VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI GEN VRRA, CAPA, PAGA CỦA VI KHUẨN THAN (BACILLUS ANTHRACIS) BẰNG PHẢN ỨNG MULTIPLEX - PCR Người hướng dẫn : PGS TS NGHIÊM NGỌC MINH Sinh viên thực : ĐINH THỊ HIỀN Lớp : 11 - 02 HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN! Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nghiêm Ngọc Minh, người thầy tâm huyết tạo điều kiện cho thực tập phòng Công nghệ sinh học Môi trường thuộc Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam Thầy tận tình hướng dẫn, dành thời gian trao đổi, định hướng động viện, nhắc nhở dìu dắt trình nghiên cứu, học tập hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể anh chị phòng Công nghệ sinh học Môi trường, đặc biệt ThS Nguyễn Thị Hoài Thu KS Phạm Thùy Linh giúp đỡ, bảo tận tình cho suốt trình học tập nghiên cứu hoàn thành khóa luận Bên cạnh đó, xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội với Ban lãnh đạo viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu trường viện Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ vật chất lẫn tinh thần để hoàn thành tốt khóa luận Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên Đinh Thị Hiền năm 2015 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………………i DANH MỤC HÌNH……………………………………………………………………ii DANH MỤC BẢNG………………………………………………………………… iii ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh than 1.1.1 Sơ lược bệnh than 1.1.2 Các dạng bệnh than 1.1.2.1 Bệnh than thể da 1.1.2.2 Bệnh than thể tiêu hóa họng - quản 1.1.2.3 Bệnh than thể hô hấp 1.1.2.4 Bệnh than thể màng não 1.1.3 Bệnh than chiến tranh sinh học 1.2 Trực khuẩn than 1.2.1 Lịch sử phát 1.2.2 Đặc điểm B anthracis 1.2.2.1 Hình thể 1.2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 10 1.2.2.3 Sức đề kháng 12 1.2.2.4 Kháng nguyên 12 1.2.2.5 Độc lực 13 1.2.2.6 Khả gây bệnh cho người động vật 14 1.2.3 Đặc điểm hệ gen B anthracis 15 1.2.3.1.Gen chromosome 15 1.2.3.2.Gen plasmid 16 1.3 Các phương pháp chẩn đoán B anthracis 17 1.3.1 Phương pháp trực tiếp 17 1.3.2 Phương pháp nuôi cấy 18 1.3.3 Các phương pháp chẩn đoán nhanh 18 i 1.3.4 Phương pháp PCR – Multiplex PCR .19 PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 2.1 Vật liệu, trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 22 2.1.1 Vật liệu 22 2.1.2 Hóa chất, máy móc thiết bị 22 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 26 2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 26 2.2.2.1 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR .26 2.2.2.2 Tách chiết DNA tổng số vi khuẩn than 27 2.2.2.3 Kỹ thuật PCR đơn mồi (Polymerase Chain Reaction) 28 2.2.2.4 Kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex PCR) 30 2.2.2.5 Phương pháp điện di DNA gel agarose 32 2.2.2.6 Phương pháp tinh DNA từ gel agarose 33 2.2.2.7 Phương pháp giải trình tự .34 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết thiết kế cặp mồi 35 3.2 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu vi khuẩn than (Bacillus anthracis) 35 3.3 Kết khuếch đại gen vrrA, capA, pagA B anthracis kỹ thuật PCR 36 3.3.1 Gen VrrA 37 3.3.2 Gen pagA .37 3.3.3 Gen CapA 38 3.4 Tinh sản phẩm PCR .39 3.5 Xác định trình tự so sánh ngân hàng gen 39 3.6 Multiplex PCR phát đồng thời gen vrrA, capA, pagA .42 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT µl, ml, l Microliter, milliliter, liter B