KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đánh giá tác động capsaicin từ ớt thụ thể Neurokinin – tế bào lympho chuột Swiss Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Lớp: TS Trịnh Tất Cường TS Nguyễn Hữu Đức Phùng Minh Tuấn K55CNSHB Hà Nội - 2014 h ä c t ù n h iª n - - oa TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC kh ® ¹i hä c NỘI DUNG ĐẶT VẤN ĐỀ VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Tiểu đường Cải thiện giấc ngủ Ung thư dày Giảm đau Béo phì Công dụng ớt Cải thiện hệ tuần hoàn máu Thư giãn Ung thư tuyến tiền liệt Cảm cúm Thụ thể Neurokinin – (NK1) Thụ thể Neurokinin thành viên họ thụ thể liên kết G – protein Kích hoạt thụ thể NK1 ảnh hưởng đến: Cấu trúc thụ thể neurokinin – Điều hòa miễn dịch Dẫn truyền thần kinh Bài tiết đường ruột hấp thụ Điều chỉnh phản xạ, giãn nở mạch máu tính thấm thành mạch Substance P (SP)  Chất đóng vai trò quan trọng họ tachykinin  Có khả liên kết với ba loại thụ thể NK1, NK2 NK3  Là phối tử có lực cao với thụ thể NK1 Aprepitant (AP)  Hợp chất hóa học thuộc chất đối vận thụ thể NK1  Ngăn chặn SP, không cho SP liên kết với thụ thể NK1 Capsaicin Capsaicin chất có hoạt tính gây cay nóng thực vật thuộc nhóm ớt, thành viên họ vanilloid Hình 7: Cấu trúc capsaicin  Mục tiêu: Đánh giá vai trò capsaicin thụ thể NK-1 tế bào lympho  Nội dung nghiên cứu Đánh giá hàm lượng capsaicin ớt Tách tế bào lympho từ chuột Đánh giá khả thay đổi Ca2+ tế bào lympho kích thích SP Đánh giá khả ức chế sinh Ca2+ thông qua SP tế bào lympho AP Đánh giá khả thay đổi Ca2+ tế bào lympho kích thích capsaicin Đánh giá khả ức chế sinh Ca2+ thông qua SP tế bào lympho capsaicin VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thí nghiệm Ớt thiên (Viện dược liệu) Chuột nhắt trắng trưởng thành dòng Swiss (Viện vệ sinh dịch tễ trung ương) VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2 Đối tượng nghiên cứu Capsaicin ớt Tế bào lympho chuột Swiss 10 VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.5 Phương pháp Phương pháp đánh giá hàm lượng capsaicin ớt: Sử dụng máy phân tích HPLC với cột Shim-pack VP-ODS (250mm x 4,6mm) bước sóng 254nm, nhiệt độ cột 25oC Dung dịch methanol acid phosphoric (70:30), rửa giải với tốc độ dòng 0,8 ml/phút Phương pháp tách tế bào lympho: kit Ficoll – Paque Plus (GE – Health care) Phương pháp đánh giá khả thay đổi Ca2+ tế bào lympho: kit Fura – 2AM (Abcam) 13 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá hàm lượng capsaicin ớt 1250 mAU 280nm,4nm (1.00) 1000 750 500 250 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 Hình Sắc ký đồ dịch chiết tổng số 14 35.0 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 201 3.1 Đánh giá hàm lượng capsaicin ớt mAU 35.76/ 1.00 150 125 100 75 200 300 400 500 643 646 671 385 251 25 500 280 50 600 700 nm Hình 2: Bước sóng hấp phụ capsaicin (Đo được) Hình 3: Bước sóng hấp phụ capsaicin chuẩn (Hãng Sigma công bố) 15 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá hàm lượng capsaicin ớt Conc.(x10) mAU 1(#1) Ch1 280nm Ch1 280nm 70 2(#1) 3(#1) Ch1 280nm 4(#1) Ch1 280nm 60 5(#1) Ch1 280nm 5.0 4.0 50 40 3.0 30 2.0 20 10 1.0 -10 0.0 22.5 25.0 27.5 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 Hình 4: Đường chuẩn capsaicin 16 Area III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá hàm lượng capsaicin ớt Bảng Diện tích đỉnh mẫu thô với thể tích chạy 20µl Bảng Diện tích đỉnh ứng với thể tích 10, 20, 30, 40, 50µl Level Conc Mean Area SD %RSD Area1 Conc 10.00000 1245459 20.00000 2545494 30.00000 3439722 13439722 40.00000 3901940 13901940 50.00000 4784092 14787092 Mean 3.508904 12482336 20.00000 2545494 3.0 2.0 0.0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 Area 89318.95 3.508904 12482336 12608652 Hình 5: Vị trí diện tích đỉnh dịch chiết tổng số đường chuẩn 1.0 Area1 Diện tích đỉnh dịch tổng số gần trùng với điểm thứ đường chuẩn Conc.(x10) 5.0 4.0 %RSD Area 11245459 89318.95 SD 3000000 3500000 4000000 4500000 Area 17 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá hàm lượng capsaicin ớt  Capsaicin chuẩn nồng độ 0.05g/ml => 20µl chứa 0.001g capsaicin  Dịch chiết tổng số 50µl có diện tích đỉnh capsaicin: 12608652 (đơn vị diện tích)  Dịch chuẩn capsaicin 20µl có diện tích peak: 12482336 (đơn vị diện tích) => Công thức tính số gram capsaicin 50µl dịch tổng số là:  Trong 50µl dịch tổng số chứa 0.00101g => 1ml chứa 0.02g Nồng độ capsaicin ớt 0.02g capsaicin/1g ớt => Tương đương 2% 18 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2 Tách tế bào lympho từ chuột Swiss Li tâm 500 vòng Vị trí chứa tế bào lympho 30 phút, 40C Thêm 1ml dung dịch đệm Li tâm 600 vòng 10 phút Tế bào lympho 19 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3 Đánh giá khả thay đổi Ca2+ tế bào lympho kích thích SP Bảng 3: Giá trị trung bình mật độ Ca2+ tế bào lympho kích thích nồng độ SP khác Hiệu bước sóng (380 – 340) Sai số 6918 1242 10M 7877 1528 10-9M 7926 976 10-8M 8691 900 10-7M 10242 1333 10-6M 9082 864 10-5M 7465 1173 10-4M 7956 507 ĐC Hình 6: Mật độ Ca2+ tế bào lympho kích thích nồng độ SP khác 10- ĐC 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 Nồng độ SP kích thích thụ thể NK – biểu tế bào lympho mạnh 10-7M 20 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3 Đánh giá khả thay đổi Ca2+ tế bào lympho kích thích SP Bảng 4: Giá trị trung bình mật độ Ca2+ tế bào lympho kích thích SP nồng độ 10-7M khoảng thời gian khác Hiệu bước sóng Sai số 380 – 340 (nm) ĐC 10967 779 30 giây 20103 5927 60 giây 25022 2899 90 giây 24786 1767 120 giây 23122 1768 Hình 7: Mật độ Ca2+ tế bào lympho bị kích thích SP 10-7M khoảng thời gian khác Nồng độ SP kích thích thụ thể NK – biểu tế bào lympho mạnh 10-7M thời gian 60 giây đưa vào tế bào ĐC 30'' 60'' 90'' 120'' 21 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.4 Đánh giá khả ức chế sinh Ca2+ thông qua SP tế bào lympho AP Bảng 5: Giá trị trung bình mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với SP 10-7M dải nồng độ AP khác Hình 8: Hiệu bước sóng (380 – 340) Sai số ĐC 13190 1341 SP 10-7M 15365 1135 12104 3071 11735 1142 11986 1181 12229 1301 Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ AP 10-8M + SP 107M với SP 107M AP 10-7M + SP 107M dải nồng độ AP khác AP 10-6M + SP 107M Nồng độ AP ức chế sinh Ca2+ thông qua SP tốt 10-7 M AP 10-5M + SP 107M 22 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.5 Đánh giá khả kích thích tăng Ca2+ tế bào lympho capsaicin Hình 9: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác khoảng thời gian khác 23 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.6 Đánh giá khả ức chế sinh Ca2+ thông qua SP tế bào lympho capsaicin Hình 10: Mật độ Ca2+ tế bào lympho ủ với nồng độ capsaicin khác SP 10-7M khoảng thời gian khác 24 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận  Tách chiết thành công capsaicin giống ớt thiên cung cấp với tỉ lệ tinh 95%  Tách thành công tế bào lympho chuột Swiss  Đánh giá khả ức chế sinh Ca2+ thông qua SP tế bào lympho capsaicin 25 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kiến nghị  Tiếp tục nghiên cứu tách chiết capsaicin từ giống ớt khác nhau, khoảng thời gian khác  Đánh giá chế tác động capsaicin số tế bào mang thụ thể NK-1 khác 26 XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN SỰ CHÚ Ý LẮNG NGHE CỦA THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN 27