ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM /// Phạm Ngọc Long NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM /// Phạm Ngọc Long NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Chuyên ngành Mã số : Sinh học thực nghiệm : 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nghiêm Ngọc Minh Thái Nguyên - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời cảm ơn Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nghiêm Ngọc Minh Trưởng Phòng Công nghệ sinh học Môi trường – Viện Công Nghệ sinh Học tận tình hướng dẫn dìu dắt trình nghiên cứu hoàn thành luận án Trong trình nghiên cứu vửa qua, nhận giúp đỡ bảo tận tình PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà anh chị Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, đặc biệt Ths Nguyên Bá Hữu, CN Nguyễn Văn Bắc, KS Cung Thị Ngọc Mai, người giúp đỡ trình thực luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Khoa sau đại học, khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp – Trường đại học Sư phạm – Đại Học Thái Nguyên lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho hoàn thành khóa luận Bên cạnh đó, xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để hoàn thành luận văn Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2009 Phạm Ngọc Long Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-Pentaclorodibenzo-p-dioxin 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic acid bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid LB Luria - Bertani PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCDDs Polychlorinated dibenzo-p-dioxins PCDFs Polychlorinated dibenzofurans PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN Sự ô nhiễm 2,4,5-T 2,4-D Đặc điểm tính chất 2,4,5-T 2,4-D 2.1 Chất diệt cỏ 2,4,5-T 2.2 Chất diệt cỏ 2,4-D Ảnh hƣởng 2,4,5-T, 2,4-D đến môi trƣờng ngƣời 3.1 Ảnh hưởng 2,4,5-T 2,4-D tới môi trường 3.2 Ảnh hưởng 2,4,5-T, 2,4-D đến người Một số phƣơng pháp xử lý chất độc hóa học có 2,4,5-T 2,4-D 4.1 Phương pháp xử lý chất độc hóa học hóa học, lý học, học 4.2 Phương pháp phân hủy sinh học 10 Khả phân hủy 2,4,5-T 2,4-D số vi sinh vật 15 Phân loại vi sinh vật 21 6.1 Phân loại theo phương pháp cổ điển 21 6.2 Phương pháp phân loại sinh học phân tử 22 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 25 1.1 Vật liệu 25 1.2 Hóa chất 25 1.3 Thiết bị, máy móc 25 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.1 Môi trường nuôi cấy 26 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long 2.1.1 Môi trường SH1 dịch (g/l) 26 2.1.2 Môi trường SH1 thạch 26 2.1.3 Môi trường muối khoáng 26 2.1.4 Môi trường LB dịch 27 2.1.5 Môi trường LB thạch 27 2.1.6 Nước muối sinh lý 27 2.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bioreactor hiếu khí 27 2.2.1 Nuôi cấy làm giàu vi sinh vật 27 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 27 2.3 Nghiên cứu hình thái tế bào chủng vi khuẩn 28 2.3.1 Nhuộm Gram 28 2.3.2 Quan sát hình thái tế bào kính hiển vi điện tử quét 28 2.4 Phương pháp phân tích khả phân hủy 2,4,5-T 29 2.5 Phân loại vi khuẩn dựa so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA 29 2.5.