anthracis Bacillus anthracis Bp Base pair (cặp base) dH2O Deion water DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EF Edema Factor Epp Eppendorf kDa Kilo Dalton LF LethalFactor mg, g Milligram, gram NCBI National Center for Biotechnology Information PA Protective Antigen PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid TAE Tris - Acetate – EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase iii DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1: Biểu bệnh than thể da người Hình 1.2: Trung thất dãn hít phải bào tử than Hình 1.3: Não người bị nhiễm bệnh than Hình 1.4: B anthracis bào tử 10 Hình 1.5: Bào tử B anthracis 10 Hình 1.6: Khuẩn lạc B anthracis môi trường thạch máu cừu 11 Hình 1.7: Khuẩn lạc B anthracis môi trường Sodium bicarbonat agar 12 Hình 1.8 Vị trí gen pagA plasmid pOX1 17 Hình 2.1: Sơ đồ bước thực trình nghiên cứu .26 Hình 3.1: Điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA tổng số vi khuẩn than 36 Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR gen vrrA từ vi khuẩn than 37 Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm PCR gen pagA từ vi khuẩn than 38 Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR gen capA từ vi khuẩn than 38 Hình 3.5: Sản phẩm PCR sau tinh 39 Hình 3.6: Trình tự gen PagA.POX1của vi khuẩn than 40 Hình 3.7: Trình tự gen CapA.POX2 vi khuẩn than 41 Hình 3.8: Trình tự gen VrrA vi khuẩn than 42 Hình 3.9: Điện di đồ sản phẩm khuếch đại đồng thời gen từ vi khuẩn than phản ứng Multiplex PCR 43 iv DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1: Danh mục hóa chất sử dụng 22 Bảng 2.2: Các dung dịch đệm sử dụng phòng thí nghiệm 23 Bảng 2.3: Danh mục máy móc thiết bị sử dụng 24 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR đơn mồi 29 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR đơn mồi 30 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng Multiplex – PCR 31 Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi thiết kế để khuếch đại gen vi khuẩn than 35 Bảng 3.2: Bảng so sánh độ tương đồng gen pagA.POX1 B anthracis nghiên cứu với số chủng B anthracis ngân hàng gen giới (NCBI) 40 Bảng 3.3: Bảng so sánh độ tương đồng gen CapA.POX2 B anthracis nghiên cứu với số chủng B anthracis ngân hàng gen giới (NCBI) 41 Bảng 3.4: Bảng so sánh độ tương đồng gen VrrA B anthracis nghiên cứu với số chủng B anthracis ngân hàng gen giới (NCBI) 42 v PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thiết kế cặp mồi Dựa trình tự gen cần phát vi khuẩn than ngân hàng gen NCBI kết hợp với công cụ thiết kế mồi NCBI Chúng lựa chọn cặp mồi phù hợp, đảm bảo gen VrrA, capA, pagA có kích thước khác nhận biết rõ ràng điện di gel agarose Các cặp mồi chọn có chiều dài, nhiệt độ nóng chảy mồi tương tự nhau, tượng kẹp tóc, tự bắt cặp mồi tượng bắt cặp bổ sung mồi xuôi với mồi ngược (bảng 3.1) Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi thiết kế để khuếch đại gen vi khuẩn than Gen Tổng số Trình tự (5‘-3‘) base CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA-F Tm CCTCGCGCACTTCTTTTTCT-R 59.13 AAATGGAGCACGGCTTCTGA-F 59.96 20 PagA AGCCTGTATCCACCCTCACT-R 59.96 TGACGATGACGATGGTTGGT-F 59.39 20 CapA GCTTCCTGTCTAGGACTCGG-R hairpin Kích thước (bp) 59.76 20 VrrA ∆G >0 222 >0 751 ≤0 610 59.26 3.2 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu vi khuẩn than (Bacillus anthracis) Với mẫu vi khuẩn