TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Bộ môn Dược lý NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH BÁN RƯỜNG DIỄN CỦA CAO LỎNG HVT TRÊN THỰC NGHIỆM Nơi tiến hành nghiên cứu: Bộ môn Dược lý Trường Đại học Y Hà Nội Thời gian nghiên cứu: 10/2014- 1/2015 Cán tham gia nghiên cứu: ThS Đỗ Linh Quyên PGS TS Vũ Thị Ngọc Thanh TS Phạm Thị Vân Anh Ths Mai Phương Thanh KTV Nguyễn Kiều Vân KTV Đinh Quang Trường KTV Đàm Đình Tranh KTV Nguyễn Thành Long 1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 1.1 Đối tượng nghiên cứu: 1.1.1 Thuốc hoá chất nghiên cứu: 1.1.1.1 Thuốc nghiên cứu: cao lỏng HVT đạt tiêu chuẩn sỏ ThS Đỗ Linh Quyên, Học viện Y Dược học cổ truyền Việt Nam cung cấp 1.1.1.2.Hoá chất: - Kit định lượng enzym chất chuyển hoá máu: ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol toàn phần, creatinin hãng Hospitex Diagnostics (Italy) hãng DIALAB GmbH (Áo), định lượng máy Screen master hãng Hospitex Diagnostics (Italy) - Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG hãng ABX - Diagnostics, định lượng máy Vet abcTM Animal Blood Counter - Các hoá chất xét nghiệm làm tiêu mô bệnh học 1.1.2 Động vật thực nghiệm: hai giống, khoẻ mạnh Chuột cống trắng chủng Wistar, trọng lượng 150 - 200g Động vật nuôi phòng thí nghiệm ngày trước nghiên cứu thức ăn chuẩn dành riêng (do Công ty liên doanh Guyomarc’h-VCN sản xuất), uống nước tự 1.2 Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu độc tính bán trường diễn chuột cống theo đường uống: Chuột chia làm lô, lô 10 - Lô chứng: uống nước cất 1mL/100g/ngày - Lô trị 1: uống HVT liều thấp 16 mg/kg (liều có tác dụng tương đương liều dùng người) - Lô trị 2: uống HVT liều cao 80 mg/kg (gấp lần lô trị 1) Chuột uống dung môi thuốc thử tuần liền, ngày lần vào buổi sáng Sau tuần uống thuốc, chuột ngừng uống thuốc theo dõi tiếp tuần, đánh giá khả gây độc tính thuốc Các tiêu theo dõi trước trình nghiên cứu: - Tình trạng chung, thể trọng chuột - Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu số lượng tiểu cầu - Đánh giá chức gan thông qua định lượng số enzym chất chuyển hoá máu: ALT, AST, bilirubin toàn phần, albumin cholesterol toàn phần - Đánh giá chức thận thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết Các thông số theo dõi kiểm tra vào trước lúc uống thuốc, sau tuần uống thuốc, sau tuần uống thuốc, sau tuần ngừng uống thuốc - Mô bệnh học: + Sau tuần uống thuốc, sau tuần ngừng uống thuốc, chuột mổ để quan sát đại thể toàn quan + Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận 30% số chuột lô + Các xét nghiệm vi thể thực Trung tâm nghiên cứu phát sớm ung thư – Liên hiệp hội khoa học kỹ thuật Việt Nam (do PGS.TS Lê Đình Roanh đọc kết vi thể) 1.3 Xử lý số liệu: Các số liệu nghiên cứu xử lý thống kê theo phương pháp t-test Student t test trước-sau Số liệu biểu diễn dạng : ± SD Sự khác biệt có ý nghĩa p ≤ 0,05 Chú thích: * Khác biệt so với nhóm chứng với p ≤ 0,05 ** Khác biệt so với nhóm chứng với p ≤ 0,01 *** Khác biệt so với nhóm chứng với p ≤ 0,001 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 2.1 Tình trạng chung thay đổi thể trọng chuột cống: 2.1.1 Tình trạng chung: Trong thời gian thí nghiệm, chuột cống lô hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống tốt, phân khô Không thấy biểu đặc biệt lô chuột cống suốt thời gian nghiên cứu 2.1.2 Sự thay đổi thể trọng chuột cống: Bảng 2.1 Ảnh hưởng HVT đến thể trọng chuột cống Thời gian Lô chứng Trọng % tăng lượng Trước uống thuốc trọng (kg) 198,00 ± lượng Sau tuần 39,67 227,00 ± uống thuốc p trước - sau Sau tuần Lô trị % tăng Trọng trọng lượng (kg) lượng 183,00 ± 15,05 ± 19,47 214,00 ± 43,98 < 0,05 255,50 ± 9,09 < 0,05 29,39 ± uống thuốc p trước - sau Sau tuần ngừng 53,25 < 0,05 235,00 ± uống thuốc p trước - sau 79,37 < 0,05 Lô trị % tăng Trọng trọng lượng (kg) lượng 183,00 ± 16,99 ± 25,84 216,00 ± 18,15 ± 25,91 < 0,05 231,00 ± 6,77 < 0,05 26,36 ± 33,07 < 0,05 235,00 ± 9,27 < 0,05 28,03 ± 10,87 < 0,05 37,07 ± 28,46 < 0,05 228,57 ± 9,75 < 0,05 23,12 ± 43,78 < 0,05 235,00 ± 11,61 < 0,05 25,22 ± 10,87 < 0,05 36,25 < 0,05 12,30 < 0,05 48,22 < 0,05 13,84 < 0,05 Kết bảng 2.1 cho thấy: sau tuần tuần uống thuốc thử, sau tuần ngừng uống thuốc, trọng lượng chuột cống lô (lô chứng lô trị) tăng so với trước nghiên cứu Không có khác biệt mức độ gia tăng trọng lượng chuột cống lô chứng lô dùng thuốc thử (p > 0,05) 2.2 Đánh giá chức tạo máu: Bảng 2.2 Ảnh hưởng HVT đến số lượng hồng cầu máu chuột cống Số lượng hồng cầu (T/l) Lô trị 8,27 ± 0,34 Thời gian Trước uống thuốc Sau tuần Lô chứng 8,49 ± 0,56 Lô trị 8,32 ± 0,55 uống thuốc p trước - sau 8,59 ± 0,45 8,44 ± 0,72 > 0,05 > 0,05 8,91 ± 0,53 8,72± 0,63 8,63 ± 0,58 > 0,05 > 0,05 > 0,05 8,86 ± 0,83 8,48 ± 1,41 9,39 ± 1,55 > 0,05 uống thuốc p trước - sau Sau tuần ngừng 8,54 ± 0,93 > 0,05 uống thuốc p trước - sau Sau tuần > 0,05 > 0,05 Bảng 2.3 Ảnh hưởng HVT đến hàm lượng huyết sắc tố máu chuột cống Thời gian Trước uống thuốc Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần ngừng uống thuốc p trước - sau Lô chứng 15,32 ± 0,65 Hàm lượng huyết sắc tố (g/dl ) Lô trị Lô trị 15,37 ± 0,76 15,19 ± 0,83 14,46 ± 1,25 15,30 ± 0,74 15,12 ± 0,96 > 0,05 > 0,05 > 0,05 15,43 ± 0,99 15,38 ± 1,13 14,40 ± 0,98 > 0,05 > 0,05 > 0,05 16,98 ± 0,66 16,27 ± 1,00 16,37 ± 2,62 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Kết bảng 2.2, 2.3 cho thấy: sau tuần tuần uống HVT, sau tuần ngừng uống HVT, số lượng hồng cầu hàm lượng huyết sắc tố lô trị (uống HVT liều thấp) lô trị (uống HVT liều cao) khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng so sánh thời điểm trước sau uống thuốc thử (p > 0,05) Bảng 2.4 Ảnh hưởng HVT đến hematocrit máu chuột cống Lô chứng 47,50 ± 2,33 Hematocrit (%) Lô trị 46,89 ± 2,31 Lô trị 46,63 ± 2,57 44,37 ± 4,12 45,42 ± 3,02 44,41 ± 2,76 > 0,05 > 0,05 47,52 ± 2,61 45,42 ± 3,02 > 0,05 44,67 > 0,05 > 0,05 ± 3,13 > 0,05 47,25 ± 2,79 46,03 ± 1,88 47,94 ± 7,79 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Thời gian Trước uống thuốc Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần ngừng uống thuốc p trước - sau Kết bảng 2.4 cho thấy: sau tuần tuần