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi sinh vật 29 2.5.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA phương pháp PCR 30 2.5.3 Điện di kiểm tra gel agarose 31 2.5.4 Tách dòng đoạn gen mã hóa 16S rRNA 31 2.5.5 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E.coli 31 2.5.6 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony–PCR) 32 2.5.7 Tách DNA plasmid theo Kit hãng Fermentas 33 2.5.8 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA 34 2.5.9 Xây dựng phát sinh chủng loại 34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 Nuôi cấy, phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bioreactor hiểu khí 35 1.1 Nuôi cấy, làm giàu tập đoàn vi sinh vật 35 1.2 Phân lập chủng vi khuẩn 37 Đặc điểm phân loại chủng HR5.1 38 2.1 Hình thái tế bào 38 2.2 Phân loại dựa trình tự gen mã hóa 16S rRNA 39 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 39 2.2.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA chủng HR5.1 kỹ thuật PCR 40 2.2.3 Tách dòng gen 16S rRNA vector pBT 41 2.2.4 Xác định trình tự gen 16S rRNA chủng HR5.1 43 Nghiên cứu số đặc điểm chủng HR5.1 47 3.1 Khả phát triển chủng HR5.1 PAH 47 3.2 Khả phân hủy 2,4,5-T chủng HR5.1 49 3.2.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy có chứa 2,4,5-T lên phát triển chủng HR5.1 49 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ 2,4,5-T lên phát triển chủng HR5.1 50 3.2.3 Khả phân hủy 2,4,5-T chủng vi khuẩn HR5.1 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long MỞ ĐẦU Trong chiến tranh xâm lược Mỹ tiến hành Việt Nam, 100 triệu lít chất diệt cỏ chứa 2,4,5-T, 2,4-D 2,3,7,8 TCDD rải xuống 20% diện tích miền Nam Theo công bố Stellman cộng tạp chí Nature năm 2003 20 chất diệt cỏ khác sử dụng Chu kỳ bán hủy dioxin chất tương tự dioxin dài, có đến vài chục năm hàng trăm năm [15],[42] Qua điều tra nghiên cứu nhiều quan khoa học công nghệ Việt Nam quốc tế cho thấy, đất sân bay Đà Nẵng Biên Hòa độ tồn lưu PCDD, PCDF, 2,4,5-T 2,4-D cao 2,4,5-T, 2,4-D có hàm lượng lên tới hàng vài trăm nghìn đến vài triệu µg/kg đất Ngoài lượng không nhỏ chất DCP, TCP PAH xác định mẫu đất khu vực bị nhiễm độc Nghiên cứu áp dụng phương pháp sinh học để khử độc “điểm nóng” Đà Nẵng thu kết khả quan Tuy nhiên để xử lý điểm ô nhiễm cục chất diệt cỏ/dioxin với thời gian ngắn cần có công nghệ phân hủy sinh học phù hợp Hiện nay, phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học tiến hành xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin công nghệ tăng cường sinh học bioreactor hiếu khí kỵ khí Trong trình xử lý, điều khiển điều kiện môi trường độ ẩm, nhiệt độ vai trò vi sinh vật có bioreactor quan trọng Để tăng hiệu hoàn thiện công nghệ cần tăng thêm hiểu biết đặc điểm vi sinh vật có bioreactor, vai trò vi sinh vật phân hủy chất độc bổ sung vào bioreactor Nhằm đáp ứng yêu cầu thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu khả phân hủy 2,4,5-T đặc điểm phân loại chủng vi khuẩn phân lập từ bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin“ thực Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Luận