than cung cấp Học Viện Quân Y, tiến hành tách chiết DNA tổng số theo nguyên tắc: 35 Phá vỡ màng tế bào màng nhân vi khuẩn Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu protein, polysaccharide Tủa DNA làm DNA Quy trình tách chiết thực mục 2.2.2.1 Sản phẩm DNA tổng số thu sau tách chiết điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết trình bày hình 3.1 sau: Hình 3.1: Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số vi khuẩn than 1,2,3: DNA tổng số chủng vi khuẩn than Ba1.4, Ba1.2, Ba1.1 Kết điện di hình 3.1 cho thấy, DNA tổng số vi khuẩn than giếng sáng, rõ đủ điều kiện để làm khuôn nhân gen cho kĩ thuật PCR Multiplex PCR Chúng sử dụng chủng vi khuẩn than Nên chọn DNA tổng số mẫu Ba1.4 cho nghiên cứu 3.3 Kết khuếch đại gen vrrA, capA, pagA B anthracis kỹ thuật PCR Chúng thực phản ứng PCR đơn mồi khuếch đại gen vrrA, capA, pagA để kiểm tra có mặt gen quan tâm độ đặc hiệu cặp mồi cho việc nhân gen đơn lẻ Phản ứng PCR đơn mồi giúp tìm nồng độ thành phần, 36 chu kỳ nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen, từ phục vụ cho việc đưa quy trình Multiplex PCR thích hợp để phát đồng thời gen Thành phần phản ứng PCR chu kì nhiệt trình bày mục 2.2.2.3 Khi có sản phẩm PCR, tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR phương pháp điện di gel agarose 2% Kết thể hình 3.2, hình 3.3 hình 3.4 3.3.1 Gen VrrA Gen VrrA (222bp) nằm chromosome B anthracis mã hóa cho protein có tên glutamine, trọng lượng phân tử khoảng 30kDa Chúng sử dụng cặp mồi bảng 2.4 để nhân gen VrrA với thành phần phản ứng bảng 2.5 Sản phẩm PCR đoạn DNA rõ nét, đặc hiệu, có kích thước khoảng 222 bp thể điện di đồ hình 3.2 Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR gen vrrA từ vi khuẩn than M: Thang DNA chuẩn 100bp,1: Đối chứng âm, 2: Sản phẩm PCR khuếch đại gen vrrA 3.3.2 Gen pagA Sử dụng cặp mồi tương ứng cho gen pagA bảng 3.1 tính toán nồng độ thích hợp cho thành phần phản ứng PCR Kết khuếch đại gen pagA thể hình 3.3 sau: 37 Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm PCR gen pagA từ vi khuẩn than M: Thang DNA chuẩn 100 bp,1: Đối chứng âm,2: Sản phẩm PCR khuếch đại gen pagA Kết hình 3.3 cho thấy, gen pagA (751 bp) xuất băng vạch đặc hiệu, rõ đẹp băng vạch phụ nào, có kích thước theo tính toán lý thuyết thiết kế mồi 3.3.3 Gen CapA Với trình tự cặp mồi trình bày bảng 3.1, phản ứng PCR giúp khuếch đại gen đích tương ứng tạo lý thuyết băng DNA có kích thước khoảng 610 bp Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR gen capA từ vi khuẩn than M: Thang DNA chuẩn 100 bp,1: Đối chứng âm, 2: Sản phẩm PCR khuếch đại gen CapA 38 Kết hình 3.4 cho thấy, gen CapA (610 bp) xuất băng vạch đặc hiệu, cặp mồi sử dụng đặc hiệu chu trình nhiệt mà đưa thích hợp 3.4 Tinh sản phẩm PCR Sau chạy PCR, mẫu thu bị lẫn tạp primer, dNTP dư Những chất lẫn tạp có khả ảnh hưởng đến phản ứng giải trình tự Để loại bỏ chất lẫn tạp, tiến hành tinh sản phẩm PCR kit tinh Bioneer Sau đó, sản phẩm thu kiểm tra gel agarose 2%, kết thể hình 3.5 sau: Hình 3.5: Sản phẩm PCR sau tinh M: Thang DNA 100 bp; 1: gen vrrA, 2: gen capA, 3: gen pagA 3.5 Xác định trình tự so sánh ngân hàng gen Sau tinh sản phẩm PCR điện di kiểm tra, tiến hành xác định trình tự nucleotide gen máy ABI PRISMR 3100 Avant Genetic Analvzer Sau có trình tự, tiến hành so sánh mức độ tương đồng gen vrrA, capA, pagA vi khuẩn than nghiên