1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cường insulin bẩm sinh bệnh gây hạ đường huyết nặng kéo dài trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Bệnh có tỷ lệ mắc chung cộng đồng khác từ 1/40.000-1/50.000, chí phổ biến tới 1/2.500, tỷ lệ cao cộng đồng có truyền thống kết hôn huyết thống [1] Ở Việt Nam, cường insulin bẩm sinh bệnh cảnh thường gặp cấp cứu hồi sức, giai đoạn từ 1/1/2009-15/4/2012 có tới 27 trường hợp [2] Đây bệnh lý cấp cứu, việc chẩn đoán sớm điều trị kịp thời vô quan trọng nhằm hạn chế tổn thương não di chứng thần kinh Ở giai đoạn sơ sinh, bệnh hạ đường huyết cường insulin gây thương tổn não nặng, biểu hôn mê trạng thái co giật Ở trẻ lớn, hạ đường máu thường trầm trọng gây thương tổn não Bên cạnh di chứng chậm phát triển vận động tinh thần, động kinh, bại não gặp, đặc biệt trẻ biểu sớm sau sinh chẩn đoán muộn Chẩn đoán cường insulin bẩm sinh dựa vào biểu lâm sàng xét nghiệm đường huyết thấp, nồng độ insulin máu cao, cần xét nghiệm phân tích gen để phát đột biến, từ có định điều trị nội khoa hay phẫu thuật cắt tụy Các đột biến gen ABCC8 KCNJ11 xác định nguyên nhân phổ biến bệnh Những đột biến xác định 85% bệnh nhân trải qua phẫu thuật tụy [2] Nguyên nhân phổ biến nặng cường insulin bẩm sinh đột biến lặn bất hoạt kênh K-ATP màng tế bào beta tiểu đảo tụy Ngày nhờ phát triển công nghệ đặc biệt sinh học phân tử đóng vai trò quan trọng giúp cho chẩn đoán đột biến gen gây bệnh dễ dàng xác, từ chẩn đoán sớm định hướng điều trị kịp thời Việc ứng dụng rộng rãi tiến lĩnh vực vào y học mang tới bước tiến giúp chẩn đoán xác hơn, đặc biệt bệnh liên quan 2 đến vật liệu di truyền Một ứng dụng tiêu biểu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm khuếch đại đoạn gen kỹ thuật giải trình tự gen giúp phát thứ tự xếp loại nucleotid phân tử DNA, từ phát sai khác gen Trên sở đó, đề tài: “Xác định đột biến gen ABCC8 bệnh nhân cường insulin” thực với mục tiêu: “Xây dựng quy trình xác định đột biến gen ABCC8 bệnh nhân cường insulin” CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh cường insulin bẩm sinh 1.1.1 Giới thiệu chung bệnh cường insulin bẩm sinh Hạ đường huyết kéo dài nhũ nhi (PHHI), có tên gọi khác cường insulin bẩm sinh, cường insulin gia đình sản tế bào đảo tụy nguyên phát (nesidioblastosis) Đây nguyên nhân hay gặp gây hạ đường huyết kéo dài trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Bệnh đặc trưng tiết 3 insulin không thích hợp không kiểm soát tế bào beta tuyến tụy, tiết insulin không quy định mức độ đường máu bình thường, biểu tăng tiết insulin mức từ tiểu đảo tụy Langerhans gây hạ đường huyết nặng kéo dài Bệnh nhân hạ đường huyết cường insulin phải chẩn đoán kịp thời điều trị sớm để ngăn chặn co giật di chứng thần kinh Hạ đường huyết kéo dài nồng độ không thích hợp cao insulin lưu hành phát chẩn đoán Hàm lượng acid béo tự (FFAs) ketones (Beta–hydroxybutyrate, acetoacetate) thấp [3],[27] Sinh lý bệnh: Bình thường nồng độ insulin glucose máu tỷ lệ với nhau, glucose máu tăng insulin máu tăng ngược lại.Trong bệnh cường insulin bẩm sinh có rối loạn cân động glucose máu insulin máu, gia tăng chế tiết insulin mức cân với glucose làm đứa trẻ bị hạ đường huyết trầm trọng, kéo dài gây hệ lụy sau này,thậm chí gây tử vong nhanh chóng [4] Giải phẫu bệnh