án thực đƣợc nội dung nghiên cứu sau  Làm giầu vi sinh vật từ mẫu đất bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin  Phân lập chủng vi khuẩn có khả phát triển 2,4,5-T 2,4-D  Nghiên cứu số đặc điểm chủng vi khuẩn phân lập  Phân loại định tên chủng vi khuẩn chọn lựa  Xác định khả sử dụng 2,4,5-T chủng vi khuẩn nghiên cứu Luận án thực phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học phần đề cấp Viện Khoa học công nghệ Việt Nam: “Nghiên cứu xử lý tẩy độc số hợp chất hữu chứa clo phương pháp hóa học sinh học tiên tiến“ PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà chủ trì Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học PHẦN Phạm Ngọc Long TỔNG QUAN Sự ô nhiễm 2,4,5-T 2,4-D Từ năm 1961 đến năm 1971 quân đội Mỹ rải 100 triệu lít chất diệt cỏ xuống nhiều vùng miền Trung Nam Việt Nam [42] Các chất diệt cỏ sử dụng bao gồm: chất da cam, chất trắng, chất xanh lục, chất xanh lam, chất tím, chất hồng, chất gọi tên theo mầu đánh dấu thùng phuy chứa chúng, thùng khoảng 250l [42] Các chất diệt cỏ thường hỗn hợp hai chất 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid) 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) với tỷ lệ 50:50 (Bảng 1) Dioxin tạp chất sinh trình sản xuất 2,4,5-T Hàm lượng dioxin chất diệt cỏ khác nhau, ước tính số lượng dioxin chứa chất diệt cỏ mà Mỹ dùng chiến tranh Việt Nam từ 170 - 1000 kg [42], [15] Bảng 1.1 Thành phần hóa học chất diệt cỏ quân đội Mỹ sử dụng chiến tranh Việt Nam [42] Sử dụng trong năm Số lƣợng ƣớc tính rải (lít) 961-1081 g/l acid tương đương 1961-1965 503.121; 413,852 Chất n-Butylester xanh 2,4,5-T Giống chất hồng Chưa rõ, rải thời gian với chất hồng 31.026 Chất tím 1033 g/l acid tương đương 1962-1965 1.892.773 Tên chất Thành phần hoá chất Chất hồng 60% - 40% n-Butyl: isobutylester 2,4,5-T 50%n-Butylester 2,4,D Độ đậm đặc tƣơng đƣơng 30% Butylester Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long 2,4,5-T 20% isobutyl ester 2,4,5-T Chất da cam (1) 50% n-Butyl ester 2,4-D 1033 g/l acid tương đương 1965-1970 45.677.937 (có thể bao gồm chất da cam) Chất da cam (2) 50% n-Butyl ester 2,4-D 910 g/l acid tương đương Sau 1968 (?) Chưa rõ gửi sang Việt Nam là: 3.591.000 Chất trắng Khối lượng acid bản: 21,1% triisopropanolamine muối 2,4-D 5,7% picloram Khối lượng acid: 240,2 g/l 2,4-D 64,9 g/l picloram 1966-1971 20.556.525 Chất xanh (dạng bột) Acid dimethylarsinic Natri cacodylat Acid: 65% tương đương 1962-1964 25.650 Chất xanh (dạng dịch) 21% Natri cacodylat+ acid cacodylic chiếm 26% tổng lượng acid tương đương 1964-1971 4.715.731 50% n-Butyl ester 2,4,5-T 50% n-Butyl ester 2,4,5-T Muối: 70% tương đương Khối lượng acid: 360,3 g/l Tại quân cũ Mỹ trước nơi tàng trữ nạp chất diệt cỏ lên máy bay sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng, Phù Cát có độ tồn lưu chất độc mức cao cao, lên tới hàng trăm nghìn ppt [15] Đặc biệt sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng hàm lượng 2,3,7,8-TCDD chiếm 90% tổng độ độc, nhiều mẫu đất 2,3,7,8-TCDD > 99% tất độ độc PCDD Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long