cứu với kết công bố ngân hàng gen 39 giới (NCBI) Kết đọc trình tự thể hình 3.6 (trình tự gen pagA), bảng 3.2, hình 3.7 (trình tự gen capA), bảng 3.3 hình 3.8 (trình tự gen vrrA), bảng 3.4 sau: Gen pagA.POX1 gtgatttcga aaaggttaca ggacggattg ataagaatgt atcaccagag gcaagacacc 61 cccttgtggc agcttatccg attgtacatg tagatatgga gaatattatt ctctcaaaaa 121 atgaggatca atccacacag aatactgata gtcaaacgag aacaataagt aaaaatactt 181 ctacaagtag gacacatact agtgaagtac atggaaatgc agaagtgcat gcgtcgttct 241 ttgatattgg tgggagtgta tctgcaggat ttagtaattc gaattcaagt acggtcgcaa 301 ttgatcattc actatctcta gcaggggaaa gaacttgggc tgaaacaatg ggtttaaata 361 ccgctgatac agcaagatta aatgccaata ttagatatgt aaatactggg acggctccaa 421 tctacaacgt gttaccaacg acttcgttag tgttaggaaa aaatcaaaca ctcgcgacaa 481 ttaaagctaa ggaaaaccaa ttaagtcaaa tacttgcacc taataattat tatccttcta 541 aaaacttggc gccaatcgca ttaaatgcac aa Hình 3.6: Trình tự gen pagA.POX1của vi khuẩn than Bảng 3.2: Bảng so sánh độ tương đồng gen pagA.POX1 B anthracis nghiên cứu với số chủng B anthracis ngân hàng gen giới (NCBI) Tên trình tự gen tương đồng với gen Mã số Tỉ lệ tương pagA.POX1 NCBI đồng (%) Bacillus anthracis strain PAG220314plasmid KJ631748.1 99% CP006743.1 99% STT pXO1 protective antigen (pag) gene, partial cds Bacillus anthracis strain SVA11 plasmid pXO1, complete sequence Bacillus anthracis strain 34F2 plasmid pXO1 protective antigen (pag) gene, partial cds JQ798178.1 99% Bacillus anthracis strain A0248 plasmid CP00599.1 99% AF306782.1 99% pXO1, complete sequence Bacillus anthracis isolate BA1024 protective antigen (pag) gene, complete cds 40 Từ bảng 3.2 trên, ta thấy trình tự gen pagA.POX1 chủng B anthracis nghiên cứu có độ tương đồng cao (99%) với số chủng B anthracis có trình tự gen công bố ngân hàng gen giới NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Gen CapA.POX2 gattgttaat cgttacggta cagattatgt ttttcgtcat gtttcgccat atttaaaaaa 61 ctcagattac gtaagtggga atttcgaaca tcctgttttg ttagaagata aaaagaatta 121 tcaaaaagca gataagaata ttcacttaag tgcaaaagaa gaaacagtta aggcagtaaa 181 agaagccgga tttacagtat taaatttggc gaataaccat atgacggatt atggtgctaa 241 gggaactaaa gatacaataa aggcctttaa agaagctgat cttgactatg tgggtgctgg 301 tgaaaatttc aaagatgtaa aaaatattgt gtatcaaaat gtaaatggtg ttagggttgc 361 tactcttgga tttacagatg catttgtagc aggagctatt gcaacgaaag aacaaccagg 421 ttcgttaagt atgaacccag atgtattact taagcaaatt agtaaggcaa aggatcctaa 481 aaaaggtaat gctgatcttg tcgtagtaaa tacgcactgg ggggaagaat acgataataa 541 accgagtcct agacaggaag c Hình 3.7: Trình tự gen CapA.POX2 vi khuẩn than Bảng 3.3: Bảng so sánh độ tương đồng gen CapA.POX2 B anthracis nghiên cứu với số chủng B anthracis ngân hàng gen giới (NCBI) Tên trình tự gen tương đồng với genCapA.POX2 Mã số NCBI Tỉ lệ tương đồng (%) Bacillus anthracis strain HYU01 plasmid pXO2, complete sequence CP008848.1 100% Bacillus anthracis strain SVA11 plasmid pXO2, complete sequence CP006744.1 100% Bacillus anthracis strain A16 plasmid pXO2, complete sequence CP001972.1 100% Bacillus anthracis strain A0248 plasmid pXO2, complete sequence CP001597.1 100% Bacillus anthracis strain CDC 684 plasmid pXO2, complete sequence CP001214.1 100% STT 41 Gen VrrA ctgtaagccc tgtcgtcgaa cagtacggtc ccattatgcg taacctacca agcatcgtta 61 aaatcctcac ctctggaaaa agtacggaag aaaatccaac cgaagatcaa actgaagacc 121 taacagaaaa ggttgaagta gcaactccac ctcctccaca aaaaaaaaga