lý: Trong bệnh cường insulin bẩm sinh, bất thường cấu trúc mô học tuyến tụy không đồng phân thành dạng sau đây: Quá sản u chỗ tế bào đảo Langerhans chiếm 30-40% trường hợp cường insulin bẩm sinh (Nesidioblastosis) Cường chức tế bào beta lan tỏa chiếm 60-70% trường hợp [5],[6] Ngoài ra, nghiên cứu gần phát thấy dạng không điển hình đặc trưng đảo Langerhans dạng khảm Về di truyền học: Người ta thấy có đột biến tiểu đơn vị kênh K-ATP “nhạy cảm” tế bào beta, kênh giữ vai trò quan trọng việc điều phối chế tiết insulin đột biến xảy tiểu đơn vị thụ thể sulfonylurea màng bào tương ABCC8 (SUR1) KCNJ11 (KIR 6.2) [7] 4 1.1.2 Đặc điểm dịch tễ học Cường insulin bệnh gặp, ảnh hưởng đến nam nữ báo cáo nhiều nước Cường insulin bẩm sinh có tỷ lệ mắc chung cộng đồng khác từ 1/40.000-1/50.000 trẻ sinh sống Nhưng tỷ lệ chiếm 1/2.500 cộng đồng có truyền thống kết hôn huyết thống [8] Tại Hoa Kỳ, cường insulin ước tính xảy 50.000 ca sinh sống Trong hầu xảy khoảng 1/25.000 đến 1/50.000 ca sinh Khoảng 60% trẻ sơ sinh với tình trạng cường insulin phát triển hạ đường huyết tháng sống Thêm 30% chẩn đoán sau năm phần lại sau đó, điều trị sớm ngăn chặn tổn thương não [9] Hạ đường huyết nặng kéo dài dẫn đến tổn thương thần kinh, bệnh nhân có nguy cao co giật, chậm phát triển tâm thần tổn thương não vĩnh viễn Cần có hướng chẩn đoán sớm can thiệp kịp thời tránh di chứng tổn thương hệ thần kinh trung ương trẻ di chứng hạ đường huyết [10] Hạ đường máu cường insulin trẻ sơ sinh chiếm 1,9% [11] Đột biến gen ABCC8 KCNJ11 nguyên nhân phổ biến gây cường insulin bẩm sinh, chiếm 40 - 45% trường hợp (82% số bệnh nhân không đáp ứng với thuốc diazoxide) Trong đó, đột biến xác định xảy gen khác, chiếm - 10% trường hợp Khoảng 45- 55% bệnh nhân có biến đổi liên quan gen chưa biết rõ Trên giới, khoảng 55- 60% trường hợp cường insulin bẩm sinh không đáp ứng với diazoxide có tổn thương khu trú tụy 40- 45% thương tổn lan tỏa toàn tụy [12] 1.1.3 Chẩn đoán điều trị cường insulin bẩm sinh 5 Cần chẩn đoán phân biệt cường insulin bẩm sinh với stress trước sinh gây hạ đường máu cường insulin; hạ đường máu cường insulin thuốc; insulinoma; hội chứng kháng insulin tình trạng tăng insulin [13] Sau chẩn đoán cần thiết bệnh cường insulin bẩm sinh: 1.1.3.1 Lâm sàng cận lâm sàng - Triệu chứng lâm sàng Hạ đường huyết biểu cường insulin bẩm sinh nguy cao xảy co giật thương tổn não cho trẻ Triệu chứng biểu hạ đương máu đa dạng tùy thuộc mức độ hạ đường máu tuổi bệnh nhân, biểu triệu chứng hạ đường huyết phát nhờ xét nghiệm máu thường quy, biểu triệu chứng nặng đe dọa tính mạng hôn mê, co giật hay trạng thái động kinh [14] Trẻ sơ sinh thường có biểu khó chịu, vã mồ hôi, hạ thân nhiệt, buồn ngủ, bú kém, bồn chồn nhịp tim nhanh, có co giật, tím tái, ói mửa, suy hô hấp, hôn mê hạ đường huyết nặng kéo dài Triệu chứng thường gặp hạ đường huyết trẻ lớn người lớn bao gồm cảm giác run rẩy, yếu hay mệt mỏi, lú lẫn mạch nhanh, vã mồ hôi, lo lắng, đói tăng thèm ăn, nhìn chằm chằm lác, thờ ơ, buồn nôn ói mửa, đau đầu; nặng co giật • Giai đoạn sơ sinh Triệu chứng hạ đường huyết xảy sớm vòng 72 sau sinh co giật xuất khoảng 50% bệnh nhân có hạ đường máu nặng Hầu hết trẻ biểu thừa cân so với tuổi thai lúc sinh, trung bình 3,7kg khoảng 20-30% trường hợp sinh mổ đẻ Triệu chứng khác