ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM VŨ THỊ ANH ĐÀO NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) ĐỊA PHƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM VŨ THỊ ANH ĐÀO NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) ĐỊA PHƯƠNG Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có công bố công trình khác Tác giả Vũ Thị Anh Đào i Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành công trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn CN Nguyễn Ích Chiến (Phòng thí nghiệm Di truyền học Công nghệ gen - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên) giúp đỡ trình hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô giáo, Cán Khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn động viên, khích lệ gia đình, bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian làm luận văn Tác giả Vũ Thị Anh Đào ii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid DNA Axit deoxyribonucleic AFLP Fragment Length Polymorphism ( Sự đa hình chiều dài phân đoạn ADN khuếch đại) ASTT Áp suất thẩm thấu CS Cộng EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid Kb Kilobase LEA Late Embryogeneis Abundant protein (Protein tổng hợp với số lượng lớn giai đoạn cuối trình phát triển phôi) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa hình nhân ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Sự đa hình chiều dài phân đoạn ADN cắt hạn chế) SDS Sodium Dodecyl Sulphat SDS-PAGE Phương pháp điện di gel polyacrylamid có chứa SDS SSR Simple Sequence Repeats TBE Tris - Boric acid - EDTA TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tris Trioxymetylaminometan NAA Naphthyl acetic acid (Axit naphthyl acetic) iii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Những chữ viết tắt iii Mục lục .iv Danh mục bảng vii Danh mục hình .ix MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm thực vật học hóa sinh học hạt đậu tương 1.2 Nghiên cứu khả phản ứng đậu tương đốivới hạn 1.2.1 Sự phản ứng đậu tương hạn giai đoạn hạt nảy mầm .4 1.2.2 Sự phản ứng đậu tương hạn giai đoạn non .7 1.3 Sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đa dạng di truyền mức phân tử 1.3.1 RAPD 1.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền RAPD 10 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Vật liệu nghiên cứu 12 2.1.1.Vật liệu thực vật .12 2.1.2 Các hoá chất thiết bị 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Phương pháp xác định sinh trưởng rễ mầm thân mầm 13 2.2.2 Phương pháp hóa sinh .14 2.2.2.1 Phân tích hoá sinh giai đoạn hạt tiềm sinh 14 2.2.2.2 Đánh giá khả chịu hạn thông qua phân tích số tiêu hoá sinh giai đoạn hạt nảy mầm 15 iv Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.3 Phương pháp sinh lý 17 2.2.3.1 Đánh giá khả chịu hạn giai đoạn non phương pháp gây hạn nhân tạo .17 2.2.3.2 Xác định hàm lượng proline 18 2.2.4 Phương pháp sinh học phân tử 19 2.2.4.1 Phương pháp tách ADN tổng số từ mầm đậu tương 19 2.2.4.2 Phản ứng RAPD 19 2.2.4.3 Phân tích số liệu RAPD 19 2.2.5 Phương pháp xử lý kết tính toán số liệu 20 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Kết phân tích tính đa dạng kiểu hình giống đậu tương nghiên cứu .21 3.1.1.