Tạp chí Khoa học Công nghệ 49 (6) (2011) 83-92 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CELLULOSE TÁCH TỪ RƠM RẠ THÀNH ĐƯỜNG TAN CỦA NÂM MỐC ASPERGILLUS TERRIUS ĐỂ SẢN XUẤT ETHANOL NHIÊN LIỆU SINH HỌC Trần Đình Toại 1, Phạm Hồng Hải2, Nguyễn Bá Kiên3, Hoàng Thị Bích2, Đỗ Trung Sỹ1,* Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên * Viện Hóa học Viện Thổ nhưỡng Nông hóa Liên hệ với tác giả: hai.inpc@yahoo.com; Đến Tòa soạn ngày 17/5/2011; Chấp nhận đăng ngày: 20/2/2011 MỞ ĐẦU Nhiên liệu sinh học xu thế giới việc tìm kiếm nguồn lượng thay cho nguồn lượng từ hydrocacbon dần cạn kiệt Hiện tại, phương pháp sản xuất nhiên liệu sinh học đa phần áp dụng công nghệ phân giải nhiệt độ cao, sau tạo phản ứng với hydro trải qua trình tinh luyện trực tiếp để chiết xuất thành nhiên liệu sinh học [1, 2] Quá trình đòi hỏi thực nhiệt độ, áp suất cao có tác dụng chất xúc tác nên giá thành sản phẩm sau ứng dụng vào sản xuất cao Chính vậy, nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật nguồn xúc tác sinh học để thủy phân phế liệu nông nghiệp rơm rạ giải pháp việc phát triển nhiên liệu sinh học Giải pháp vừa không tiêu hao nguồn lương thực người vừa loại bỏ phế phụ phẩm nông nghiệp cách thân thiện với môi trường mà hy vọng sản xuất nhiên liệu sinh học với quy mô lớn, nhờ ưu điểm hiệu suất cao giá thành giảm Trong khuôn khổ báo này, sử dụng quy hoạch thực nghiệm để tìm giá trị tối ưu thành phần tham gia trình thủy phân cellulose cho đạt hiệu thủy phân cao VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Rơm rạ khô sau thu hoạch xấy khô, xay nghiền lọc qua rây để đạt kích thước khoảng mm - Nấm mốc Aspergillus terreus AF67 (kí hiệu AF67): chủng giống có khả phân hủy cellulose mạnh khoa Sinh- trường Đại học Tổng hợp Belarus cung cấp (Đề tài hợp tác Việt - Trần Đình Toại, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Bá Kiên,Hoàng Thị Bích, Đỗ Trung Sỹ Nga) lưu giữ Phòng Công nghệ khai thác chế biến tài nguyên thiên nhiên, Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên 2.2 Môi trường nuôi cấy - Môi trường nuôi cấy nấm mốc: môi trường Crapeck - Môi trường thay (MT2): cellulose 20 g; NaNO3 1g; KH2PO4 g; MgSO4.5H2O 0,5 g, cao men 0,5 g, thạch 15 g, nước 1000 ml, pH Khử trùng 1atm, 30 phút 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Tách cellulose từ rơm rạ (phương pháp Hypoclorit) Sử dụng cellulose tách từ rơm rạ cellulose tinh thể lượng đường glucose đạt đến 90%, đường xylose, arabinose lại không đáng kể rhamnose Như vậy, sử dụng cellulose thu có glucose Điều thuận tiện cho giai đoạn lên men ethanol từ glucose Tách sử dụng cellulose từ thành phần hỗn hợp nguyên liệu, coi làm cellulose, loại bỏ tạp chất mà tạp chất chất ức chế mạnh hệ enzyme cellulose thủy phân cellulose, hemicellulose lignin, silic dư lượng chất trừ lại nguyên liệu [1, 2] 3.2 Xác định khả sinh enzyme cellulase phương pháp axit dinitro salicylic DNS [3] Dựa khả hiđro hóa enzyme cellulase để biến đổi chất (CMC, rơm rạ) thành đường glucose Glucose phản ứng tạo màu với thuốc thử DNS Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường glucose phạm vi định Sản phẩm sau phản ứng xác định phương pháp đo quang bước sóng 540 nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử DNS ta dễ dàng tính hàm lượng đường sinh mẫu thí nghiệm Các bước tiến hành - Dựng đường chuẩn glucose: Đồ thị chuẩn xây dựng từ mật độ quang OD dung dịch glucose với nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 (mg/ml) Mật độ quang dãy dung dịch chuẩn đưa bảng mối tương quan nồng độ glucose độ hấp thụ quang hình Bảng Mật độ quang dãy dung dịch chuẩn glucose 84 Nồng độ glucose (mg/ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Độ hấp thụ (OD) 0,253 0,289 0,4 0,566 0,656 0,783 0,949 Nghiên cứu tối ưu hóa trình thủy phân cellulose tách từ rơm rạ thành đường tan nâm… y = 1.19x + 0.1996 OD R2 = 0.9826 0.8 0.6 Độ hấp thụ quang(OD) 0.4 Linear (Độ hấp thụ quang(OD)) 0.2 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nồng độ glucose (mg/ml) Hình Đồ thị đường chuẩn glucose - Xác định khả sinh enzyme cellulase giai đoạn trình lên men Môi trường thay (MT2) có bổ sung 5% chủng giống vi sinh vật lên men 48 Nuôi cấy máy lắc 240 vòng/phút 35 0C Tại thời điểm khác trình lên men: giờ, 24 giờ, 48 giờ… tiến hành hút dịch lên men, li tâm 10 000 vòng/phút 30 phút, hút dịch để đo lượng đường sinh Enzyme cellulase sinh thủy phân cellulose thành đường tan Lượng đường sinh nhiều bắt màu đậm với thuốc thử DNS Đo lượng đường sinh thời điểm trình lên men đánh giá khả thủy phân cellulose enzyme cellulase 2.3 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm [4, 5] Trong trình thủy phân cellulose nồng độ glucose tạo thành phụ thuộc vào thành phần tham gia thủy phân: nồng độ cellulose, nồng độ enzyme cellulase, nhiệt độ, pH… Bằng cách giữ nguyên số thông số ảnh hưởng đến điều kiệu nuôi cấy nhiệt độ, pH, … tiến hành tối ưu hóa theo thông số hàm lượng cellulose enzyme khoảng thích hợp Từ đó, tìm hiệu suất tối ưu cho thủy phân cellulose sở mô hình thực nghiệm thống kê mô tả tương hợp kết thực nghiệm Tiến hành thực hiện: Áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm cho trình thủy phân cellulose, bố trí thí nghiệm với đối tượng mẫu cellulose thay đổi từ 0,6 g đến 2,0 g lượng enzyme cellulase thay đổi từ ml đến 10 ml Mỗi thí nghiệm tiến hành thủy phân điều kiện giống 100 ml dung dịch đệm citrat 0,5 M (pH = 5,0) nhiệt độ ủ mẫu 45 0C (nhiệt độ thủy phân enzyme cellulase) Tại thời điểm giờ, 24 giờ,… lấy lượng mẫu định phân tích hàm lượng đường glucose theo phương pháp DNS, mẫu lặp lại lần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách cellulose từ rơm rạ 85 Trần Đình Toại, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Bá Kiên,Hoàng Thị Bích, Đỗ Trung Sỹ Hình Cellulose sau trình xử lí Cellulose sau trình xử lí có đặc điểm màu trắng đục, xốp hiệu suất đạt 40 - 45% 3.2 Khả sinh thủy phân cellulose nấm mốc Aspergillus terrius AF67 - Cấy vòng que cấy bào tử nấm mốc AF67 hoạt hóa vào 50 ml môi trường Crapeck bình tam giác 250 ml, lên men máy lắc 240 vòng/phút, 35 0C 48 Thu dịch giống - Bổ sung 5% dịch giống vào bình tam giác 1000 ml có chứa sẵn 250 ml môi trường MT2 Nuôi cấy máy lắc 240 vòng/phút 35 0C Tại thời điểm khác trình lên men: giờ, 24 giờ, 48 … tiến hành hút dịch lên men, li tâm 10 000 vòng/phút 30 phút, hút dịch đo lượng đường sinh theo phương pháp DNS Độ hấp thụ quang giai đoạn khác trình lên men đo bảng Bảng Mật độ quang giai đoạn trình lên men Thời gian (h) 24 48 72 96 Độ pha loãng - - lần 10 lần 15 lần 10 lần - Mật độ quang (OD) 0,315 0,465 0,545 0,611 120 0,645 0,478 144 168 - 0,553 0,065 Dựa vào phương trình phương trình đường chuẩn glucose