PCDF Các kết phân tích phát lượng lớn 2,4,5-T, 2,4-D, dichlorphenol, trichlorophenol số lượng nhỏ hydrocarbon thơm đa nhân mẫu đất khu vực nhiễm độc [15] Ngoài ra, ô nhiễm 2,4,5-T 2,4-D Việt Nam từ nguồn khác Tuy nhiên, khuôn khổ luận văn nghiên cứu vi sinh vật có nguồn gốc từ nguồn ô nhiễm chất diệt cỏ chiến tranh Đặc điểm tính chất 2,4,5-T 2,4-D 2.1 Chất diệt cỏ 2,4,5-T 2,4,5-T tên gọi tắt acid 2,4,5-trichlorophenoxyaxetic Công thức hóa học C8H5O3Cl3, khối lượng phân tử 255,49 g/mol Công thức cấu tạo thể hình 1.1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo 2,4,5-T 2,4,5-T tinh khiết có dạng tinh thể rắn, không mùi, từ không màu đến vàng nâu nhạt, tan nước, độ hòa tan nước 30 oC 238 mg/kg, tan tốt dung môi hữu Tỷ trọng 1,8 g/cm3 20oC Nhiệt độ nóng chảy khoảng 154oC -158oC [43] 2,4,5-T sử dụng chất diệt cỏ có tác dụng làm rụng cây, phát triển vào cuối thập niên 40 kỷ XX sử dụng nông nghiệp 2,4,5-T chất có độc tính mạnh, gây ung thư, dị thai, rối loạn nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long tiết, nhiễm độc tuyến sinh dục nhiều bệnh nghiêm trọng khác Sơ đồ tổng quát trình tổng hợp 2,4,5-T trình bày hình 1.2 i ii Hình 1.2 Sơ đồ tổng hợp 2,4,5-T i : Nhiệt độ với NaOH CH3OH áp suất nước ii: ClCH2COOH NaOH 140oC Trong trình tổng hợp 2,4,5-T từ nguyên liệu ban đầu 1,2,4,5tetrachlorobenzene, cần phải có nhiệt độ từ 225 đến 3000C áp suất dao động khoảng từ 400 đến 1500 psi Tuy nhiên, điều kiện sản phẩm phụ 2,3,7,8-TCDD tạo theo tác giả, hàm lượng 2,3,7,8-TCDD có 2,4,5-T vào khoảng từ 0,07 tới 6,2 ppm (hình 1.3) [40] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Hình 1.3 Cơ chế tạo sản phẩm phụ 2,3,7,8-TCDD trình tổng hợp chất diệt cỏ 2,4,5-T 2.2 Chất diệt cỏ 2,4-D Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) có công thức hóa học C8H6Cl2O3 công thức cấu tạo thể hình 1.4 Hình 1.4 Cấu trúc 2,4-D 2,4-D có khối lượng phân tử 221,04g/mol, dạng tinh khiết 2,4-D dạng bột, có mầu trắng đến mầu vàng Nhiệt dộ nóng chảy 140,5oC nhiệt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long độ bay 160oC Ở nhiệt độ 25oC, 2,4-D hòa tan cới hàm lượng 900mg/l 2,4-D thuốc diệt cỏ tổng hợp từ auxin, thuốc diệt cỏ tán rộng Hiện chủ yếu 2,4-D sử dụng hỗn hợp pha trộn với loại thuốc diệt cỏ khác, có vai trò chất tăng cường tác dụng Nó sử dụng rộng rãi khắp giới Ảnh hƣởng 2,4,5-T, 2,4-D đến môi trƣờng ngƣời 3.1 Ảnh hƣởng 2,4,5-T 2,4-D tới môi trƣờng Quân đội Mỹ rải chất diệt cỏ chứa 2,4,5-T, 2,4-D tạp chất dioxin lên khoảng 27% tổng diện tích Việt Nam Khoảng triệu rừng bị tác động chất diệt cỏ [17] Tác dụng tức thời chất diệt cỏ làm cho loài rừng bị trụi hết lá, nhiều loài bị chết, môi trường sinh cảnh bị thay đổi nhanh chóng [17] Tại vùng rừng bị rải lặp lặp lại nhiều lần, hệ sinh thái rừng bị phá hủy hoàn toàn nơi chưa có mọc tự nhiên khu rừng Mã Đà (Đồng Nai), thung lũng A Lưới (Thừa Thiên Huế) v.v.