uống HVT, hematocrit lô trị (uống HVT liều cao) có xu hướng giảm so với lô chứng so sánh thời điểm trước sau uống thuốc thử khác biệt ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Sau tuần ngừng uống HVT, hematocrit ở lô trị (uống HVT liều thấp) lô trị (uống HVT liều cao) khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng so sánh với thời điểm trước uống thuốc thử (p > 0,05) Bảng 2.5 Ảnh hưởng HVT đến số lượng bạch cầu máu chuột cống Lô chứng 5,12 ± 1,48 Số lượng bạch cầu (G/l) Lô trị 4,53 ± 0,80 Lô trị 4,73 ± 1,57 5,69 ± 1,41 4,96± 1,22 5,33 ± 1,52 > 0,05 > 0,05 > 0,05 5,23 ± 1,30 4,65 ± 1,14 4,90 ± 1,40 > 0,05 > 0,05 > 0,05 6,48 ± 1,44 4,03 ± 0,68 6,79 ± 2,40 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Thời gian Trước uống thuốc Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần ngừng uống thuốc p trước - sau Kết bảng 2.5 cho thấy: sau tuần tuần uống HVT, sau tuần ngừng uống HVT, số lượng bạch cầu lô trị (uống HVT liều thấp) không thay đổi so với lô chứng sinh học, khác biệt ý nghĩa thống kê với p >0,05 Số lượng bạch cầu lô trị khác biệt so với thời điểm trước uống thuốc (p > 0,05) Bảng 2.6 Ảnh hưởng HVT đến công thức bạch cầu máu chuột cống Lô chứng Lympho Trung Công thức bạch cầu Lô trị Lympho Trung Lô trị Lympho Trung (%) 87,20 ± tính(%) 12,40 ± (%) 86,40 ± tính(%) 13,30 ± (%) 84,20 ± tính(%) 15,30 ± Sau tuần 2,82 81,80 ± 2,88 17,00 ± 3,95 84,30 ± 4,06 14,50 ± 4,57 81,20 ± 4,47 18,30± uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần 12,83 < 0,05 88,50 ± 13,16 < 0,05 10,80 ± 6,36 < 0,05 87,30 ± 5,34 < 0,05 11,90 ± 6,30 < 0,05 83,70 ± 6,17 < 0,05 15,00 ± uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần ngừng 4,33 > 0,05 83,25 ± 3,85 > 0,05 15,75 ± 3,06 > 0,05 85,71 ± 3,87 > 0,05 13,57 ± 8,46 < 0,05 83,00 ± 8,19 < 0,05 16,00 ± uống thuốc p trước - sau 6,18 > 0,05 5,56 > 0,05 5,31 > 0,05 5,13 > 0,05 3,51 > 0,05 3,53 > 0,05 Thời gian Trước uống thuốc Kết bảng 2.6 cho thấy: sau tuần tuần uống HVT tuần ngừng uống HVT, công thức bạch cầu lô trị (uống HVT liều thấp) lô trị (uống HVT liều cao) khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng so sánh thời điểm trước sau uống thuốc thử (p > 0,05) Bảng 2.7 Ảnh hưởng HVT đến số lượng tiểu cầu máu chuột cống Số lượng tiểu cầu (G/l) Lô trị 478,30 ± 46,63 Thời gian Trước uống thuốc Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần ngừng uống thuốc p trước - sau Lô chứng 472,50 ± 66,91 Lô trị 483,50 ± 131,19 418,50 ± 89,24 445,50± 66,58 449,10 ± 104,94 > 0,05 > 0,05 > 0,05 428,50 ± 36,05 439,20 ± 69,30 443,10 ± 85,92 > 0,05 > 0,05 > 0,05 458,25 ± 11,79 433,29 ± 41,11 453,57 ± 118,10 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Kết bảng 2.7 cho thấy: sau tuần tuần uống HVT tuần ngừng uống HVT, số lượng tiểu cầu lô trị (uống HVT liều thấp) lô trị (uống HVT liều cao) không thay đổi so với thời điểm trước uống thuốc thử (p > 0,05) so với lô chứng (p > 0,05) 2.3 Đánh giá chức gan: Bảng 2.8 Ảnh hưởng HVT đến hoạt độ AST (GOT) máu chuột cống Lô chứng 105,60 ± 9,58 Hoạt độ AST (UI/l) Lô trị 108,90 ± 14,00 Lô trị 112,90 ± 14,32 119,60 ± 22,74 117,50 ± 17,53 118,90 ± 23,65 > 0,05 > 0,05 > 0,05 113,80 ± 18,27 112,60 ± 14,50 108,70 ± 11,21 > 0,05 > 0,05 > 0,05 118,50 ± 10,50 103,14 ± 5,96 108,14 ± 19,78 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Thời gian Trước uống thuốc Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần ngừng uống thuốc p trước - sau Bảng 2.9 Ảnh hưởng HVT đến hoạt độ ALT (GPT) máu chuột cống Hoạt độ ALT (UI/l) Lô trị 61,70 ± 4,76 Thời gian Trước uống thuốc Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần uống thuốc p (trước - sau) Sau tuần ngừng uống thuốc p trước - sau Lô chứng 57,30 ± 5,33 Lô trị 61,60 ± 7,26 62,80 ± 14,47 60,20 ± 9,10 60,10 ± 9,26 > 0,05 > 0,05 < 0,05 59,30 ± 7,10 59,20 ± 6,78 59,90 ± 6,10 > 0,05 > 0,05 > 0,05 57,00 ± 4,08 47,57 ± 6,50 52,71 ± 9,62 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Bảng 2.10 Ảnh hưởng HVT đến nồng độ bilirubin toàn phần máu chuột cống Thời gian Trước uống thuốc Sau tuần Lô chứng 13,40 ± 0,43 13,61 ± 0,37 Bilirubin toàn phần(mmol/l) Lô trị Lô trị 13,27 ± 0,49 13,31 ± 0,44 13,59 ± 0,36 13,32 ± 0,39 10 Ảnh 11: Hình thái vi thể thận chuột cống lô chứng (chuột cống số 4) (HE x 400) Thận bình thường Ảnh 12: Hình thái vi thể thận chuột cống lô chứng (chuột cống số 10) (HE x 400) Thận bình thường 20 Ảnh 13: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 42) (HE x 400) Thận: tế bào ống lượn gần cấu trúc khác bình thường Ảnh 14: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 44) (HE x 400) Thận bình thường 21 Ảnh 15: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 49) (HE x 400) Thận bình thường Ảnh 16: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 53) (HE x 400) Thận bình thường 22 Ảnh 17: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 55) (HE x 400) Thận bình thường Ảnh 18: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 56) (HE x 400) Thận bình thường 23 2.5.2 Sau tuần ngừng uống HVT - Đại thể: Trên tất chuột cống thực nghiệm (cả lô chứng lô trị), không quan sát thấy có thay đổi bệnh lý mặt đại thể quan tim, phổi, gan, lách, tụy, thận hệ thống tiêu hoá chuột cống - Vi thể: + Hình thái vi thể gan:  Lô chứng: hình ảnh gan bình thường thoái hóa nhẹ  Lô trị (uống HVT liều thấp): hình ảnh gan bình thường  Lô trị (uống HVT liều cao): hình ảnh gan bình thường thoái hóa nhẹ Ảnh 1: Hình thái vi thể gan chuột cống lô chứng (chuột cống số 8) (HE x 400) Gan thoái hóa nhẹ (HE x 400: Nhuộm Hematoxylin - Eosin, độ phóng đại 400 lần) 24 Ảnh 2: Hình thái vi thể gan chuột cống lô chứng (chuột cống số 11) (HE x 400) Gan thoái hóa nhẹ Ảnh 3: Hình thái vi thể gan chuột cống lô trị (chuột cống số 47) (HE x 400) Gan bình thường 25 Ảnh 4: Hình thái vi thể gan chuột cống lô trị (chuột cống số 50) (HE x 400) Gan bình thường Ảnh 5: Hình thái vi thể gan chuột cống lô trị (chuột cống số 51) (HE x 400) Gan bình thường 26 Ảnh 6: Hình thái vi thể gan chuột cống lô trị (chuột cống số 59) (HE x 400) Gan bình thường Ảnh 7: Hình thái vi thể gan chuột cống lô trị (chuột cống số 65) (HE x 400) Gan thoái hóa nhẹ 27 Hình thái vi thể thận:  Lô chứng: hình ảnh thận bình thường  Lô trị (uống HVT liều thấp): hình ảnh thận bình thường  Lô trị (uống HVT liều cao): hình ảnh thận bình thường Ảnh 8: Hình thái vi thể thận chuột cống lô chứng (chuột cống số 8) (HE x 400) Thận bình thường 28 Ảnh 9: Hình thái vi thể thận chuột cống lô chứng (chuột cống số 9) (HE x 400) Thận bình thường Ảnh 10: Hình thái vi thể thận chuột cống lô chứng (chuột cống số 11) (HE x 400) Thận thoái hóa nhẹ tế bào ống lượn gần 29 Ảnh 11: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 47) (HE x 400) Thận: tế bào ống lượn gần cấu trúc khác bình thường Ảnh 12: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 50) (HE x 400) Thận thoái hóa vừa tế bào ống lượn gần 30 Ảnh 13: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 51) (HE x 400) Thận bình thường Ảnh 14: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 59) (HE x 400) Thận bình thường 31 Ảnh 15: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 61) (HE x 400) Thận bình thường Ảnh 16: Hình thái vi thể thận chuột cống lô trị (chuột cống số 65) (HE x 400) Thận thoái hóa nhẹ tế bào ống lượn gần 32 NHẬN XÉT VÀ KẾT LUẬN: Kết nghiên cứu độc tính bán trường diễn HVT cho thấy: HVT liều 16 mg/kg liều 80 mg/kg uống liên tục tuần chuột cống trắng, sau ngừng uống HVT tuần, kết nghiên cứu cho thấy: -HVT hai liều 16 mg/kg 80 mg/kg không làm ảnh hưởng xấu đến tình trạng chung, mức độ tăng trọng lượng chuột cống so với lô chứng so với trước nghiên cứu -HVT hai liều 16 mg/kg 80 mg/kg không làm thay đổi số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit, số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu công thức bạch cầu sau tuần uống liên tục sau tuần ngừng uống thuốc so với lô chứng so với thời điểm trước uống thuốc -HVT hai liều 16 mg/kg 80 mg/kg không làm thay đổi kết số xét nghiệm đánh giá mức mộ tổn thương tế bào gan chức gan (hoạt độ AST, ALT, nồng độ bilirubin toàn phần, albumin cholesterol toàn phần) -HVT hai liều 16 mg/kg 80 mg/kg không làm thay đổi nồng độ creatinin máu chuột cống sau tuần uống liên tục sau tuần ngừng uống thuốc -HVT hai liều 16 mg/kg 80 mg/kg không gây tổn thương mặt hình thái quan sát đại thể quan chuột cống -HVT hai liều 16 mg/kg 80 mg/kg không ảnh hưởng đến cấu trúc vi thể gan, thận chuột cống: Hình ảnh vi thể gan chuột cống hình ảnh vi thể thận: khác biệt lô chứng lô uống thuốc thử HVT tuần liên tục sau tuần ngừng uống thuốc 33 KẾT LUẬN Mẫu HVT yêu cầu Bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội thử độc tính bán trường diễn chuột cống theo đường uống, kết cho thấy: - Liều 16 mg/kg thể trọng/ngày (tương đương liều dùng lâm sàng) uống liên tục tuần: độc tính bán trường diễn - Liều 80 mg/kg thể trọng/ngày (tương đương lần liều dùng lâm sàng) uống tuần liên tục: độc tính bán trường diễn Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Trưởng Bộ môn Dược lý TS Phạm Thị Vân Anh Trường Đại học Y Hà Nội xác nhận chữ ký TS Phạm Thị Vân Anh, Trưởng Bộ môn Dược lý Trưởng phòng Tổ chức Cán 34