aaaagaaaaa 181 aaatggtgat tgagccagtt atagaaaaag aagtgcgcga gg Hình 3.8: Trình tự gen VrrA vi khuẩn than Bảng 3.4: Bảng so sánh độ tương đồng gen VrrA B anthracis nghiên cứu với số chủng B anthracis ngân hàng gen giới (NCBI) STT Tên trình tự gen tương đồng với Mã số Tỉ lệ tương genVrrA NCBI đồng (%) Bacillus anthracis strain A16R , complete CP001974.1 100% L48554.1 100% L48553.1 100% L48552.1 99% genome Bacillus anthracis (strain Vollum) VrrA gene, complete cds Bacillus anthracis (strain Steme) VrrA gene, complete cds Bacillus anthracis (strain Ames) VrrA gene, complete cds Từ bảng 3.2, bảng 3.3 bảng 3.4 trên, nhận thấy rằng: Mức độ tương đồng gen VrrA, capA, vi khuẩn than (B anthracis) có mức tương đồng cao 100% gen pagA 99% so với số chủng công bố ngân hàng gen giới NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Như vậy, nghiên cứu hoàn toàn thống với công bố nước 3.6 Multiplex PCR phát đồng thời gen vrrA, capA, pagA Sau thực phản ứng PCR đơn mồi để tìm nồng độ tối ưu thành phần, chu kỳ nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen, thực phản ứng Multiplex PCR nhằm phát đồng thời gen vrrA, capA, pagA vi khuẩn than 42 Phản ứng Multiplex PCR nghiên cứu phản ứng PCR sử dụng đồng thời cặp mồi gen VrrA, capA, pagA để khuếch đại nhiều phân đoạn DNA khuôn ống PCR Phản ứng cho kết nhanh, xác, độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, tiết kiệm công sức lao động đặc biệt giảm tiêu hao vật tư, hóa chất Sản phẩm khuếch đại phản ứng Multiplex PCR tiến hành kiểm tra gel agarose 2% Hình 3.9: Điện di đồ sản phẩm khuếch đại đồng thời gen từ vi khuẩn than phản ứng Multiplex PCR M: Thang DNA 100 bp 1: Đối chứng âm 2: Multiplex PCR gen vi khuẩn than Kết hình 3.9 cho thấy gen VrrA (222 bp), gen pagA (751 bp) capA (610 bp) xuất băng vạch đặc hiệu, rõ đẹp, băng vạch phụ nào, có kích thước theo tính toán lý thuyết thiết kế mồi Như vậy, phản ứng Multiplex PCR giúp phát đồng thời gen vrrA, capA, pagA vi khuẩn than ống phản ứng 43 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã tách chiết thành công DNA tổng số vi khuẩn than Đã thiết kế thành công cặp mồi phục vụ cho việc phát nhanh vi khuẩn than dựa vào gen vrrA, capA, pagA Đã nhân dòng xác định trình tự gen vrrA (222 bp), capA (610 bp), pagA (751 bp) vi khuẩn than Đã phát đồng thời gen VrrA, capA, pagA vi khuẩn than phản ứng Multiplex PCR KIẾN NGHỊ Tạo kit Multiplex PCR phát đồng thời gen vrrA, capA, pagA vi khuẩn than phục vụ cho việc chẩn đoán điều trị vi khuẩn than gây bệnh 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Đình Bính, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Hoàng Ngọc Hiển, Nguyễn Thái Sơn, Lê Thu Hồng (2004) Phân lập phân loại vi khuẩn Bacillus anthracis từ bệnh nhân mắc bệnh than Việt Nam Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống NXB KHKT, tr 42 – 45 Ngô Đình Bính, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Xuân Cảnh, Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Trịnh Thị Ngọt, Hoàng Đạo Phấn, Đỗ Ngọc Khuê (2003) Phát vi khuẩn gây bệnh than Bacillus anthracis phương pháp sinh học phân tử Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003 NXB KHKT, Hà Nội tr 150 - 154 Hoàng Thị Thu Hà, Đặng Đức Anh, Phạm Thanh Hải, Nguyễn Phước My, Nguyễn Thùy Trâm, Nguyễn Trần Hiển(2012).PCR chẩn đoán nhanh, xác vi khuẩn Bacillus anthracis trực tiếp từ bệnhphẩm lâm sàng môi trường.Y học dự phòng,8, tr 155-163 Nông Văn Hải, Quyền Đình Thi (2008) Phản ứng PCR bản.Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, 2, tr 15-250 Nguyễn Thái Sơn cộng (2010) Nghiên cứu số biện pháp ứng phó tình bị công tác nhân sinh học trực khuẩn than (Bacillus anthracis).Báo cáo tổng kết nhiệm vụ cấp Bộ QP, dự án A037 Học viện Quân y (2011) Giáo trình Vi sinh Y học Nhà xuất Quân đội nhân dân, Hà Nội, tr 192-199 i Tiếng Anh Batra, R B a s (2001) Anthrax Toxin.Critical Reviews in Microbiology 27(3): 167-200 Batra S A., Krupanidhi S., Tuteja U (2013) A sensitive & specific multiplex PCR assay for simultaneous detection of Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Burkholderia pseudomallei & Brucella species Indian Journalof Medical Research 138: 111-116 Brachman P S (2002) Bioterrorism: An Update with a Focus on Anthrax American Journal of Epidemiology 155(11): 981- 987 10 Brachman P.S., Gold H., Plotkin S.A., Fekety F.R., Werrin M., Ingraham N.R (1962) Field Evaluation of a Human Anthrax Vaccine American Journal of Public Health Nation’s Health 52 (4): 632–645 11 Brossier F., Levy M., Landier A., Lafaye P., Mock M (2004) Functional analysis of Bacillus anthracis protective antigen by using neutralizing monoclonal antibodies Infection and Immunity 72(11): 6313-6317 12 Burton J E., Oshota O J., North E., Hudson M J., Polyanskaya N., Brehm J., Lloyd G., Silman N J (2005) Development of a multi-pathogen oligonucleotide microarray for detection of Bacillus anthracis Molecular and Cellular Probes 19(5): 349-357 13 Cheun H I., Makino S I., Watarai M., Erdenebaatar J., Kawamoto K., Uchida I (2003) Rapid and effective detection of anthrax spores in soil by PCR Journal of Applied Microbiology 95(4): 728-733 14 Ezzell J W., Welkos S L (1999) The capsule of Bacillus anthracis, a review Journal of Applied Microbiology 87(2): 250 15 Fouet A., Mesnage S., Tosi-Couture E., Gounon P., Mock M (1999) Bacillus anthracis surface: capsule and S-layer Journal of Applied Microbiology 87(2): 251-255 16 Haines Bw., Klein F., Lincoln Re (1965) Quantitative assay for crude anthrax toxins Journal of Bacteriology 89: 74 – 83 ii 17 Hoffmaster A R., Koehler T M (1999) Autogenous regulation of the Bacillus anthracis pag operon Journal of Bacteriology 181 (15): 4485 – 4492 18 Jackson P J., Hugh-Jones M E., Adair D M., Green G., Hill K K., Kuske C R., Grinberg L M., Abramova F A., Keim P (1998) PCR analysis of tissue samples from the 1979 Sverdlovsk anthrax victims: the presence of multiple Bacillus anthracis strains in different victims Proceedings of the National Academy Sciences of the U S A 95(3): 1224-1229 19 Jernigan J A., Stephens D S., Ashford D A ,Omenaca C., Topiel M S., Galbraith M., Tapper M., Fisk T L., Zaki S., Popovic T., Meyer R F., Quinn C P., Harper S A., Fridkin S K., Sejvar J J., Shepard C W., McConnell M., Guarner J.,Shieh W J., Malecki J M.,, Gerberding J L., Hughes J M., Perkins B A., , Anthrax Bioterrorism Investigation Team (2001) Bioterrorism-related inhalational anthrax: the first 10 cases reported in the United States Emerging Infectious Diseases Journal 7(6):933-944 20 Kamal S., Rashid A M., Bakar M (2011) Anthrax: an update Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 1(6): 496-501 21 Keim P., Gruendike J M., Klevytska A M., Schupp J M., Challacombe J., Okinaka R (2009) The genome and variation of Bacillus anthracis Molecular Aspects of Medicine 30(6): 397- 405 22 Keim P., Price L B., Klevytska A., M.Smith K L., Schupp J M., Okinaka R., Jackson P J., Hugh-Jones M E (2000) Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis.Journal Bacteriology 182(10): 2928-2936 23 Kim W., Hong Y P., Yoo J H., Lee W B., Choi C S., Chung S I (2002) Genetic relationships of Bacillus anthracis and closely related species based on variable-number tandem repeat analysis and BOX-PCR fingerprinting FEMS Microbiology Letters 207(1): 21-27 iii genomic 24 Kumar S., Tuteja U., Sarika K., Kumar O (2012) A multiplex PCR assay for the simultaneous identification of virulent & avirulent Bacillus anthracis targeting genes of plasmids & chromosomal DNA Indian Journal of Medical Research 135(6): 917-919 25 Kurosaki Y., Sakuma T., Fukuma A., Fujinami Y., Kawamoto K., Kamo N., Makino S I., Yasuda J (2009) A simple and sensitive method for detection of Bacillus anthracis by loop-mediated isothermal amplification Journal of Applied Microbiology 107(6):1947-1956 26 Meynell E., Meynell G G (1964) The Roles of Serum and Carbon Dioxide in Capsule Formation by Bacillus anthracis Journal of General Microbiology 34: 153-164 27 Okinaka R T., Cloud K., Hampton O., Hoffmaster A R., Hill K K., Keim P., Koehler T M., Lamke G., Kumano S., Mahillon J., Manter D., Martinez Y., Ricke D., Svensson R., Jackson P J (1999) Sequence and organization of pXO1, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes Journal of Bacteriology 181(20): 6509-6515 28 Patra G., Vaissaire J., Weber-Levy M., Le Doujet C., Mock M (1998) Molecular characterization of Bacillus strains involved in outbreaks of anthrax in France in 1997 Journal of Clinical Microbiology 36(11): 3412-3414 29 Read T D., Peterson S N., Tour (2003) The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria Nature 423(6935): 81-86 30 Safari Foroshani N., Karami A., Pourali F (2013) Simultaneous and Rapid Detection of Salmonella typhi, Bacillus anthracis, and Yersinia pestis by Using Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) Iranian Red Crescent Medical Journal 15(11): e9208 31 Skottman T, Piiparinen H., Hyytiainen H., Myllys V., Skurnik M., Nikkari S (2007) Simultaneous real-time PCR detection of Bacillus anthracis, Francisella iv tularensis and Yersinia pestis European Journal of Clinical Microbiology Infecioust Diseases 26(3): 207-211 Internet 32 http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/anthrax.html v [...]... là PCR có thể thao tác trên các gen vi khuẩn đã chết nên phương pháp này đã được ứng dụng ngày càng rộng rãi ở nhiều nước trên thê giới, trong đó có Vi t Nam Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu phát hiện đồng thời 3 gen VrrA, capA, pagA của vi khuẩn than (Bacillus anthracis) bằng phản ứng Multiplex PCR. ” Mục tiêu nghiên cứu : Phát hiện đồng thời 3 gen VrrA, capA, pagA của vi khuẩn than. .. pagA của vi khuẩn than (Bacillus anthracis) để phục vụ cho vi c tạo Kit phát hiện nhanh vi khuẩn than Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài cần thực hiện các nội dung sau: 1 Thiết kế các cặp mồi cho 3 gen: vrrA, capA, pagA của vi khuẩn than 2 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu vi khuẩn than 3 Thực hiện phản ứng PCR đơn mồi phát hiện