[17] Chất diệt cỏ sau phun xuống tích tụ đất mà phân tán lớp nước mặt, nước ngầm, không khí, tích tụ thực vật, gây nhiều cố hiểm họa cho môi trường từ tác động dây chuyền đến người, động thực vật vi sinh vật Hậu làm suy thoái hệ sinh thái tự nhiên Các chất giết chết động vật, thực vật, vi sinh vật nhiều loại sinh vật khác làm cho chúng phục hồi lại được, làm thay đổi hoàn toàn cấu trúc quần xã chủng loại động vật, thực vật [4], [22] Chất độc hóa học ngấm vào đất, tích tụ lại thể thực vật nên bị phân hủy số yếu tố ánh sáng mặt trời, tia cực tím, nhiệt độ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Các chất tồn dạng hỗn hợp yếu tố môi trường nhiều chưa thuận lợi cho trình phân hủy sinh học tự nhiên Chiến tranh kết thúc 30 năm, lượng chất độc hóa học lại đất lớn, đặc biệt 2,4,5-T, 2,4-D, dioxin điểm nóng Tại quân cũ Mỹ sân bay Đà Nẵng, Biên hòa Phù Cát bị ô nhiễm 2,4,5-T, 2,4-D, dioxin v.v mức độ cao Nghiên cứu chọn lựa áp dụng phương pháp thích hợp để tấy độc “Điểm nóng” nhiệm vụ cần thiết đặt cho nhà khoa học công nghệ cần quan tâm giải 3.2 Ảnh hƣởng 2,4,5-T, 2,4-D đến ngƣời Ước tính có 3181 làng Việt Nam bị rải trực tiếp, với khoảng 4,8 triệu người tiếp xúc với chất độc hóa học Mỹ rải xuống [42] Theo báo cáo Viện Y khoa Hoa Kỳ năm 2002, có 37 bệnh người liên quan đến dioxin cấp độ khác ban clo, ung thư mô mềm, ung thư dạng Hodkin, ung thư dạng không Hodkin, số bệnh thần kinh cấp tính, gai đốt cột sống, sẩy thai, dị tật bẩm sinh v.v [32] Trong số người tiếp xúc với chất độc hóa học Nhiều người bị phơi nhiễm mắc phải bệnh nguy hiểm số bệnh di truyền sang hệ sau [16] Một số phƣơng pháp xử lý chất độc hóa học có 2,4,5T 2,4-D 4.1 Phƣơng pháp xử lý chất độc hóa học hóa học, lý học, học Phương pháp chôn lấp hay áp dụng cho chất thải nguy hại, rác thải, kể chất độc hóa học Ưu điểm phương pháp giá thành rẻ chất Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long độc nằm hố chôn lấp không phân hủy nên chất độc hóa học nguồn ô nhiễm tiềm tàng cho môi trường người Các phương pháp vật lý quang hóa, sử dụng tia cực tím, hay dùng áp suất cao có hiệu Theo kết công bố cho thấy sử dụng phương pháp quang hóa, 80% chất độc bị phân hủy tác động chùm tia cực tím cường độ 20W/cm3 nhiệt độ 20oC ngày Tuy nhiên phương pháp áp dụng cho lớp đất mỏng bề mặt dầy vài milimet [14], [41] Phương pháp thiêu đốt nhiều nước lựa chọn để xử lý dioxin Nguyên lý phương pháp dùng nhiệt độ cao để phân hủy dioxin đạt hiệu đến 99,99%, phương pháp có nhược điểm giá thành xử lý cao, chưa kể đến kinh phí đào, vận chuyển đất đến lò đốt tạo sản phẩm phụ gây ô nhiễm thứ cấp [18] Phương pháp declo hóa oxy hóa nghiên cứu áp dụng với chất chứa clo 2,3,7,8-TCDD Phương pháp cho kết tốt, thường tạo hợp chất clo độc [19], [24],[14] Nhược điểm phương pháp hóa học không kiểm soát sản phẩm tạo thành, sản phẩm thường gây ô nhiễm thứ cấp Các phương pháp xử lý học, vật lý, hóa học nói chung có nhược điểm tốn không triệt để, dễ gây ô nhiễm thứ cấp cho môi trường Phương pháp xử lý ô nhiễm công nghệ sinh học đặc biệt ý tính an toàn kinh tế Phương pháp nhiều phòng thí nghiệm giới nghiên cứu, phát triển 4.2 Phƣơng pháp phân hủy sinh học Phương pháp xử lý công nghệ sinh học mẻ đặc biệt ý giá thành hạ thân thiện với môi trường Phương pháp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long phân hủy sinh học không đòi hỏi điều kiện phức tạp nhiệt độ cao, áp suất, trình xúc tác v.v Phương pháp tuân theo qui luật chuyển hóa thuộc chu trình cacbon, nitơ, photpho v.v không gây ô nhiễm thứ cấp, an toàn, thân thiện với môi trường hệ sinh thái, chi phí thấp phù hợp với điều kinh tế nước ta Mặt khác, diện tích đất bị nhiễm độc Việt Nam lớn nên việc ứng dụng phương pháp tẩy độc khác hóa học lý học khó có khả thực [2] Tuy nhiên nhược điểm phương pháp đòi hỏi thời gian dài Quá trình làm sinh học thực quy mô lớn nhỏ khác điều kiện hiếu khí kị khí Việc tẩy độc phân hủy sinh học tiến hành riêng rẽ kết hợp với phương pháp khác Sau vài tháng vài năm chất ô nhiễm hoàn toàn loại bỏ phương pháp phân hủy sinh học [9] Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học theo hai hướng làm giàu sinh học kích thích sinh học [9] Làm giàu sinh học (Bioaugmentation) phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật địa làm giàu vi sinh vật sử dụng chất độc từ nơi khác, chí vi sinh vật cải biến mặt di truyền bổ sung vào địa điểm ô nhiễm Kích thích sinh học (Biostimulation) trình thúc đẩy phát triển hoạt động trao đổi chất tập đoàn vi sinh vật địa có khả sử dụng chất độc hại thông qua việc thay đổi yếu tố môi trường pH, độ ẩm, nồng độ O2, chất dinh dưỡng, chất, chất xúc tác v.v Việc bổ sung vi sinh vật vào địa điểm ô nhiễm đòi hỏi chi phí cao nhiều không mang lại hiệu cao nhiều nguyên nhân cạnh tranh vi sinh vật, độ độc môi trường, thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, chất đa lượng vi lượng cần cho hoạt động phân hủy vi sinh vật [15] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Ở Việt Nam, biện pháp chôn lấp tích cực để phân hủy chất diệt cỏ/dioxin nghiên cứu áp dụng thành công quy mô pilot trường Chôn lấp tích cực kết hợp phân hủy sinh học, cô lập, hấp phụ chôn lấp Đặng Thị Cẩm Hà cộng tiến hành nghiên cứu thử nghiệm phân hủy sinh học lô xử lý 0,5m3; 1,5m3; 10m3 100m3 đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin Đà Nẵng [2], năm 2009 nhóm nghiên cứu xử lý 3000 m2 đất nhiêm chất độc hóa học sân bay Biên Hòa công nghệ phân hủy sinh học Các công thức xử lý phân hủy sinh học bổ sung dạng chế phẩm khác cung cấp chất dinh dưỡng, chất cần thiết cho trình oxy hóa, khử loại bỏ clo chất vi lượng chất thêm cho tập đoàn vi sinh vật tham gia vào trình tẩy độc điều kiện kị khí hiếu khí Số lượng nhóm vi sinh vật trước, suốt trình xử lý theo dõi Các chủng nấm, vi khuẩn hiếu khí, kị khí, xạ khuẩn sử dụng để nghiên cứu khả phân hủy 2,3,7,8-TCDD Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật truyền thống kỹ thuật sinh học phân tử điểm DGGE kỹ thuật sinh học phân tử khác tiến hành để nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật đồng thời phân lập chủng vi sinh vật, định tên loài vi sinh vật sử dụng dioxin, dibenzofuran, hydrocabon thơm đa nhân phân lập từ nguồn ô nhiễm kể Độ tồn lưu dioxin ô nhiễm khác xác định phương pháp miễn dịch sắc ký khối phổ Phương pháp miễn dịch phân tích dioxin EPA Hoa Kỳ tiến hành theo EnviroGrard TM kít [2] Sau tám năm nghiên cứu, nhà khoa học Việt Nam thu kết khả quan Số lượng vi sinh vật dị dưỡng đất nhiễm độc trước xử lý không cao, dao động từ 102 - 105 MPN/g hay CFU/g [2] Những nhóm vi sinh vật khác tồn loại đất với số lượng đa dạng thấp Trong trình xử lý qui mô khác nhau, số lượng vi sinh vật tăng đáng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long kể từ 1.000-10.000 lần [2] Sau hai năm xử lý cách bổ sung chế phẩm Slow-D, DHS1, DHS2 hợp chất, vi lượng, thành phần xúc tác, chất hoạt động bề mặt sinh học, phối hợp với thay đổi hàm lượng oxy thay đổi độ ẩm, hiệu trình xử lý “chôn lấp tích cực” (kết hợp cô lập, hấp phụ, chôn lấp phân hủy sinh học) rõ rệt Trong tất lô xử lý, sau đến 24 tháng, từ 50 đến 70% tổng độ độc bị giảm [2] Trong trình xử lý quy mô, hình thức khác nhau, năm qua, cán nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ sinh học môi trường Viện Công nghệ sinh học phân lập số chủng vi sinh có khả vật sử dụng dibenzofuran, dioxin, chất diệt cỏ 2,4,5-T, 2,4-D PAH từ đất nhiễm chất độc hóa học sân bay Đà Nẵng Các vi khuẩn phân lập gồm Bacillus sp BU3, Pseudomonas sp BDN15, Pseudomonas sp SETDN1, Terrabacter sp DMA, Rhodoccocus sp HDN3 v.v Một số chủng nấm sợi chủ yếu thuộc chi Aspergillus Aspergillus sp FDN30, Aspergillus sp FDN22, Aspergillus sp FDN20 Xạ khuẩn phân lập không nhiều đã, phân lập số chủng thuộc chi Streptomyces chủng Streptomyces sp XKDN11, Streptomyces sp XKDN12 [1], [2], [5], [8], [10], [11] Việc định tên xác định khả phân hủy chất ô nhiễm chủng vi sinh vật góp phần làm sáng tỏ chế hiệu phân hủy sinh học diễn trình xử lý công nghệ phân hủy sinh học triển khai để xử lý khử độc qui mô 3.000 m3 “điểm nóng” Biên Hòa, Đồng Nai Kết phân tích vi sinh vật hóa học cho thấy chế phẩm sử dụng trường thành công việc kích thích trình phân hủy sinh học chỗ Tất chế phẩm, hợp chất tìm sản xuất Việt Nam chủ động giảm giá thành xử lý đất nhiễm dioxin quân cũ Hơn nữa, phương pháp chôn lấp tích cực có tính Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... nhiễm ch t di t cỏ do chiến tranh 2 Đặc điểm và t nh ch t của 2,4 ,5- T và 2,4 -D 2.1 Ch t di t cỏ 2,4 ,5- T 2,4 ,5- T là t n gọi t t của acid 2,4 ,5- trichlorophenoxyaxetic Công thức hóa học là C8H5O3Cl3, khối lượng phân t 255 ,49 g/mol Công thức cấu t o được thể hiện ở hình 1.1 Hình 1.1 Công thức cấu t o 2,4 ,5- T 2,4 ,5- T tinh khi t có dạng tinh thể rắn, không mùi, t không màu đến vàng nâu nh t, tan t trong... rộng rãi trên khắp thế giới 3 Ảnh hƣởng của 2,4 ,5- T, 2,4 -D đến môi trƣờng và con ngƣời 3.1 Ảnh hƣởng của 2,4 ,5- T và 2,4 -D t i môi trƣờng Quân đội Mỹ đã rải ch t di t cỏ chứa 2,4 ,5- T, 2,4 -D và t p ch t dioxin lên khoảng 27% t ng diện t ch Vi t Nam Khoảng hơn 2 triệu ha rừng đã bị t c động của ch t di t cỏ [17] T c dụng t c thời của ch t di t cỏ là làm cho các loài cây rừng bị trụi h t lá, r t nhiều loài... trước, trong su t quá trình xử lý đã được theo dõi Các chủng nấm, vi khuẩn hiếu khí, kị khí, xạ khuẩn đã được sử dụng để nghiên cứu khả năng phân hủy 2,3 ,7,8-TCDD Phương pháp nghiên cứu vi sinh v t truyền thống và kỹ thu t sinh học phân t điểm chỉ như DGGE và các kỹ thu t sinh học phân t khác đã được tiến hành để nghiên cứu t p đoàn vi sinh v t đồng thời phân lập các chủng vi sinh v t, định t n loài vi. .. biến về m t di truyền bổ sung vào các địa điểm ô nhiễm Kích thích sinh học (Biostimulation) là quá trình thúc đẩy sự ph t triển và ho t động trao đổi ch t của t p đoàn vi sinh v t bản địa có khả năng sử dụng các ch t độc hại thông qua vi c thay đổi các yếu t môi trường như pH, độ ẩm, nồng độ O2, ch t dinh dưỡng, các cơ ch t, các ch t xúc t c v.v Vi c bổ sung vi sinh v t vào các địa điểm ô nhiễm đòi hỏi... phân hủy ch t di t cỏ/ dioxin đã được nghiên cứu và áp dụng thành công trên quy mô pilot hiện trường Chôn lấp t ch cực là sự k t hợp của phân hủy sinh học, cô lập, hấp phụ và chôn lấp Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm phân hủy sinh học đối với các lô xử lý 0,5m3; 1,5m3; 10m3 và 100m3 đ t nhiễm ch t di t cỏ chứa dioxin t i Đà Nẵng [2], năm 2009 nhóm nghiên cứu đã xử lý hơn 3000... Chiến tranh k t thúc đã hơn 30 năm, lượng ch t độc hóa học còn lại trong đ t r t lớn, đặc bi t là 2,4 ,5- T, 2,4 -D, dioxin t i các điểm nóng T i các căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở sân bay Đà Nẵng, Biên hòa và Phù C t bị ô nhiễm 2,4 ,5- T, 2,4 -D, dioxin v.v ở mức độ cao Nghiên cứu chọn lựa và áp dụng các phương pháp thích hợp để t y độc ngay các Điểm nóng” là nhiệm vụ r t cần thi t đ t ra cho các nhà khoa học và. .. quá trình xử lý ở các quy mô, hình thức khác nhau, trong những năm qua, các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ sinh học môi trường Vi n Công nghệ sinh học đã phân lập được m t số chủng vi sinh có khả năng v t sử dụng dibenzofuran, dioxin, ch t di t cỏ 2,4 ,5- T, 2,4 -D và PAH t đ t nhiễm ch t độc hóa học t i sân bay Đà Nẵng Các vi khuẩn đã được phân lập gồm Bacillus sp BU3, Pseudomonas sp BDN 15, ... văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long PCDF Các k t quả phân t ch còn ph t hiện m t lượng lớn 2,4 ,5- T, 2,4 -D, dichlorphenol, trichlorophenol và m t số lượng nhỏ hydrocarbon thơm đa nhân trong các mẫu đ t tại khu vực nhiễm độc [ 15] Ngoài ra, ô nhiễm 2,4 ,5- T và 2,4 -D ở Vi t Nam còn t các nguồn khác Tuy nhiên, trong khuôn khổ luận văn này chúng t i chỉ nghiên cứu về vi sinh v t có nguồn gốc t nguồn ô nhiễm. .. g/l 2,4 -D và 64,9 g/l picloram 1966-1971 20 .55 6 .52 5 Ch t xanh (dạng b t) Acid dimethylarsinic và Natri cacodylat Acid: 65% t ơng đương 1962-1964 25. 650 Ch t xanh (dạng dịch) 21% Natri cacodylat+ acid cacodylic t nh t chiếm 26% t ng lượng acid t ơng đương 1964-1971 4.7 15. 731 50 % n-Butyl ester 2,4 ,5- T 50 % n-Butyl ester 2,4 ,5- T Muối: 70% t ơng đương Khối lượng acid: 360,3 g/l T i các căn cứ quân sự cũ của. .. Ch t độc hóa học ngấm vào trong đ t, t ch t lại trong cơ thể thực v t nên t bị phân hủy bởi m t số yếu t như ánh sáng m t trời, tia cực t m, nhi t độ Số hóa bởi Trung t m Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Các ch t này t n t i dưới dạng hỗn hợp và các yếu t môi trường nhiều khi chưa thuận lợi cho các quá trình phân hủy sinh học t