Đặc điểm hình thái, kích thước khối lượng hóa sinh hạt 16 giống đậu tương 21 3.1.1.1 Hình thái, kích thước khối lượng hạt .21 3.1.1.2 Hàm lượng protein, lipit .23 3.1.2 Khả phản ứng 16 giống đậu tương giai đoạn hạt nảy mầm 26 3.1.2.1 Kích thước rễ mầm thân mầm 26 3.1.2.2 Hoạt độ enzym α - amilase hàm lượng đường hạt nảy mầm giống đậu tương tác động sorbitol % 28 3.1.2.3 Hoạt độ enzym protease hàm lượng protein hạt nảy mầm giống đậu tương tác động sorbitol % 33 3.1.2.4 Nhận xét .38 3.1.3 Khả phản ứng hạn 16 giống đậu tương giai đoạn non 39 3.1.3.1 Tỷ lệ thiệt hại 39 3.1.3.2 Chỉ số chịu hạn tương đối 41 3.1.3.3 Hàm lượng protein prolin 42 3.1.3.4 Nhận xét .46 3.1.4 Sự phân bố giống đậu tương nghiên cứu 46 v Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2 Kết phân tích tính đa dạng di truyền mức phân tử ADN giống đậu tương nghiên cứu .48 3.2.1 Kết tách chiết ADN tổng số .48 3.2.2 Phân tích đa hình ADN kỹ thuật RAPD .49 3.2.3 Nhận xét kết phân tích đa hình ADN hệ gen 16 giống đậu tương địa phương 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .61 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 vi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Nguồn gốc giống đậu tương nghiên cứu .13 Bảng 2.2 Trình tự nucleotit 10 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu .20 Bảng 3.1 Hình dạng, màu sắc, kích thước, khối lượng 1000 hạt 16 giống đậu tương địa phương 22 Bảng 3.2 Hàm lượng lipit protein 16 giống đậu tương (% KL khô) 24 Bảng 3.3 Chiều dài rễ mầm giống đậu tương nghiên cứu 26 Bảng 3.4 Chiều dài thân mầm giống đậu tương 27 Bảng 3.5 Hoạt độ enzyme α – amylase giai đoạn hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% 16 giống đậu tương 29 Bảng 3.6 Hàm lượng đường tan giai đoạn hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% 16 giống đậu tương 31 Bảng 3.7 Tương quan hoạt độ enzyme –amylase hàm lượng đường tan 33 Bảng 3.8 Hoạt độ protease giai đoạn hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% 34 Bảng 3.9 Hàm lượng protein giai đoạn hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% .36 Bảng 3.10 Tương quan hoạt độ enzyme protease hàm lượng protein .37 Bảng 3.11 Tỷ lệ thiệt hại 16 giống đậu tương giai đoạn non 40 Bảng 3.12 Chỉ số chịu hạn tương đối giống đậu tương 42 Bảng 3.13 Hàm lượng prolin giống đậu tương điều kiện hạn nhân tạo 44 Bảng 3.14 Hàm lượng protein giống đậu tương điều kiện hạn nhân tạo 45 Bảng 3.15 Hệ số khác giống đậu tương 46 Bảng 3.16 Hàm lượng độ tinh ADN 16 giống đậu tương nghiên cứu .48 Bảng 3.17 Tổng số phân đoạn ADN nhân 16 giống đậu tương phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 50 vii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.18 Tính đa hình phân đoạn ADN nhân 10 mồi ngẫu nhiên .51 Bảng 3.19 Thông tin tính đa hình (PIC) 16 giống đậu tương 52 Bảng 3.20 Giá trị tương quan kiểu hình (r) .58 Bảng 3.21 Hệ số tương đồng giống đậu tương nghiên cứu 59 viii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1 Hạt giống đậu tương nghiên cứu 21 Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hàm lượng protein lipit 16 giống đậu tương .25 Hình 3.3 Hình ảnh đậu tương trước xử lý hạn .39 Hình 3.4 Biểu đồ tỉ lệ thiệt hại giống đậu tương nghiên cứu 41 Hình 3.5 Sơ đồ quan hệ giống đậu tương dựa phản ứng trước tác động hạn 47 Hình 3.6 Kết điện di ADN tổng số giống đậu tương gel agarose 0,8% 48 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M1 53 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M8 53 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M3 54 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M5 .54 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M2 .55 Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M4 .55 Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M6 .56 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M9 .56 Hình 3.15 Kết điện di sản phẩm RAPD gel agarose 1,8% với mồi M7 mồi M10 .57 Hình 3.16 Biểu đồ hình giống đậu tương nghiên cứu theo kiểu phân nhóm UPGMA .59 ix Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Đậu tương loại trồng chiến lược nhiều quốc gia giới Hạt đậu tương có hàm lượng chất dinh dưỡng cao: 40% - 50% protein, 18% -25% lipit, chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan, metionin, xystein, lozin ) nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K ), nguồn lượng cần thiết cho sống người Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi khuẩn cố định đạm nên đậu tương thường trồng luân canh với lúa ngô để tăng vụ cải tạo đất bạc màu Với giá trị to lớn mà đậu tương trồng phổ biến nhiều nơi từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới, từ 550 vĩ Bắc đến 550 vĩ Nam, từ vùng thấp mực nước biển vùng cao 2000m so với mực nước biển với diện tích khoảng 74,4 triệu [3], [8] Trong đó, chúng trồng nhiều Mỹ, Braxin, Argentina, Trung Quốc, Ấn Độ Ở Việt Nam đậu tương gieo trồng vùng nông nghiệp nước Các giống đậu tương nước ta phong phú gồm giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến tập đoàn giống đậu tương địa phương Các giống đa dạng phong phú kiểu hình kiểu gen, nguồn nguyên liệu để chọn tạo giống đậu tương cho suất chất lượng phù hợp với mục tiêu chọn giống [8] Đậu tương tương đối mẫm cảm với điều kiện ngoại cảnh thuộc vào nhóm chịu hạn Vì đánh giá đa dạng di truyền giống đậu tương địa phương để tạo sở cho công tác lai tạo giống đề xuất biện pháp nâng cao tính chịu hạn vấn đề quan tâm nghiên cứu Hiện có nhiều phương pháp ứng dụng phân tích đa dạng di truyền giống trồng nói chung đậu tương nói riêng RFLP, AFLP, SSR, RAPD Các phương pháp phát huy hiệu mà khắc phục nhược điểm phương pháp chọn giống truyền thống hiệu sàng lọc cao, nhanh, tin cậy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Trong số phương pháp kể RAPD phương pháp sử dụng rộng rãi phương pháp dễ thực tốn mà đánh giá đa dạng di truyền mối quan hệ di truyền mức độ phân tử Chỉ thị RAPD cho độ đa hình cao nên sử dụng để nghiên cứu đa dạng sinh học, liên kết tính trạng số lượng, đánh giá sai khác hệ gen dòng chọn lọc ứng dụng chọn tạo giống trồng Chính việc nghiên cứu đa dạng di truyền mức ADN phản ứng hạn giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn non sở khoa học để đề xuất việc chọn giống đậu tương có khả chịu hạn góp phần bảo tồn, phát triển nguồn gen đậu tương, tuyển chọn giống đậu tương thích hợp làm vật liệu chọn giống vấn đề quan tâm nghiên cứu Xuất phát từ lý chọn đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống đậu tương (Glycine Max (L.) Merrill) địa phương” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định đa dạng di truyền giống đậu tương địa phương mức kiểu hình mức phân tử ADN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khảo sát đa dạng kiểu hình giống đậu tương thông qua đặc điểm hình thái, hóa sinh - Xác định hàm lượng protein, hàm lượng đường, hoạt độ enzym amylase, enzym protease giai đoạn hạt nảy mầm - Phân tích phản ứng hạn giống đậu tương điều kiện hạn nhân tạo - Sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên để nhân đoạn ADN từ ADN hệ gen giống đậu tương địa phương - Thiết lập sơ đồ hình xác định khoảng cách di truyền giống đậu tương nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOÁ SINH HẠT ĐẬU TƢƠNG Đậu tương có tên khoa học (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có NST 2n = 40, có nguồn gốc từ Trung Quốc loại trồng hàng năm không thấy xuất loài hoang dại Các giống đậu tương địa phương nước ta du nhập từ Trung Quốc từ lâu [3] Cây đậu tương trồng cạn thu hạt, gồm phận chính: rễ, thân, lá, hoa, hạt Rễ đậu tương rễ cọc, gồm rễ rễ phụ, rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả cố định đạm không khí tạo thành đạm dễ tiêu [3] Các công trình nghiên cứu cho thấy giống có khả cộng sinh có đủ nốt sần thường làm cho hàm lượng protein cao, trồng đậu tương có tác dụng cải tạo đất Thân đậu tương thân thảo, phân cành dạng bụi, đậu tương kép với chét, có 4-5 chét Đậu tương tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt trắng, hoa mọc từ nách ngọn, đậu tương thuộc loại ráp, thẳng cong, có