y = 1,19x + 0,1996 (R2 = 0,9826) đó: y mật độ quang; x hàm lượng glucose, suy nồng độ glucose thời điểm trình lên men Bảng Nồng độ đường glucose giai đoạn trình lên men 86 Thời gian (h) 24 48 72 96 120 144 168 Nồng độ glucose (mg/ml) 0,096 0,223 1,45 3,457 5,61 2,33 0,297 0,065 Nồ ng độ g luco se (m g /m l) Nghiên cứu tối ưu hóa trình thủy phân cellulose tách từ rơm rạ thành đường tan nâm… Nồng độ glucose (mg/ml) 24 48 72 96 120 144 168 Thời gian lên men (giờ) Hình Nồng độ đường glucose giai đoạn trình lên men Kết cho thấy, nấm mốc AF67 có khả phân giải rơm rạ thành đường tan, điều kiện lên men trên, khoảng thời gian 96 lượng đường sinh nhiều 5,61 mg/ml 3.3 Lên men thu dịch enzyme Lên men 250 ml môi trường MT2 bình tam giác 1000 ml với điều kiện lên men không đổi pH = 5, nhiệt độ 35 C 5% dịch men giống, lên men khoảng 96 li tâm loại sinh khối, thu dịch dịch enzyme thô Sử dụng dịch enzyme thu cho nghiên cứu 3.4 Nghiên cứu tối ưu hóa trình thuỷ phân cellulose tạo thành glucose Tiến hành biến đổi tỉ lệ hàm lượng cellulose enzyme cellulase thô thu Đo hàm lượng glucose chọn giá trị lớn thí nghiệm, ta thu kết bảng Bảng Glucose thu theo thay đổi hàm lượngcellulose enzyme cellulose TN z1 (Cellulose, g) z2 (Enzyme, ml) y (Glucose, mg/ml) 0,6 4,0 4,397 10 11 2,0 0,6 2,0 0,6 2,0 1,3 1,3 1,3 1,65 1,65 4,0 10,0 10,0 7,0 7,0 4,0 10,0 7,0 8,5 8,5 13,101 4,765 13,849 4,650 13,619 8,691 8,863 8,710 11,394 11,279 12 1,65 8,5 11,167 87 Trần Đình Toại, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Bá Kiên,Hoàng Thị Bích, Đỗ Trung Sỹ Thực phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm, mã hóa số liệu bảng ta có bảng ma trận trực giao bậc hai biến (bảng 5) Bảng Ma trận kế hoạch thực nghiệm kết TT x0 x1 x2 x1x2 x1’ x2’ y ŷ +1 -1 -1 +1 0,3333 0,3333 4,397 4,286 +1 +1 -1 -1 0,3333 0,3333 13,101 13,205 +1 -1 +1 -1 0,3333 0,3333 4,765 4,716 +1 +1 +1 +1 0,3333 0,3333 13,849 13,635 +1 -1 0 0,3333 -0,6667 4,650 4,501 +1 +1 0 0,3333 -0,6667 13,619 13,420 +1 -1 -0,6667 0,3333 8,691 8,746 +1 +1 -0,6667 0,3333 8,863 9,175 +1 0 -0,6667 -0,6667 8,710 8,961 Sử dụng phần mềm xử lí số liệu quy hoạch thực nghiệm ngôn ngữ thuật toán FORTRAN [4] ta nhận kết sau: Phương sai tái sinh xác định từ thí nghiệm bổ sung x1 = 0,5 x2 = 0,5 với y là: 11,394; 11,279 11,167 ∑y u y= u =1 3 sts2 = ∑ (y = 11,28 u u =1 − y) = 0,0129 Trong bảng ta có: N x 'j = x 2j − x j2 = x 2j − x ∑ ε ji =1 N (1) Ta tìm phương trình hồi quy yˆ = b0' + b1 x1 + b2 x2 + b12 x1 x2 + b11 x1' + b22 x2' (2) dễ dàng đưa dạng thông thường: yˆ = b0 + b1 x1 + b2 x + b12 x1 x + b11 x12 + b22 x 22 với 88 (3) Nghiên cứu tối ưu hóa trình thủy phân cellulose tách từ rơm rạ thành đường tan nâm… b0 = b0' − b11 x12 − b22 x22 (4) Các hệ số phương trình (3.2) xác định sau N ∑x bj = ji yi i =1 N (5) ∑ x 2ji i =1 phương sai hệ số bj s = sts2 (6) N ∑ x 2ji i =1 Theo kết tính toán ta có: Hệ số bj b0’= 8,961 b1 = 4,459 b2 = 0,215 sai số xác Sb0 định Sbj 0,0378 Giá trị tbj = Sb1 = Sb2 = 0,0463 tb0 = 236,84 tb1 = 96,24 tb2 = 4,63 b12 = 0,095 b11 = 0,307 b22 = 0,05 Sb12 = 0,0567 Sb11= Sb22 = 0,0802 tb12 = 1,67 tb11 = 3,83 tb22 = 0,62 Chuẩn số Student tra bảng: tp(f) = t0,05 (2) = 4,3 Chỉ tbj > 4,3 có nghĩa tức là: b0 = b’0= 8,961 b1= 4,459 b2= 0,251 ta có phương trình hồi quy: ŷ = 8,961+ 4,459x1 + 0,215x2 Theo (7) tính giá trị (7) yˆ i đưa vào bảng Phương sai tương hợp: N ∑ (y sth2 = i − yˆ i ) N −l (8) N = l = (số hệ số có nghĩa phương trình hồi quy) sth2 = 0,0494 Ta tính F= sth2 0,0494 = = 3,836 sts2 0,0129 Giá trị tra bảng 89 Trần Đình Toại, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Bá Kiên,Hoàng Thị Bích, Đỗ Trung Sỹ Fp (f1, f2)= F0,05 (6, 2) = 19,2 F < Fp (f1, f2) Vậy phương trình hồi quy tương hợp với kết thực nghiệm Chuyển phương trình (7) từ dạng biến mã hóa biến thực sở sử dụng công thức mã hóa xj = z j − z 0j (9) ∆z j Ta được: ŷ = 0,176+ 6,37z1 + 0,072z2 (10) Căn vào (7) yˆ max = 13,635 Ta có nhận xét sau: Hai yếu tố nồng độ cellulose nồng độ enzyme ảnh hưởng đến hiệu suất trình thủy phân glucose, ảnh hưởng nồng độ cellulose (yếu tố 1) mạnh (theo giá trị hệ số thuộc yếu tố so với hệ số yếu tố thứ 2) Theo phương trình (7), cần làm tiếp thí nghiệm, theo hướng tăng x1 x2 tức nồng độ cellulose enzyme Kết thí nghiệm để chọn giá trị y cực đại sau: TN z1(g cellulose) z2 (ml enzyme) y (CGlucose mg/ml) * 2,3 14 15,388 * 2,5 15 15,867 2,6 15 15,821 * * Ở thí nghiệm ta nhận hiệu suất cao ymax = 15,867 mg/ml Chọn số liệu: Từ quy hoạch thực nghiệm bảng thí nghiệm bổ sung để vẽ đồ thị ta có bảng Bảng Xác định giá trị tối ưu cho hàm lượng glucose nhận 90 TT z1 z2 y 0,6 10 4,765 1,3 10 8,863 1,65 8,5 11,279 2.0 10 13,849 2,3 14 15,388 2,5 15 15,867 (7*) 2,6 15 15.821 Nghiên cứu tối ưu hóa trình thủy phân cellulose tách từ rơm rạ thành đường tan nâm… Ta chọn giá trị tối ưu là: ymax = 15,876 thí nghiệm số bảng y 7* 16 12 y 0 z1 Hình Đồ thị xác định giá trị tối ưu glucose thu từ trình thủy phân cellulose KẾT LUẬN Đã xác định khả thủy phân cellulose chủng A.terrius AF67 khoảng thời gian 96h cho hàm lượng enzyme cellulase cao Đã tối ưu hóa hàm lượng cellulose nồng độ enzyme tham gia phản ứng Hai yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trình thủy phân cellulose, ảnh hưởng hàm lượng cellulose mạnh TÀI LIỆU THAM KHẢO Benko Z., Andersson A., Szengyel Z., Gaspar M., Reczey K and Stalbrand H - Heat extraction of corn fiber hemicellulose, Applied Biochemistry and Biotechnology (1-2) (2007) 137-140 Sun J X and Sun R C - Isolation and characterization of cellulose from sugarcane bagasse, Journal Polymer Degradation and Stability 84 (2) 331-339 Miller G L - Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal Chem (1959) 426-428 Phạm Hồng Hải, Ngô Kim Chi - Xử lí số liệu quy hoạch thực nghiệm nghiên cứu hóa học, NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội, 2007 Ахназарова С Л., Кафаров В В - Оптимизация эксперимента в химии и химической технологии Изд “Высшая школа”, Москва, 1978 SUMMARY OPTIMIZATION OF THE CELLULOSE (FROM RICE STUBBLE/STRAW) HYDROLYSIS INTO GLUCOSE USING FUNGI ASPERGILLUS TERRIUS IN ETHANOL-BIOFUEL PRODUCTION 91 Trần Đình Toại, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Bá Kiên,Hoàng Thị Bích, Đỗ Trung Sỹ The cellulose hydrolysis into glucose using Aspergillus terrius AF67 in ethanol-biofuel production was studied By using the design of experiments with main factors (the concentrations of cellulose and enzyme) a regression equation was found Based on this equation, the influent evaluation of two above factors on hydrolysis yield was implemented and with some supplementary experiments, the maximal yield was found: ymax = 15.876 mg/ml Keywords Aspergillus terrius AF67 92