từng gen vrrA, capA, pagA của vi khuẩn than 4 Xác định trình... điểm của PCR: Thao tác trực tiếp trực tiếp trên vật liệu di truyền của vi khuẩn là DNA để phát hiện gen chịu trách nhiệm cho các yếu tố độc lực của vi khuẩn Vì vậy dùng PCR có thể chẩn đoán chính xác các loại vi khuẩn cần tìm - Nhược điểm của PCR: Bình thường trong một phản ứng PCR, người ta dùng một cặp mồi để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu Để chẩn đoán 1 trong 6 chủng vi khuẩn cần ít nhất 6 đến 8 phản. .. pháp nghiên cứu 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu Hình 2.1: Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu 2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR - Dựa vào trình tự các gen vrrA, capA, pagA được công bố trên ngân hàng gen (NCBI): gen VrrA (mã số NC012581.1), gen CapA (mã số NC012577.1) và gen PagA (mã số NC00 732 2.2), kết hợp sử dụng các phần mềm thiết kế mồi PastPCR,... ra PCR còn cho phép xác định được chủng B anthracis có độc hay không bằng các xác định gen độc lực có trong chủng vi khuẩn đó - Kỹ thuật Multiplex - PCR (PCR đa mồi) là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi trong một ống phản ứng Multiplex - PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ đó Multiplex - PCR. .. Multiplex - PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online) bởi phương pháp này tiết kiệm thời gian, công sức và hóa chất - Phản ứng multiplex PCR lý tưởng để chẩn đoán B anthracis là phản ứng được thiết kế phát hiện đồng thời cả gen đặc trưng và gen độc lực của B anthracis - Các gen đích được sử dụng để chẩn đoán B anthracis là: + Gen đặc trưng: vrrA + Gen độc lực: capA,... từng gen vrrA, capA, pagA của vi khuẩn than 4 Xác định trình tự và so sánh trình tự trên ngân hàng gen 5 Thực hiện phản ứng Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen VrrA, CapA, PagA 2 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh than 1.1.1 Sơ lược về bệnh than Trên thế giới Bệnh than hay còn gọi là bệnh nhiệt than, đã gây ra những thiệt hại vô cùng to lớn cho ngành chăn nuôi gia súc cũng như làm ảnh hưởng tới... hưởng mạnh đến phản ứng PCR và nó tùy thuộc vào từng phản ứng Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 150-200 µM Phản ứng PCR đa mồi nhân lên đồng thời nhiều gen đích, thành phần phản ứng gồm: buffer, dNTP, MgCl2, H2O, primer foward 1, primer reverse 1, primer foward 2, primer reverse 2, primer foward 3, primer reverse 3 , taq polymerase Phương pháp PCR chẩn đoán B anthracis có độ nhậy và độ đặc hiệu cao, thời gian... triển và áp dụng có hiệu quả trong vi c phát hiện ra tác nhân gây bệnh.Trong đó, phương pháp phân tử dựa trên phản ứng PCR được áp dụng phổ biến nhất, vì phương pháp này cho phép phát hiện gen hoặc hệ gen ngay cả khi chưa biểu hiện kiểu hình và đặc tính gây bệnh PCR là phản ứng thao tác trực tiếp trên chất liệu di truyền và có khả năng nhân lên bất cứ đoạn gen nào trong thời gian ngắn Kỹ thuật này có độ... sử dụng gen capA trong chẩn đoán B anthracis như nghiên cứu của Y Kurosaki [25], Skottman [31 ], H.I Cheun [ 13] , Jane E [12] Để chứng minh chủng B anthracis có độc lực trong chẩn đoán bằng Multiplex PCR thì cần chỉ ra được ít nhất chúng có 1 trong các gen độc lực như pagA, capA đồng thời với gen đặc trưng VrrA 1 .3 Các phương pháp chẩn đoán B anthracis 1 .3. 1 Phương pháp trực tiếp 17 - Sử dụng các phương