nhiều lông chín có màu vàng xám Hạt đậu tương nội nhũ mà có lớp vỏ bao quanh phôi lớn Hạt có hình tròn bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số hạt màu vàng Khối lượng hạt đa dạng dao động từ 20-400 mg/ hạt Màu sắc rốn hạt giống khác nhau, biểu đặc trưng giống Cây đậu tương có loại hình sinh trưởng: sinh trưởng hữu hạn sinh trưởng vô hạn, thời gian sinh trưởng thường chia nhóm chín sớm, trung bình muộn Theo thời gian sinh trưởng Piper Mosse cho giống đậu tương chín sớm (75-90 ngày), giống chín sớm (90-100 ngày), giống chín trung bình (100-110 ngày), loại chín muộn trung bình (110-120 ngày), giống chín muộn (130-140 ngày), giống chín muộn (140-150 ngày) thời gian sinh trưởng yếu tố quan trọng để lựa chọn trồng luân canh xen vụ Đậu tương tương Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Trong tập đoàn giống đậu tương có giống trồng vào vụ hè, có giống trồng vào vụ đông, có giống trồng vụ xuân hè có giống trồng thích hợp với vụ thu đông [8] Đậu tương trồng lấy hạt, cung cấp dầu quan trọng lấy dầu Hiện qua thống kê FAO cho thấy từ năm 1980 trở lại sản lượng đậu tương giới tăng lên lần chủ yếu nhờ vào tăng suất diện tích Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, suất bình quân tăng cao 23 tạ/ha Các nước sản xuất đậu tương đứng đầu giới: Mỹ, Brazin, Argentina Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương giới [8] Ở Việt Nam, đậu tương trồng vùng nông nghiệp, vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn 46,6%, đồng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% vùng Duyên hải miền Trung 1,6% [8] Cây đậu tương chiếm vị trí quan trọng nông nghiệp nước ta, đặc biệt vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển Tuy nhiên việc sản xuất đậu tương nước chưa đầu tư cao, suất thấp, nghiên cứu cải tiến đặc điểm nông học giống địa phương tạo giống có suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái vùng khác phương pháp truyền thống kết hợp với đại đáp ứng yêu cầu thực tiễn đặt chiến lược quan trọng phát triển đậu đỗ nước ta 1.2 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHẢN ỨNG CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG ĐỐI VỚI HẠN 1.2.1 Sự phản ứng đậu tƣơng hạn giai đoạn hạt nảy mầm Cây họ đậu nói chung, đậu tương nói riêng có nhu cầu nước cao loại khác chịu hạn Đó hạt đậu tương có hàm lượng protein lipit cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500-530 kg Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nước Trong trình nảy mầm nhu cầu nước đậu tương cao 50%, ngô 30%, lúa 26% [8] Khi nghiên cứu đặc tính chịu hạn đậu tương phương diện sinh lí di truyền cho thấy, đặc tính liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hoá keo nguyên sinh chất, đặc điểm trình trao đổi chất Tính chịu hạn đậu tương mang tính đa gen Chúng thể nhiều khía cạnh khác nhau: phát triển nhanh rễ, tính chín sớm tương đối chất di truyền giống có khả sử dụng nước tiết kiệm trình sinh trưởng phát triển Trong môi trường khô hạn, chống lại nước nhanh chóng bù lại phần nước bị nhờ hoạt động rễ điều chỉnh ASTT tế bào Ngoài ra, chống chịu hạn biến đổi hình thái có nhiều lông, lớp cutin dày, cuộn lại thành ống để giảm thoát nước Phân tích thành phần hóa sinh chịu hạn, nghiên cứu cho gặp hạn có tượng tăng lên hàm lượng ABA, hàm lượng proline, nồng độ ion K+, loại đường, hoạt độ enzym, axit hữu giảm phức hợp CO2, protein axit nucleic [1], [12] Sự tổng hợp tích luỹ chất diễn nhanh tế bào bị nước, với hai chức (1) điều chỉnh ASTT nhờ khả giữ nước lấy nước vào tế bào (2) ngăn chặn xâm nhập ion Na + chất Chúng thay vị trí nước nơi xảy phản ứng hóa sinh, tương tác với lipit protein màng, ngăn chặn phá hủy màng phức protein màng Quá trình liên quan đến biểu gen, hàng loạt gen nghỉ hoạt hóa tổng hợp chất cần thiết để chống lại khô hạn [1] Wan Li (2006), nghiên cứu Arabidopsis thaliana kết luận rằng, gặp hạn tích lũy ABA tăng cường lạc tác giả chứng minh NAA có tác dụng tăng cường tổng hợp ABA dẫn đến biểu gen AhNCED1 [31] Nhiều nghiên cứu sử dụng tác động ngoại cảnh, thổi khô, hạn sinh lý để khảo sát phản ứng hạn giống trồng giai đoạn hạt nảy mầm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Enzyme chất xúc tác sinh học có hiệu cao Trong giai đoạn hạt nảy mầm trình chuyển hoá chất diễn mạnh, hoạt động enzyme diễn mạnh Ở giai đoạn hai enzym có vai trò quan trọng enzyme  - amylase enzym protease Enzyme α-amylase enzym quan trọng trình thủy phân tinh bột thành dextrin mantose Sự tăng hoạt độ enzyme α-amylase làm tăng hàm lượng đường tan Nguyễn Thị Thúy Hường (2005) thấy rằng, đậu tương hàm lượng đường tan liên quan trực tiếp đến khả chống chịu trồng Đường tan chất tham gia điều chỉnh ASTT tế bào Sự gia tăng hoạt độ enzyme α-amylase làm tăng hàm lượng đường tan làm tăng ASTT tăng khả phản ứng hạn [5] Hà Tiến Sỹ (2007) nghiên cứu giống đậu tương địa phương tỉnh Cao Bằng rút nhận xét, hoạt độ enzyme α-amylase hàm lượng đường tan có mối tương quan thuận chặt chẽ, liên quan đến khả nảy mầm hạt sinh trưởng mầm Giữa giống có thay đổi hoạt độ enzyme α-amylase hàm lượng đường tan khác liên quan đến khả phản ứng hạn giống [13] Khi nghiên cứu lúa, lạc [12], [7] tác giả rút kết luận tương tự Trong điều kiện thiếu nước, enzym protease hoạt động cách tích cực phân giải protein để tạo polypeptit ngắn tan môi trường nội bào làm tăng ASTT tăng khả phản ứng hạn Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên cứu số giống đậu tương có khả chịu nóng hạn nhận xét rằng, hoạt độ enzym protease trình nảy mầm hạt tất giống nghiên cứu đa dạng, có hoạt tính cao, có khả phân giải hoàn toàn protein dự trữ tạo nguyên liệu để tổng hợp protein cho thể [6] Đinh Thị Ngọc (2008) nghiên cứu số giống đậu tương Tây Nguyên rút nhận xét giai đoạn hạt nảy mầm, điều kiện bổ sung sorbitol nồng độ 7%, hoạt độ protease hàm lượng protein tan biến đổi theo xu hướng tăng dần Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đạt cực đại vào ngày thứ bắt đầu giảm giai đoạn ngày hạn Hàm lượng protein protease có mối tương quan thuận Trong giai đoạn hạt nảy mầm 1, 3, 5, ngày tuổi không xử lý sorbitol hoạt độ protease hàm lượng protein thấp so với hoạt độ protease hàm lượng protein hạt nảy mầm xử lý sorbitol 7% Như vậy, áp suất thẩm thấu cao có ảnh hưởng rõ lên hoạt độ protease [11] Một số nghiên cứu đối tượng khác như: lúa, đậu xanh, lạc cho thấy điều kiện hạn sinh lý có gia tăng hoạt độ enzym protease có mối tương quan thuận hàm lượng protein hoạt độ protease thể khả phản ứng hạn khác giống 1.2.2 Sự phản ứng đậu tƣơng hạn giai đoạn non Hạn tác động lên theo hai hướng là: làm tăng nhiệt độ gây nước Nước yếu tố giới hạn trồng, vừa nguyên liệu khởi đầu vừa sản phẩm trung gian cuối trình chuyển hoá sinh học Nước môi trường để phản ứng trao đổi chất xảy ra, việc cung cấp nước cho trồng hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn trồng mục tiêu trình tạo giống chống chịu thường xuyên quan tâm Thiếu nước trước tiên ảnh hưởng đến cân nước cây, từ ảnh hưởng đến chức sinh lý khác quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng cuối ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển Mức độ thiếu hụt nước lớn ảnh hưởng xấu đến trình sinh trưởng phát triển cây, thiếu nước nhẹ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường trình già hoá tế bào bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương chết Đối với thực vật nói chung trồng nói riêng, hạn ảnh hưởng tới trình sinh trưởng, phát triển non giai đoạn hoa Theo thông báo Chen Murant (2002), sức chống