hạ đường máu vận động bất thường run giật, giảm trương lực cơ, tím tái, hạ thân nhiệt chí đe dọa tính mạng Chậm phát triển tinh thần vận động gặp 25 - 50% trường hợp [15] 6 Thay đổi khuôn mặt quan sát được: trán cao, mũi to, phồng sống mũi ngắn, nhân trung phẳng môi mỏng [16] • Giai đoạn trẻ bú mẹ trẻ lớn Khoảng 50% số bệnh nhân cường insulin, hạ đường máu chẩn đoán từ lúc 1đến 20 tháng tuổi, chí muộn Triệu chứng xuất trước tuổi co giật chiếm 50% trường hợp, lơ mơ tình trạng kích thích Triệu chứng biểu trẻ >1 tuổi, điển hình hạ đường máu trẻ tái nhợt, ngất, nhịp tim nhanh, vã mồ hôi, co giật Trẻ có tiền sử có cân nặng cao so với tuổi thai lúc sinh thường gặp, trung bình 3,6kg Mức độ nặng hạ đường máu tùy thuộc vào tuổi xuất hạ đường máu tuổi sơ sinh thường nặng thể khu trú hay lan tỏa [16] - Cận lâm sàng Bình thường nồng độ đường máu lúc đói 70-100mg/dl (hoặc 3,9-5,6 mmol/l) Khi đường máu giảm xuống nồng độ 70mg/dl (hoặc 3,9 mmol/l) người ta gọi hạ đường huyết 2,8mmol/l (50mg/dl) xuất triệu chứng nặng hạ đường huyết [17] Phân biệt bệnh khu trú lan tỏa việc quan trọng chẩn đoán Xét nghiệm di truyền thử nghiệm hữu ích việc xác định cường insulin khu trú, phân tích đột biến gen có liên quan góp phần chẩn đoán định hướng chọn lựa phương pháp điều trị thích hợp Đây tiến chẩn đoán điều trị cường insulin bẩm sinh năm gần  Tiêu chuẩn Hussain K(2008) bao gồm: - Glucose máu hạ nhịn ăn sau ăn (< 2,5- 3mmol/l) - Nồng độ insulin huyết C- peptid không thích hợp (tăng) kèm theo tình trạng hạ đường huyết Insulin định lượng vào thời điểm hạ đường huyết >1mU/l - Tăng glucose máu >2-3mmol/l thời gian 30- 40 phút sau tiêm da tiêm bắp 0,5mg glucagon 7 - Ceton máu ceton niệu không phát thấp, acid béo tự huyết thấp 8mg/kg/phút - Xét nghiệm đường máu < 3mmol/l với điều kiện: + Phát insulin/C- peptid huyết + Thể ceton máu thấp, acid béo tự máu thấp; amoniac máu tăng cao hội chứng cường insulin tăng amoniac máu + Tăng hydroxylbutyrylcarnitine máu 3-hydroyglutarate Những tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán cường insulin bẩm sinh: Glucose, Insulin, Tỷ số Insulin/Glucose MRI tuyến tụy [19] Ngoài ra, test chẩn đoán PE: F- fluoro- L- DOPA positron emission tomography (PET) định cho tất trường hợp cường insulin bẩm sinh kháng với diazoxid để phân biệt thể khu trú với thể lan tỏa [20] 1.1.3.2 Điều trị Hiện nay, bệnh cường insulin bẩm sinh chưa có phác đồ điều trị chuẩn Nhiều tác giả thiên hướng cắt tụy bán phần gần toàn phần (97%), chấp nhận sau điều trị trường hợp đái tháo đường thể suy tụy ngoại tiết [21] Điều trị hạ đường máu nặng cường insulin bẩm sinh bao gồm trì truyền dung dịch glucose ưu trương cung cấp qua đường tiêu hóa, sử dụng thuốc có tác dụng tăng đường máu điều trị phẫu thuật cắt tụy gần toàn trường hợp tổn thương lan tỏa tiểu đảo tụy cắt bỏ tổn thương khu trú Mục đích điều trị trì đường máu >70mg/dl (3,8mmol/l) Điều có ý nghĩa quan trọng để tránh hạ đường máu khả co giật gây tổn thương não Khi có chẩn đoán việc điều trị nội khoa nên bắt đầu tuần sau chẩn đoán [22] Điều trị cường insulin cần tiến hành cung cấp glucose tốc độ cao (đường tĩnh mạch đường 8 dày), sử dụng diazoxid octreotid, can thiệp phẫu thuật cắt bỏ 95- 98% điều trị nội khoa thất bại [1],[8],[15] Hai thuốc chọn dùng diazoxide thuốc ức chế kênh calxium; chế thuốc là tác dụng qua ABCC8 receptor kênh KCNJ11 Diazoxide hoạt động kênh KATP để ngăn chặn tiết insulin, thường hiệu với trẻ sơ sinh cường insulin stress gây hay cường insulin gây đột biến gen GHD GK không hiệu trẻ cường insulin đột biến kênh KATP Các thuốc khác somatostatin (octreotide), glucagon, corticoid điều trị thử Glucagon truyền tĩnh mạch (tiêm da hay tiêm bắp) để ổn định lượng đường máu tạm thời, glucagon kích thích giải phóng glucose từ gan, sử dụng bệnh nhân đường huyết thấp ăn chuẩn bị cho phẫu thuật [23] Điều trị phẫu thuật định bệnh nhân thể khu trú, chế độ ăn hiệu để trì đường máu bình thường Chỉ định phẫu thuật cho trường hợp thể lan tỏa nặng thay đổi theo kinh nghiệm trung tâm Phẫu thuật cắt tụy gây tiểu đường thiếu hụt insulin [6] 1.1.4 Insulin chế điều hòa tiết insulin 1.1.4.1 Insulin Insulin (Công thức hóa học: C257H383N65O77S6, gồm 51 amino acid; Trọng lượng phân tử: 5808) loại hormone tế bào beta nằm đảo tụy Langerhans tuyến tụy tiết tham gia điều hòa, chuyển hóa vận chuyển carbohydrate, acid amin, protein lipid tạo thuận lợi cho trình nhập glucose vào mô mỡ vân Ngoài ra, insulin tác dụng đến chuyển hóa mô mỡ gan tạo lượng ATP cung cấp cho hoạt động sống thể Nồng độ insulin máu thấp Trong máu insulin hoàn toàn dạng tự do, thời gian bán hủy 6-8 phút xuất khỏi máu sau 10-15 phút 9 Insulin hormone gây hạ đường máu tham gia vào trình chuyển hóa đường thể, có tác dụng điều chỉnh đường huyết Khi nồng độ glucose máu tăng (như sau ăn ), insulin tuyến tụy tiết tách glucose khỏi máu vào tế bào để đưa đường huyết trở mức bình thường, đường huyết thấp, thể giảm tiết insulin để đường máu không thấp Cơ chế kiểm soát tiết hormon insulin chủ yếu thông qua thay đổi nồng độ đường huyết, thiết lập nên chế thần kinh thể dịch Khi nồng độ đường huyết tăng, kích thích vào thụ quan hóa học thành mạch máu, luồng xung động thần kinh truyền vùng đồi Từ luồng xung động xuống hành tủy theo dây thần kinh có nhánh đến đảo tụy, gây tiết insulin Khi nồng độ đường huyết giảm chế ngược lại làm giảm tiết insulin Sự tiết insulin chịu ảnh hưởng vỏ não [24] 1.1.4.2 Sinh lý tiết insulin tế bào β đảo tụy - Kênh K-ATP Tế bào beta tiểu đảo tụy có vai trò then chốt điều hòa sản xuất tiết insulin Bài tiết insulin lại liên quan chặt chẽ với chuyển hóa glucose kênh K+ nhạy cảm ATP (ATP- sensitive K+ channels hay kênh K-ATP) tế bào beta tiểu đảo tụy Kênh K-ATP đóng vai trò chủ yếu việc trì nồng độ bình thường glucose thông qua liên kết chuyển hóa glucose với tính kích thích điện tế bào beta tiết insulin Kênh K-ATP phức hợp gồm tiểu đơn vị chia làm nhóm: bốn tiểu đơn vị lót mặt cấu tạo thành lỗ kênh kali (Kir6.2) bốn tiểu đơn vị có lực cao với sulfonylurea receptor (SUR1) SUR1 có 17 tiểu phân với vị trí gắn acid amin nội bào NBD-1 NBD-2 (vị trí cảm nhận thay đổi nồng độ ATP/ADP) Kir6.2 cấu tạo nên lõi kênh SUR1 có vai trò tiểu đơn vị điều hòa (Hình 1.1) 10 10 Hình 1.1 Hình dạng kênh K-ATP (Bennett K et al Rev endocr Metab Disord 2010) (Nguồn: benhviennhitrunguong.org.vn) - Cơ chế tiết insulin Bình thường màng tế bào trạng thái tăng phân cực, kênh K-ATP trạng thái mở điều chỉnh tỷ lệ ATP/ADP, lúc kênh canxi đóng Khi nồng độ glucose máu tăng lên (Ví dụ: sau bữa ăn, ), glucose vận chuyển vào tế bào beta nhờ enzym không phụ thuộc insulin glucose transporter Ở bào tương, glucose nhanh chóng phosphoryl hóa thành glucose-6-phosphate tác dụng enzyme glucokinase Glucose-6phosphate lại tiếp tục chuyển hóa thành pyruvate vào chu trình creb để tạo lượng ATP, lúc tỷ lệ ATP/ADP tăng lên gây đóng kênh K-ATP gây tích tụ kali tế bào, tích tụ gây khử cực màng tế bào mở kênh canxi, canxi từ vào tế bào gây giải phóng insulin từ hạt dự trữ (Hình 1.2) [3],[25],[26] 36 36 tạo thành sản phẩm phụ không mong muốn điều cần thiết phản ứng PCR Kết PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: Chất lượng nồng độ DNA mẫu, nồng độ thiết kề mồi, nồng độ ion Mg2+, nồng độ dNTP, Taq DNA polymerase, hệ thống đệm, chu trình nhiệt Các yếu tố trước tiên ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR nồng độ độ tinh DNA mẫu, chu trình nhiệt thiết kế mồi Nhiệt độ biến tính DNA khuôn dao động từ 90-98ºC Nếu nhiệt độ cao kéo dài làm giảm số lượng chất lượng củaTaq polymerase thời gian bán hủy Taq polymerase khôngdài: 2giờ/92,5ºC, 40 phút/95ºC, phút/97,5ºC Nhiệt độ thời gian gắn mồi đặc biệt quan trọng ảnh hưởng đến hiệu độ đặc hiệu sản phẩm PCR Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào thành phần base - trình tự nucleotid, kích thước nồng độ mồi Sau thử nghiệm, nhận thấy với nhiệt độ gắn mồi 55ºC cho kết tốt Tất mẫu khuếch đại máy PCR với chu trình nhiệt: biến tính 95ºC phút, sau thực 35 chu kỳ nhiệt: biến tính 95ºC 30 giây, gắn mồi 55ºC 30 giây, kéo dài 72ºC 30 giâyvà tiếp tục kéo dài 72ºC phút nữa, cuối giữ 15ºC Chu trình nhiệt chứng minh hiệu cao tất mẫu khuếch đại Mồi tiêu quan trọng để đạt khuếch đại đặc trưng có hiệu cao Trình tự mồi chọn cho bắt cặp bổ sung mồi xuôi mồi ngược cấu trúc kẹp tóc bắt cặp bổ sung phần khác mồi, Tm mồi xuôi mồi ngược không cách biệt nhau, thành phần nucleotide mồi phải cân tránh lặp lại nhiều lần cặp GC, mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại gen, trình tự nằm mồi xuôi ngược không lớn, phản ứng PCR 37 37 tối ưu trình tự nhỏ 1kb Kích thước mồi từ 16-30bp phù hợp, độ dài đủ dài để đặc trưng đầy đủ cho đoạn bắt cặp đủ ngắn mồi gắn cách dễ dàng vào đoạn gen Đối với DNA mẫu phản ứng PCR tối ưu DNA thật tinh sạch, không tạp nhiễm, không đứt gãy Enzym DNA polymerase đóng vai trò quan trọng phản ứng PCR Hiện nay, enzym Taq polymerase thường sản xuất kèm theo hệ thống đệm với pH thích hợp, chứa Mg2+ dNTP với nồng độ phù hợp Trong trình tổng hợp DNA, enzym DNA polymerase lựa chọn nucleotid phù hợp để kéo dài mồi theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn DNA polymerase xúc tác phản ứng tổng hợp chuỗi DNA theo chiều 5’-3’ Ngoài ra, số DNA polymerase có hoạt tính enzym exonuclease xúc tác theo chiều 3’- 5’ gọi hoạt tính enzym sửa chữa Enzym có khả kiểm tra lại độ xác tất nucleotid gắn vào trình kéo dài đoạn DNA mồi Nếu có nucleotid gắn không theo nguyên tắc bổ sung với sợi DNA khuôn, enzym xúc tác cắt bỏ nucleotid sai sót thay vào nucleotid khác theo nguyên tắc đối mã Độ xác hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào việc chọn enzym DNA polymerase cho phản ứng Bốn loại nucleotide (dNTP) thường sử dụng nồng độ 20200µM/ nucleotid Sự cân thành phần nucleotide làm tăng lỗi chép Taq polymerase MgCl2 dung dịch đệm thành phần quan trọng PCR nồng độ chất ảnh hưởng đến đặc hiệu hiệu suất phản ứng Taq DNA polymerase phụ thuộc vào nồng độ Mg2+ thường có hoạt độ tối ưu nồng độ 1,2-1,3 mM Mg 2+ tự Dung dịch đệm chuẩn chứa 1.5mM MgCl2 Tuy nhiên, nồng độ Mg 2+ tự bị ảnh hưởng nồng độ dNTP có trình liên kết cân phân tử lượng giữ dNTP 38 38 Mg2+ Không nên giảm nồng độ dNTP 200µM sử dụng enzym polymerase có khả sửa chữa hoạt tính exonuclease 3’-5’ thúc đẩy trình thoái hóa chuỗi DNA đơn đoạn DNA mồi Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAse, enzym hạn chế… tức không chứa thành phần tạp nhiễm Các yếu tố ngoại nhiễm nói gây ức chế phản ứng, làm giảm ức chế hoàn toàn phản ứng PCR Trong thực tế, số lượng chu kỳ phản ứng PCR không vượt 40 chu kỳ hiệu khuếch đại giảm hẳn phân hủy hết thành phần phản ứng, xuất sản phẩm phụ ức chế phản ứng, vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với Ở thực phản ứng PCR với 35 chu kỳ đạt kết tốt 4.3 Kỹ thuật giải trình tự gen Nghiên cứu sử dụng máy giải trình tự gen tự động Trình tự gen mẫu bệnh đối chiếu với trình tự gen bình thường ngân hàng gen giới phân tích để xác định vùng điểm đột biến Nếu sản phẩm đọc giải trình tự tinh khiết có hiệu suất cao, đỉnh tín hiệu sắc nhọn, cao phân tách rõ ràng, tín hiệu thấp, dễ dàng phân biệt nucleotid trạng thái đồng hợp tử/dị hợp tử Tuy nhiên, dung dịch đem giải trình tự không tinh tạo nhiều sản phẩm phụ ức chế hoàn toàn, việc xuất tín hiệu nhiễu gây cản trở trình đọc trình tự gen khó phân biệt đột biến tín hiệu nhiễu xác định vị trí đột biến loại đột biến Các kết giải trình tự nghiên cứu cho thấy hình ảnh tín hiệu rõ ràng, gần tín hiệu nhiễu chứng minh cho tối ưu giai đoạn quy trình kỹ thuật xây dựng trước Tuy kỹ thuật giải trình tự gen có giá trị nhựng có số hạn chế Kỹ thuật cần phải tiến hành qua nhiều bước (tách chiết DNA, phản ứng 39 39 PCR, giải trình tự chuỗi phân tích trình tự); đột biến điểm thường khó phát đột biến đoạn nên phải giải trình tự gen hai chiều Bên cạnh tín hiệu nhiễu gây trường hợp sai sót kết quả, đòi hỏi người làm kỹ thuật phải có kinh nghiệm để đem lại kết xác Hiện nay, kỹ thuật giải trình tự gen cải tiến nhiều, nhờ tiến kỹ thuật huỳnh quang, PCR, điện di trợ giúp công nghệ đại giúp cho việc giải trình tự gen trở nên đơn giản thành công cụ có giá trị, làm tảng cho việc phân tích gen người nhiều loài vi sinh vật 40 40 KẾT LUẬN Nghiên cứu hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen ABCC8 bệnh nhân cường insulin phát đột biến g 83201 C>G TÀI LIỆU THAM KHẢO James C et al: The genetic basis of congenital hyperinsulinism J Med Genet, 2009, 46 (5), 289-299 Đặng Ánh Dương, Vũ Chí Dũng, Nguyễn Phú Đạt cộng (2012) Cường insulin bẩm sinh nặng trẻ sơ sinh Tạp chí Thông tin y dược, (7) Vũ Chí Dũng (2014) “Hạ đường máu nặng cường insulin bẩm sinh” Lê Thị Hồng Huệ (2001) “Nghiên cứu tình trạng giảm glucose máu trẻ sơ sinh cân nặng thấp” Luận văn Thạc sĩ Lê Thị Hồng (2003) “Hạ đường huyết sơ sinh” Tạp chí y học thực hành số 438, Bộ Y tế 44±83 Phạm Nhật An (2012) Bài giảng Nhi khoa, Nhà xuất Y học Trần Bá Thoại, Trương Nguyễn Thoại Nhân Hạ đường huyết kéo dài cường insulin nhũ nhi? Stanley C A., (1997), ʺHyperinssulinism in infants and childrenʺ Pediatr Clin North Am 44(2): 363-374 Dekelbab BH, Sperling MA (2006) ʺRecent advances in persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancyʺ Acta Paediar 2006 Oct: 95(10): 1157-64 10 Nguyễn Vượng (2000) ʺU tụy nội tiết – nghiên cứu miễn dịch –mô bệnh họcʺ Kỷ yếu CTNCKH Nội tiết rối loạn chuyển hóa, Nxb Y học 526- ±8 11 Bộ môn Nhi, Trường Đại học Y Hà Nội (2009) Hạ đường máu, Bài giảng nhi khoa, Tập 1, Nhà xuất Y học, 197-203 12 Flanagan S E., Kapoor R R., et al., (2010) ʺGenetics of congenital hyperinsulinemic hypoglycemiaʺ Semin Pediatr Surg 20(1): 13-17 13 Senniappan S., Shanti B., et al., (2012) ʺHyperinsulinaemic hypoglycaemia: genetic mechanisms, diagnosis and managementʺ J Inherit Metab Dis 35(4): 589-601 14 Arnosix J B, Verkarre V, et al, (2010), “Congenitalhyperinsulinism curent trends in diagnosis and therapy” Orphanet J Rare Dis 663 15 Palladino A.A., Stanley C.A (2011) A specialized team approach to diagnosis and medical versus surgica treatment of infants with congenital hyperinsulinism Semin Pediatr Surg, 20(1) pp.32-37 16 Modan-Moses D., Koren I., et al., (2011) ʺTreatment of congenital hyperinsulinism with lanreotide acetate (Somatuline Autogel)ʺ J Clin Endocrinol Metab 96(8): 2312-2317 17 Sperling MA,Menon RK (2004) ʺDifferetial diagnosis and management of neonatal hypoglycemiaʺ Pediatr Clin North Am 2004 Jun;51(3): 703-23 18 Hussain K., (2008) “Diagnosis and management of hyperinsulinaemic hypoglycaemia of infancy” Horm Res 69(1): 2-13 19 Aslamm, Safdar CA, Khailid A, A wans, Ahmed I, Ahmed Z (2004) “Persistent hyperinsulinemic” 20 Hardy OT, Hernandez-Pampaloni M and coll (2007) ʺDiagnosis and localization of focal congenital hyperinsulinism by 18F-fluorodopa PET scanʺ, J Pediatr 2007 Feb; 150(2): 140-5 21 Nguyễn Đắc Nhật (2001) “Nồng độ insulin máu người Việt Nam bình thường” Kỷ yếu CTNCKH Hội Nội tiết ± Đái tháo đường Việt Nam, Nxb Y học 370 ± 22 Sempoux CH (2003) ʺPersistent neonatal hyperinsulinism: new pathological findings which clarify the physiopathology of the syndrome and direct therapeutic approachʺ Bull Mem Acad R Med Belg: 158(5-6): 291-7 23 Sawathiparnich P, Likitmaskul S, Angsusingha K, Nimkarn S and coll (2002) ʺPersistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy: experiences at Sirijai Hospitalʺ, J Med Assoc Thai 2002 Aug: 85 Suppl 2: 506-12 24 Insulin: http://vi.m.wikipedia.org 25 Shah JH, Maguire DJ, Brown D, Cotterill A (2007) ʺThe role of ATP sensitive channels in insulin secretion and the implcations in persistent hyperinsulinemic hypoglycenima of infancyʺ Avd Exp Med Biol 2007, 599: 133-8 26 Pinney S.E, MacMullen C., Becker S et al (2008) Clinical characteristics and biochemical mechanisms ofcongenital hyperinsulinism asociated with dominant KATP chanel mutations J Clin Invest, 2008, 118(8), 2877-2886 27 Phan Văn Duyệt, Nguyễn Đắc Nhật, Mai Thế Trạch (1987) “Định lượng phóng xạ miễn dịch học insulin người Việt Nam bình thường mắc bệnh đái tháo đường” Kỷ yếu chương trình y học hạt nhân 1981-1985, Nxb Y học 104±8 28 Daredeliler F Fournet JC, Bas F, Junien C, Gross MS, Bundak R, Saka N, Gunoz H (2002) ʺABCC8 (SUR1) and KCNJ11 (KIR6.2) mutations in persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy and evaluation of different therapeutic measuresʺ J Pediatr Endocrinol Metab, 2002 Jul-Aug; 15(7): 993-1000 29 Mc Andrew HF Smith V Spitz L (2003) ʺSurgical complications of pancreatectomy for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancyʺ Pediatr Surg 2003 Jan: 38(1):13-6 30 Tạ Thành Văn, (2010) “PCR số kỹ thuật Y sinh học phân tử”, Nhà xuất Y học 31 Nguyễn Quỳnh Ngọc (2013) Phát vi khuẩn actinobacillus actinomycetemcomitans gây viêm nha chu kỹ thuật realtime PCR, Trường Đại Học Y Hà Nội PHỤ LỤC Exon 27 28 Mồi Mồi xuôi (F) Mồi ngược(R) Mồi xuôi (F) Mồi ngược (R) Mồi xuôi (F) Mồi ngược (R) Mồi xuôi (F) Trình tự mồi 5´- GGCCCCATCTGTTAGAGATC - 3´ 5´-TCTGTGACCCTAAACCAGAAG - 3´ 5´-ACTGGGTTTCCCCAGACAAC- 3´ 5´-CATTGGCCTGTTGCACTCTC- 3´ 5´-GCACACATTTTCCAACAGCC- 3´ 5´-GTGCAAATTTCTCCCTAGCATC- 3´ 5´-GAACCTGTTCAGTCCTGTGG- 3´ Mồi ngược (R) 5´-CTTTCTTGATTACTGGGCCAG- 3´ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ LÊ THỊ NGỌC VÂN XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN ABCC8 TRÊN BỆNH NHÂN CƯỜNG INSULIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA Khóa 2012 - 2016 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.Trần Vân Khánh HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành khóa luận Trung tâm Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, em nhận hỗ trợ, giúp đỡ nhiệttình thầy, cô, gia đình bạn bè Trước hết, với tất lòng trân trọng, em xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.BS.Trần Vân Khánh - Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Phó giám đốcTrung tâm Gen - Protein, người cô hết lòng dạy bảo, tận tình hướng dẫn em bước đường học tập nghiên cứu khoa học Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Tạ Thành Văn - Phó hiệu trưởng Trường Đại Học Y Hà Nội, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, PGS TS Nguyễn Thị Hà - Cố vấn khoa họcTrung tâm Gen Protein, người thầy người cô giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập, tạo thuận lợi cho em trình thực hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo Đại học Trường Đại Học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn, giúp đỡ em thực khóa luận Em xin cảm ơn CN Lê Hoàng Bích Nga anh chị cán bộ, anh chị Nghiên cứu viên Trung tâm Gen-Protein, Trường Đại Học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em thực hoàn thành khóa luận Xin cảm ơn bạn động viên, ủng hộ trình trình học tập Cuối cùng, thực biết ơn bố mẹ, người thân yêu gia đình tạo điều kiện tinh thần vật chất để vượt qua khó khăn học tập hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Y khoa Trường Đại Học Y Hà Nội Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2016 Lê Thị Ngọc Vân DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA ADP ATP ddNTP EDTA KATP kb Kir6.2 NST PCI PCR PET SUR1 TBE TE Tm A C G T Deoxyribonucleic acid Adenosine diphosphate Adenosine triphosphate Deoxyribonucleotid triphosphate Ethylen diamin tetraacetic acid ATP- sensitive K+ channels (Kênh kali phụ thuộc ATP) Kilo base K+ inward - rectifier 6.2 Nhiễm sắc thể Phenol Chloroform Isoamyl Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại gen) Positron Emission Tomography (Chụp cắt lớp phát xạ positron) Sulfonylurea receptor (thụ thể sulfonylurea 1) Tris acetate EDTA Tris EDTA Nhiệt độ gắn mồi Adenine Ctytosine Guanin Thymine MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH