultiplex PCR Kết 26 bệnh nhân không bị đột biến đảo đoạn intron Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR xác định đảo đoạn intron Nhận xét: Trong kết hình 3.3, phản ứng multiplex PCR khuếch đại đoạn int1h1(P1) cho đoạn DNA kích thước 1908bp chứng tỏ cặp mồi 9F 9cR thiết kế cho đoạn int1h1 bắt cặp với Các phản ứng khuếch đại đoạn int1h2 (P2) cho kích thước 1191bp chứng tỏ có cặp mồi int1h-2R int1h-2F đặc hiệu cho đoạn int1h2 bắt cặp với Như vậy, đột biến intron bệnh nhân mã số HA15, HA46, HA45 HA24 3.3.2 Kết phát đột biến exon phản ứng PCR Nghiên cứu có bệnh nhân đột biến exon bao gồm HA38, HA51, HA55, - Đột biến exon exon bệnh nhân HA51: Hình 3.3 Kết PCR xác định đột biến exon bệnh nhân HA51 Nhận xét: Bệnh nhân mã số HA64 sau khuếch đại toàn 38 cặp mồi với mẫu đối chứng âm đối chứng dương phát vị trí exon 8, exon bệnh nhân vạch DNA tất exon lại lên vạch DNA tương ứng với mẫu đối chứng dương Điều chứng tỏ bệnh nhân bị đột biến đoạn exon exon 3.3.3 Kết phát đột biến phương pháp giải trình tự 3.3.3.1 Đột biến đoạn nucleotid Đột biến 15 nucleotid Hình 3.4 Hình ảnh đột biến đoạn 15 nucleotid bệnh nhân HA46 Nhận xét Bệnh nhân mã số HA46 thể nặng, không phát thấy đảo đoạn intron 22, intron Khuếch đại 38 cặp mồi lên vạch căng, rõ nét Tinh DNA phản ứng khuếch đại giải trình tự, sau so sánh với trình tự người bình thường Kết exon phát thấy đột biến 15 nucleotid vị trí c.435450 Khi kiểm tra thay đổi acid amin đột biến gây ra, thấy vị trí protein từ 135 đến 139 bị acid amin Tyrosin, Asparagin, Threonin, Valin, Valin (p.135139delTyr-Val) 8 3.3.3.2 Đột biến sai nghĩa c.6545 c.6545G>A p.R2182H( Arg 2182 His ) Người bình thường Bệnh nhân HA59 2182 Hình 3.5 Hình ảnh đột biến bệnh nhân mã số HA59 Nhận xét: Hình ảnh giải trình tự bệnh nhân mã số HA59 cho thấy: có đột biến thay nucleotid G thành nucleotid A (G>A) exon 23 gen F8 So sánh với trình tự Genebank thấy exon 23 vị trí c.6545 G>A, dẫn đến thay đổi acid amin vị trí p.2182 protein gen F8 từ Arginin thành Histidin (p.Arg2182His) 3.3.3.3 Đột biến thêm nucleotid Đột biến thêm nucleotid C: Hình 3.6 Hình ảnh đột biến thêm nucleotid C bệnh nhân HA03 Nhận xét: Hình ảnh giải trình tự cho thấy bệnh nhân mã số HA03 có đột biến thêm nucleotid C exon 14 gen F8 Kiểm tra trình tự Genebank xác định thay đổi exon 14 c.2777 insC, đột biến gây lệch khung dịch mã toàn acid amin lại từ vị trí p.927(p.Lys927ins) 3.3.3.4 Đột biến nucleotid - Đột biến nucleotid A Hình 3.7 Hình ảnh đột biến nucleotid bệnh nhân HA01 Nhận xét: Hình ảnh giải trình tự cho thấy bệnh nhân HA01 có đột biến nucleotid A exon 14 gen F8 So sánh với trình tự Genebank thấy nucleotid A vị c.3388, dẫn đến protein yếu tố VIII bị lệch khung dịch mã toàn acid amin từ vị trí p.1130 (p.Arg1130del) 3.3.3.5 Đột biến vô nghĩa Hình 3.8 Hình ảnh đột biến tạo stop codon bệnh nhân HA33 10 Nhận xét: Bệnh nhân mã số HA33 sau giải trình tự kiểm tra vị trí đột biến cho thấy: đột biến thay nucleotid T nucleotid A vị trí 6425 So sánh với trình tự Genebank cho thấy: đột biến làm thay đổi acid amin Leucin tạo thành stop codon gây dừng đột ngột trình phiên mã protein (p.Leu2142Stop) 3.3.3.6 Đột biến vị trí nối Hình 3.9 Hình ảnh đột biến vị trí nối exon/intron bệnh nhân HA45 Nhận xét: Với thay đổi bất thường gần vị trí đầu cuối exon vị trí nối exon intron 13 3.4 Mối liên quan thể bệnh đột biến khác bệnh nhân hemophillia A 3.4.1 Tỷ lệ dạng đột biến phát bệnh nhân hemophillia A Biểu đồ 3.3: Các dạng đột biến phát bệnh nhân hemophilia A Nhận xét: Trong 54 bệnh nhân phát đột biến có: - Đột biến đảo đoạn Intron 22 chiếm tỷ lệ cao nhất: 19/54 ( 35.2%) - Đột biến sai nghĩa đứng thứ 2: 11/54 (20.4%) - Đột biến nucleotid, đột biến vô nghĩa, đột biến thêm nucleotid đứng thứ ba, loại 6/54 ( 11.1%) - Chiêm tỷ lệ thấp đột biến vị trí nối exon-itron, đột biến đoạn lớn: loại 3/54 ( 5.55%) 11 3.4.2 Tỷ lệ dạng đột biến thể bệnh Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ dạng đột biến thể bệnh Nhận xét: - Đột biến đảo đoạn Itron 22: gặp bệnh nhân thể nặng: 19/54 ( 35.2%) - Đột biến điểm gặp chủ yếu bệnh nhân thể trung bình 90%, thể nhẹ 80% 3.4.3 Tỷ lệ đột biến bệnh nhân hemophilia A thể nặng Biểu đồ 3.5: Tỷ lệ đột biến bệnh nhân Hemophillia A thể nặng Nhận xét: Bệnh nhân hemophilia A thể nặng - 19/45 ( 42.2%) đột biến đảo đoạn Itron22 - 19/45 (42.2%) đột biến điểm - 3/45 ( 6.7%) đột biến đoạn lớn - 4/45 ( 8.9%) chưa phát đột biến 12 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm chung đối tượng 4.2 Tỷ lệ phát đột biến 4.2.1 Tỷ lệ bệnh nhân theo kết phát đột biến Trong nghiên cứu này, xác định đột biến gen F8 thực 60 bệnh nhân chẩn đoán hemophilia A quan hệ huyết thống :Có 54 trường hợp phát đột biến chiếm 90%, 6(10%) trường hợp chưa phát đột biến Tỷ lệ chưa phát đột biến cao tác giả khác công bố 2-7%, nguyên nhân chưa phối hợp phương pháp khác để chẩn đoán vị trí đột biến vùng itron, chưa xác định đột biến lặp đoạn DNA phương pháp MLPA… Tuy nhiên so với tác giả sử dụng phương pháp giải trình tự gen đơn tỷ lệ phát đột biến tương đối cao, phù hợp Số bệnh nhân phát đột biến thể bệnh là: Thể nặng 91.1%, thể trung bình 90%, thể nhẹ 80% So với tỷ lệ phát đột biến tác giả Santacroce cộng thực 1296 bệnh nhân hemophilia A Italia 874 (89%), 146(84%), 133(94%) tương ứng bệnh nhận thể nặng, trung bình, nhẹ [3] Theo tác giả Bogdanova sử dụng phương pháp giải trình tự phát đột biến cho kết xác dịnhđược đột biến thể là: 100% thể nặng, 96% thể trung bình 88% thể nhẹ [7] Tỉ lệ dạng đột biến khác nghiên cứu cho thấy hay gặp đảo đoạn intron 22 (35.2%), tiếp đến dạng đột biến sai nghĩa 20.4%, đột biến /thêm nucleotid đột biến vô nghĩa có tỉ lệ 11.1%; đột biến vị trí nối đột biến đoạn lớn có tỉ lệ 5.55% số bệnh nhân phát đột biến 4.2.2 Các dạng đột biến gây bệnh hemophillia A Việt Nam Chúng xác định đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật I-PCR, có 19 bệnh nhân thể nặng chẩn đoán đảo đoạn itron22 tổng số 45 bệnh nhân thể nặng chiếm 42.2% Tỷ lệ tương tự với với tỷ lệ đột biến đảo đoạn intron 22 tác giả công bố 42-50% nhóm bệnh hemophillia A thể nặng[6] Ở Đài Loan tỷ lệ 45.1% [4], 42.5 -44.25% Ấn Độ 13 Trong nghiên cứu có 26 bệnh nhân hemophillia A thể nặng không bị đột biến đảo đoạn intron 22 tổng số 45 bệnh nhân thể nặng, tiến hành kiểm tra phát đột biến đảo đoạn intron kỹ thuât multiplex PCR cho thấy trường hợp có đột biến đảo đoạn intron1 Chúng cho với kết luận âm tính cỡ mẫu chưa đủ lớn để phát đảo đoạn intron1 Trong nghiên cứu Andrikovics cho thấy vắng mặt đảo đoạn intron nghiên cứu 104 trường hợp hemophilia A Hungary Ngoài ra, nghiên cứu gần cho thấy tỷ lệ tổng thể đảo đoạn intron thấp 1% [2] Đặc biệt, tỉ lệ khác chủng tộc Nghiên cứu bệnh nhân hemophilia A Ấn Độ thấy tỉ lệ đột biến intron 2,7% , tương tự nghiên cứu Nam Phi Các đột biến xác định bệnh nhân da đen mà không tìm thấy đột biến đảo đoạn intron số bệnh nhân da trắng Tuy nhiên, đảo đoạn intron đột biến quan trọng cần sàng lọc, tỉ lệ xác định quần thể người da trắng thấp Sau thu DNA có chất lượng tốt, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR với 38 cặp mồi mồi đặc cho 26 exon gen F8 Với kích thước lớn exon 14 cần cặp mồi exon 26 cần cặp mồi để giải trình tự toàn exon Có bệnh nhân đột biến exon khuyếch đại phương pháp PCR đơn thuần: H38, H51, H55 Trong nghiên cứu này, phát đột biến từ nucleotid bệnh nhân HA01, HA39 , 15 nucleotid HA46, đột biến thêm nucleotid A, nucleotid C gặp bệnh nhân HA11, HA24 Đột biến sai nghĩa đa dạng hay gặp bệnh nhân hemophilia A thể nhẹ trung bình: HA 59,HA29 Để xác định đột biến vị trí nối intron exon đòi hỏi phải có trình tự nucleotid đầu 3'- 5' vùng exon-intron trình tự điểm dễ bị đột biến nằm cách 18-40 bp đầu 3' Hầu hết đột biến vị trí nối gây bệnh, 10% đến 15% đột biến gây bệnh đột biến điểm vị trí nối Để khẳng định chắn đột biến vị trí ranh giới intron exon đột biến vị trí nối cần sử dụng phương pháp RT-PCR giải trình tự mRNA Tuy nhiên nghiên cứu chúng tôi, đột biến vị trí nối bệnh nhân mã số HA45, HA49, HA43đều công bố nên hoàn toàn khẳng định chắn mà không cần kiểm tra lại mRNA 14 4.3 Mối liên quan thể bệnh đột biến khác bệnh nhân hemophillia A Nghiên cứu xác nhận tương quan tỉ lệ dạng đột biến bệnh nhân hemophilia A Các loại đột biến tìm thấy tỉ lệ phù hợp với kết báo cáo công bố tác giả Repesse, Jochen Graw, Adoracion Vencela, Rosetti Bảng 4.1 So sánh dạng đột biến với nghiên cứu khác giới Pháp[9] 120 BN Inv22 Sai nghĩa Vị trí nối Vô nghĩa Thêm nucleotid Mất nucleotid Mất đoạn lớn Đức[5] 845 BN 46,0% 15.0% 7.0% 13.0% 7.0% 10.0% 2.0% 35.7% 38.2% 2.6% 9.3% 2.6% 7.5% 3.0% Tây Ban Nha Argentina Nghiên cứu [1] [8] 267 BN 43% 34% 2.6% 3.7% 2.0% 7.8% 1.0% 260 BN 44% 12.2% 3.7% 10.2% 1.9% 15.9% 10.2% 60 BN 35,2% 20.4% 5.55% 11.1% 11.1% 11.1% 5.55% Về tỉ lệ dạng đột biến thể bệnh: nghiên cứu hay gặp bệnh nhân hemophilia A thể nặng đảo đoạn intron 22 (35.2%) Đột biến sai nghĩa gặp nhiều bệnh nhân hemophilia A thể trung bình 47.7% thể nhẹ 70.4%, đột biến đoạn lớn gặp chủ yếu bệnh nhân thể nặng ( 5.55%) Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Margaglione, Becker khẳng định tỉ lệ đột biến sai nghĩa hay gặp hemophilia A thể trung bình thể nhẹ , 15 KẾT LUẬN Nghiên cứu phát đột biến gen F8 60 bệnh nhân sử dụng kết hợp phương pháp khác nhau, rút kết luận sau: Phát đột biến gen F8 bệnh nhân hemophilia A Việt Nam - Tỷ lệ phát đột biến 90% (54/60 bệnh nhân), tỉ lệ phát đột biến thể nặng 91.1%, thể trung bình 90% thể nhẹ 80% - Các dạng đột biến phát bao gồm: đảo đoạn intron 22 35,2% (19/54 bệnh nhân), đột biến sai nghĩa 20,4% (11/54 bệnh nhân), đột biến nucleotid 11.1% (6/54 bệnh nhân), đột biến vô nghĩa 11.1% (6/54 bệnh nhân), đột biến thêm nucleotid 11.1% (6/54 bệnh nhân), đột biến vị trí nối exon-intron 5,55% (3/54 bệnh nhân), đột biến đoạn lớn 5.55% (3/54 bệnh nhân) Tỷ lệ đột biến phát với thể lâm sàng - Thể nặng: phát đột biến đảo đoạn intron 22 cao chiếm tỉ lệ 42.2%, đột biến đoạn lớn 6.7%, đột biến điểm 42.2% - Thể trung bình, thể nhẹ đột biến đảo đoạn, gặp đột biến điểm 90% thể trung bình, 80% thể nhẹ - Chưa phát đột biến đảo đoạn intron1 16 KIẾN NGHỊ Thiết lập quản lý sở liệu bệnh nhân người mang gen bệnh hemophilia A Tư vấn di truyền trước hôn nhân chẩn đoán trước sinh cho người mang gen bệnh trước - trình mang thai TÀI LIỆU THAM KHẢO Adoración Venceslá, María Angeles Corral-Rodríguez, Manel Baena, Mónica Cornet, Montserrat Domènech, Montserrat Baiget, Pablo Fuentes-Prior, Eduardo F, Tizzano (2008) Identification of 31 novel mutations in the F8 gene in Spanish hemophilia A patients: structural analysis of 20 sai nghĩa mutations suggests new intermolecular binding sites Blood, 111(7), 34683478 Brockway WI, Olson ID, Fass DN, Bowie JW, Mann KG (1977) Purification of porcine and human ristocetin-Willebrand factor LabClin Med, 89, 12781294 Castaman G, Margaglione M, Morfini M, Rocino A, Santagostino E, Tagariello G, Mannucci PM (2008) The Italian AICE-Genetics hemophilia A database:results and correlation with clinical phenotype Haematologica 93(5), 722-728 Chang SP, Ma GC, Chen M, Kuo SJ, Chang CS, Shen MC (2008) The spectrum of the factor (F8) defects in Taiwanese patients with haemophilia A Haemophilia, 14, 787-795 Hans Hermann, Brackmann, Jochen Graw, Johannes Oldenburg (2005) Heamophilia A: from mutation analysis to new therapies Nature reviews Genetics, 6, 488-501 Kazazian HH, Jr Lakich D, Antonarakis SE, Gitschier J (1993) Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A Nat Genet, 5, 236-241 Markoff A, Bogdanova N, Pollmann H (2005) Spectrum of molecular defects and mutation detection rate in patients with severe hemophilia A Hum Mutat, 26, 249-254 Rossetti LC, Szurkalo I, Radic CP (2013) Factor VIII genotype characterization of haemophilia A affected patiens with transient and permanent inhibitors: a comprehensive Argentine study of inhibitor risks Haematologica, 19, 115-118 Repesse Y, Slaoui M, Ferrandis M, Gautier P, Costa C, Lavergne JM, Derlon AB (2007) Factor VIII (FVIII) gene mutations in 120 patients with hemophilia A: detection of 26 novel mutations and correlation with FVIII inhibitor development Thrombosis and Haemostasis, 5, 1469–1476 10 Schwaab R, Becker J, Möller-Taube A, Schwaab U, Schmidt W, Brackmann HH, Grimm T, Olek K, Oldenburg J (1996) Characterization of the factor VIII defect in 147 patients with sporadic hemophilia A: family studies indicate a mutation type-ependent sex ratio of mutation frequencie Am J Hum Genet, 58(4), 657-670 11 Yang T, Liu W, Zhao W, Chase GA (2007) Accounting for Genotyping Errors in Tagging SNP Selection Annals of Human Genetics, 71(4), 467-479