chịu thực vật tăng lên chuyển gen mã hóa enzyme tham gia vào đường sinh tổng hợp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn proline tế bào [21] Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tích lũy proline tăng từ 10 đến 100 lần thực vật tác động ASTT Nguyễn Thị Thúy Hường (2005) gây hạn nhân tạo đậu tương địa phương tỉnh Sơn La nhận thấy, có tăng nhanh hàm lượng prolin giảm hàm lượng protein giống nghiên cứu, hàm lượng proline giống cao so với đối chứng Khả chịu hạn đậu tương phụ thuộc tuyến tính vào hàm lượng proline Điều đó, chứng tỏ đậu tương có phản ứng cách tích cực trước thay đổi điều kiện môi trường [5] Hà Tiến Sỹ (2007) nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tương địa phương tỉnh Cao Bằng, Đinh Thị Ngọc (2008) nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tương trồng vùng Tây Nguyên rút nhận xét tương tự [11], [13] Kết nhận nghiên cứu đối tượng khác lúa, lạc [12], [7] 1.3 SỬ DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở MỨC PHÂN TỬ 1.3.1 RAPD Kỹ thuật RAPD kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài phân đoạn ADN nhân nhờ mồi ngẫu nhiên có kích thước 10bp, hai nhóm nghiên cứu Williams CS (1990) [32] Welsh McClelland (1991) [33] đồng thời xây dựng Đây kỹ thuật phát thị di truyền dựa phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Kỹ thuật RAPD phương pháp tương đối đơn giản đánh giá hệ gen thực vật, khắc phục nhược điểm phương pháp chọn giống truyền thống mà góp bảo tồn nguồn gen trồng nâng cao hiệu chọn lọc Các yếu tố cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: ADN khuôn (DNA template); Đoạn mồi (primer): sử dụng mồi mồi oligonucleotit có trật tự nucleotit ngẫu nhiên có chiều dài khoảng 10 nucleotit, C + G chiếm 60%; ADN - polymerase (Taq polymerase): hoạt động Taq polymerase phụ thuộc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vào Mg2+, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến tính ADN; Bốn loại deoxyribonucleotit triphotphat (dNTP): ATP, TTP, CTP, GTP; Ion Mg2+ Phản ứng RAPD tiến hành qua giai đoạn: (1) Giai đoạn biến tính ADN: nhiệt độ 950C khoảng 30-60 giây làm cho hai mạch khuôn ADN tách (2) Giai đoạn tiếp hợp mồi: nhiệt độ hạ xuống 32-400C mồi tiếp hợp bám vào sợi ADN khuôn (3) Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ nâng lên 720 C đoạn mồi bắt cặp với mạch đơn kéo dài với tham gia Taq polymerase Sau chu kỳ gồm ba giai đoạn trên, phân đoạn ADN khuôn nhân lên thành hai, đoạn ADN nhân chu kỳ lại coi ADN khuôn cho chu kỳ nhân Vậy sau k chu kỳ nhân tạo 2k đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu RAPD thực từ 40 - 45 chu kỳ Như vậy, thành phần bước phản ứng RAPD dựa sở phản ứng PCR khác chỗ nồng độ Mg2+ thành phần phản ứng cao hơn, mồi đơn ngắn (10bp) tiếp hợp nhiều vị trí ADN kết nhân số đoạn ADN từ hai phân đoạn ADN trở lên Mỗi đoạn ADN nhân có kích thước 100-5000bp Sử dụng kỹ thuật RAPD không cần biết trình tự đoạn ADN cần nghiên cứu, quy trình tiến hành nhanh, cần lượng nhỏ ADN khuôn cần mồi sử dụng với loài khác Kỹ thuật RAPD có ưu điểm chỗ sử dụng mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit, trình nhân ADN ngẫu nhiên Đoạn mồi bám vào vị trí có trình tự nucleotit bổ sung phân tử ADN hệ gen Với đặc điểm ngắn nên xác suất đoạn mồi có điểm gắn phân tử ADN khuôn lớn Tùy vào nhóm, loài thực vật hay vi sinh vật mà đoạn mồi ngẫu nhiên thiết kế chuyên dụng Theo lý thuyết, số lượng ADN nhân phụ thuộc vào độ dài, vị trí đoạn mồi, kích thước cấu trúc ADN genome Thông thường đoạn mồi ngẫu nhiên tạo từ - 10 sản phẩm nhân [32] Kết sau điện di sản phẩm RAPD phát khác phổ phân đoạn ADN nhân Sự khác gọi tính đa hình Hiện tượng đa hình đoạn ADN nhân ngẫu nhiên xuất Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn