BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP tài XÁC ĐỊNH LOÀI SÁN LÁ GAN LỚN (SLGL) PHÂN LẬP TỪ BÒ TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN TRUNG, TÂY NGUYÊN – VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP VÀ HÌNH THÁI HỌC Giáo viên hướng dẫn: ThS Đỗ Ngọc Ánh Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Khánh Hòa p: 11-01 HÀ NỘI – 2015 Nguyễn Thị Khánh Hòa Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu này, em nhận nhiều giúp đỡ cá nhân, tổ chức Em xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Lãnh đạo, huy cán thuộc Bộ môn Ký sinh trùng – Côn trùng, Ban giám đốc Trung tâm nghiên cứu Y Sinh Dược Học – Học viện Quân y Em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Thạc sĩ Đỗ Ngọc Ánh – Giảng viên Bộ môn Ký sinh trùng – Côn trùng – Học viện Quân y, người thầy theo sát, tận tâm hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn anh/chị kĩ thuật viên, đặc biệt chị Hoàng Thị Ngọc Diệp trung tâm nghiên cứu Y Sinh Dược Học Quân – Học viện Quân y giúp đỡ em trình thực đề tài đóng góp ý kiến quý báu cho luận văn em Em xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Viện thầy, cô Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội giảng dạy tận tình suốt trình học tập, trang bị cho em tảng kiến thức khoa học, phương pháp học tập tạo cho em môi trường làm việc tốt để hoàn thành khóa luận Ngoài ra, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy/cô Hội đồng chấm luận văn có ý kiến đóng góp quý báu để luận văn em hoàn thiện Cuối cùng, em xin bày tỏ lời cảm ơn tới người thân, bạn bè ủng hộ giúp đỡ, động viên em suốt thời gian học tập thực đề tài Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Khánh Hòa Nguyễn Thị Khánh Hòa Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN 1:TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH NHIỄM BỆNH DO SLGL FASCIOLA 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Ở Việt Nam 1.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA FASCIOLA SPP 1.2.1 Phân loại sinh học 1.2.2 Đặc điểm hình thái 1.2.3 Vòng đời sinh học 1.3 ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH DO SLGL 1.3.1 Bệnh SLGL động vật 1.3.2 Bệnh SLGL người 1.4 VAI TRÒ CỦA VIỆC XÁC ĐỊNH LOÀI 11 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LOÀI SLGL 11 1.5.1 Phương pháp hình thái 11 1.5.2 Phương pháp sinh học phân tử 12 1.5.3 Nghiên cứu xác định loài Việt Nam 14 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Phương pháp đo kích thước số hình thái 19 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử PCR-RFLP 19 2.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU NGHIÊN CỨU 26 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁICỦA SLGL 27 3.1.1 Kích thước chiều dài 27 Nguyễn Thị Khánh Hòa Khóa luận tốt nghiệp 3.1.2 Kích thước chiều rộng 28 3.1.3 Chỉ số chiều dài/chiều rộng 29 3.1.4 Kích thước khoảng cách từ giác bụng tới cuối thân 30 3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH LOÀI SLGL BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP 32 3.2.1 Kết xác định điều kiện cho kỹ thuật PCR-RFLP xác định loài SLGL 32 3.2.2 Kết nhân đoạn gen đích COX1 số mẫu SLGL phân lập khu vực miền Trung-Tây Nguyên 33 3.2.3 Kết cắt giới hạn sản phẩm PCR để xác định phân biệt loài SLGL 35 3.2.4 Kết xác định loài dựa vào trình tự gen so sánh trình tự đoạn gen thu với ngân hàng gen 37 KẾT LUẬN 44 Nguyễn Thị Khánh Hòa Khóa luận tốt nghiệp CHỮ VIẾT TẮT AND Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic BL Body length (Chiều dài thể) BW Body width (Chiều rộng thể) CS Cộng COX1 Cytocorome c oxidase subunit ĐL Đắc Lắc KTS Ký sinh trùng Nad1 Nicotinamide dehydrogenease sunbunit NA Nghệ An PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) PY Phú Yên QN Quảng Nam SLGL Sán gan lớn SR Sốt rét TN Tây Ninh VS Giác bụng VS-P Khoảng cách từ giác bụng tới cuối thân µl Microlit Nguyễn Thị Khánh Hòa Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tỷ lệ nhiễm SLGL trâu/ bò Bảng 3.1 Kích thước chiều dài SLGL 27 Bảng 3.2 Kích thước chiều rộng SLGL 28 Bảng 3.3 Tỷ lệ chiều dài/chiều rộng SLGL 29 Bảng 3.4 So sánh tỷ lệ BL/BW nghiên cứu với nghiên cứu số nước 29 Bảng 3.5 Kích thước đoạn từ giác bụng đến cuối thân 30 Bảng 3.6 So sánh số VS-P nghiên cứu với nghiên cứu số nước 30 Bảng 3.6 Số lượng kết chạy PCR 34 Bảng 3.7 Số lượng kết cắt giới hạn sản phẩm PCR 35 Nguyễn Thị Khánh Hòa Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thể sán gan lớn trưởng thành Hình 1.2 Hình thể trứng sán gan lớn Hình 1.3 Vòng đời sinh học sán gan lớn Hình 2.1.Một số thiết bị sử dụng nghiên cứu 16 Hình 3.1 Một số mẫu sán thu từ Phú Yên 31 Hình 3.2 Hình thể mẫu SLGL Quảng Nam 32 Hình 3.3 Kết đo ADN tổng số số mẫu SLGL phân lập khu vực miền Trung-Tây nguyên, Việt Nam 32 Hình 3.4 Kết tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp mồi 33 Hình 3.5 Kết nhân gen 16 mẫu SLGL thu thập tỉnh Phú Yên, Đắc Lắc, Quảng Nam, Tây Ninh 34 Hình 3.6 Kết nhân gen 16 mẫu SLGL thu thập tỉnh Phú Yên, Đắc Lắc, Quảng Nam, Tây Ninh, Nghệ An 35 Hình 3.7 Kết cắt giới hạn 20 mẫu SLGL thu thập tỉnh Phú Yên, Đắc Lắc, Quảng Nam, Tây Ninh 36 Hình 3.8 Kết cắt giới hạn 14 mẫu SLGL thu thập tỉnh Phú Yên, Đắc Lắc, Quảng Nam, Nghệ An 36 Hình 3.9 Kết cắt giới hạn mẫu SLGL thu thập tỉnh Quảng Nam Tây Ninh 37 Hình 3.10 Trình tự đoạn ADNthu với mồi JB4.5 mẫu DL6 38 Hình 3.11 Kết so sánh trình tự gen COX1 mẫu DL6 với trình tự mẫu F gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) Genebank 38 Hình 3.12 Trình tự đoạn ADNthu với mồi JB4.5 mẫu NA1.1 39 Hình 3.13 Kết so sánh trình tự gen COX1 mẫu NA1.1 với trình tự mẫu F gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) Genebank 39 Hình 3.14 Trình tự đoạn ADNthu với mồi JB4.5 mẫu QN1.1 40 Hình 3.15 Kết so sánh trình tự gen COX1 mẫu QN1.1 với trình tự mẫu F gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) Genebank 40 Hình 3.16 Trình tự đoạn ADNthu với mồi JB4.5 mẫu TN5 41 Nguyễn Thị Khánh Hòa Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.17 Kết so sánh trình tự gen COX1 mẫu TN5 với trình tự mẫu F gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) Genebank 41 Hình 3.18 Trình tự đoạn ADNthu với mồi JB4.5 mẫu PY9 42 Hình 3.19 Kết so sánh trình tự gen COX1 mẫu PY9 với trình tự mẫu F gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) Genebank 42 MỞ ĐẦU Bệnh sán gan lớn (SLGL) bệnh phổ biến động vật nhai lại cừu, dê, trâu, bò… khắp giới, Fasciola hepatica(Linnaeus, 1758) Fasciola gigantica(Cobbold, 1885) gây ra[1], [45] Người vật chủ tình cờ SLGL người ăn rau sống uống nước lã có nang ấu trùng SLGL sống Ở người, SLGL gây tổn thương chủ yếu gan gây tổn thương gan SLGL lạc vị kí sinh.Tại số khu vực giới, tỷ lệ nhiễm SLGL người cao nhiễm SLGL xem vấn đề sức khỏe cộng đồng đặc biệt quan tâm [59], [61] Hai loài Fasciola hepatica Fasciola gigantica có nhiều điểm giống khác nhau.Để phân biệt loài, người ta sử dụng phương pháp hình thái học[44], [67] sinh học phân tử [6], [18], [54].Theo Periago cộng (2006)[67], dựa vào đặc điểm hình thái chiều dài, rộng, khoảng cách từ giác bụng tới cuối thân tỷ lệ chiều dài/chiều rộng cho phép xác định loài SLGL Phương pháp đơn giản, dễ thực không cần thiết bị phức tạp thực hầu hết phòng thí nghiệm Tuy nhiên, nhiều tác giả cho SLGL có đa hình hình thái, kích thước hình dạng SLGL thay đổi phụ thuộc vào vật chủ kí sinh, số lượng sán nhiễm tình trạng dinh dưỡng vật chủ [27], [45] Vì vậy, dựa vào hình thái khó xác định SLGL F hepatica hay F gigantica[20], [27], [45].Phương pháp sinh học phân tử từ đời khắc phục hạn chế phương pháp hình thái.Các kỹ thuật sinh học phân tử cho phép xác định phân biệt loài Fasciola hepatica Fasciola gigantica Một số kỹ thuật sử dụng để giám định phân biệt Fasciola hepatica Fasciola gigantica RFLP-PCR [48], RAPD-PCR, PCR kết hợp với so sánh rình tự đoạn ADNthu với ngân hàng gen [5], [54]… Việc xác định loài SLGL sở để lựa chọn, thực nghiên cứu nhằm tìm hiểu chế bệnh sinh, nghiên cứu tạo kít huyết chuẩn đoán, nghiên cứu thuốc điều trị, tình hình kháng thuốc… qua góp phần quan trọng công tác phòng chống bệnh SLGL gây động vật người phù hợp với điều kiện quốc gia, vùng lãnh thổ [1] Ở Việt Nam, việc xác định loài SLGL gây bệnh người động vật số tác giả nghiên cứu[2], [18], [20], [24] Tuy nhiên, nghiên cứu dừng lại phân tích kích thước chiều dài, chiều rộng việc xác định loài vài điểm cụ thể nên kết luận đưa hạn chế Vì vậy, để có thêm liệu hình thái để góp phần xác định loài SLGL nhằm góp phần phòng chống bệnh SLGL gây cho động vật người Việt Nam hiệu hơn, thực nghiên cứu nhằm mục tiêu: Xác định loài SLGL số tỉnh miền Trung-Tây Nguyên dựa vào số số hình thái Xác định loài SLGL số tỉnh miền Trung-Tây Nguyên thị gen ty thể COX1 [2] *Kết giải trình tự so sánh với ngân hàng gen mẫu QN1.1 Quảng Nam Hình 3.14 Trình tự đoạn ADNthu với mồi JB4.5 mẫu QN1.1 Hình 3.15 Kết so sánh trình tự gen COX1 mẫu QN1.1 với trình tự mẫu F gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) Genebank [40] *Kết giải trình tự so sánh với ngân hàng gen mẫu TN5 Tây Ninh Hình 3.16 Trình tự đoạn ADNthu với mồi JB4.5 mẫu TN5 Hình 3.17 Kết so sánh trình tự gen COX1 mẫu TN5 với trình tự mẫu F gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) Genebank [41] *Kết giải trình tự so sánh với ngân hàng gen mẫu PY9 Phú Yên Hình 3.18 Trình tự đoạn ADNthu với mồi JB4.5 mẫu PY9 Hình 3.19 Kết so sánh trình tự gen COX1 mẫu PY9 với trình tự mẫu F gigantica-GQ121277.1 (Thổ Nhĩ Kì) Genebank [42] Nhận xét: Kết cho thấy, chuỗi nucleotide có kích thước 446bp mẫu giải trình tự hoàn toàn đồng với F gigantica, với mức tương đồng đạt 97% so với trình tự nucleotide mẫu Thổ Nhĩ Kì đăng ký ngân hàng gen (sốGQ121277.1) Điều rằng, phản ứng PCR với cặp mồi JB3 JB4.5 nhân gen đích sánFasciola gigantica.Như tất cảcác mẫu SLGL thu thập nghiên cứu F gigantica Và mẫu không bị cắt enzyme Rsa1 bị đột biến, vị trí cắt đặc hiệu Với phân tích cho thấy nghiên cứu phân loại hình thái phân tử SLGL không đồng nhất.SLGL có tính đa hình thái hình thái dựa vào hình thái không đủ sở để kết luận SLGL thuộc loại Do vậy, muốn xác định loài SLGL cần dựa vào công cụ sinh học phân tử Tuy nhiên, phân loại hình thái góp phần bổ sung sở liệu định hướng lựa chọn hướng nghiên cứu phù hợp cho số nghiên cứu sâu liên quan đến SLGL [43] KẾT LUẬN 1.Dựa vào số hình tháitỷ lệ chiều dài/chiều rộng (BL/BW) kích thước đoạn từ giác bụng tới cuối thân cho thấy: - Theo số BL/BW: có 54.05% xếp vào nhóm SLGL F hepatica, 21.62% xếp vào nhóm F gigantica - Theo số VS-P: có 64.86% xếp vào nhóm SLGL F hepatica, 13.51% xếp vào nhóm F gigantica Kết giám định loài thị gen COX1 cho thấy tất 37 mẫu SLGL thu thập thuộc loài Fasciola gigantica SLGL có sựđa hình hình thái.Trong giám định loài SLGL nên kết hợp phương pháp hình thái phương pháp sinh học phân tử [44] TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế, Viện Sốt rét- Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương (2006), “Hướng dẫn chẩn đoán điều trị số bệnh giun sán Việt Nam”, Hà Nội-2006, Tr: 40-48 Đặng Tất Thế, Lê Quang Hùng, Cao Văn Viên (2003), “Định loài sán gan lớn (Giống Fasciola) người gia súc thị AND”, Tạp chí Sinh học, Số 25 tháng 12/2003, Tr: 47-52 Đặng Thị Cẩm Thạch, Đỗ Trung Dũng, Lê Ngọc Loan (2008), “Tình hình nhiễm sán gan lớn Việt Nam năm 2007 đề xuất biện pháp phòng chống”, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, Số 4/2008, Tr: 31-37 Đặng Thị Cẩm Thạch, Tô Mười (2010), “Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng hiệu điều trị Triclabendazole bệnh nhân sán gan lớn bệnh viện đa khoa khu vực miền núi phía bắc – Quảng Nam (năm 2006-2009)”, Tạp chí phòng chống sốt rét bệnh ký sinh trùng, Số 4/2010, Tr: 45-55 Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Duy Bắc, Nguyễn Khắc Lực, Nguyễn Thị Vân, Lê Trần Anh (2011),“Xác định loài tỷ lệ nhiễm sán gan lớn trâu/bò huyện Đại Lộc-Quảng Nam”,Công trình khoa học báo cáo hội nghị ký sinh trùng toàn quốc lần thứ 38 Nhà xuất Y học-2011, Tr: 151-156 Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Khắc Lực, Đặng Thị Cẩm Thạch, Lê Bách Quang (2011),“Xác định loài sán gan lớn gây bệnh bò khu vực miền Trung Tây Nguyên (Việt Nam) thị phân tử gen ty thể COX1”,Tạp chí Y-Dược học quân sự, Số 2-2011, Tr: 96-101 Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Khắc Lực, Nguyễn Ngọc San (2011), “Xác định tình trạng nhiễm Sán gan lớn trâu/bò số yếu tố nguy lây truyền sang người huyện Đại Lộc – Quảng Nam”, Tạp chí Phòng chống sốt rét bệnh ký sinh trùng, Số 3-2011, Tr: 76-82 Hoàng Dương Vương CS (2006), “Các hình thái lâm ngoại khoa gặp bệnh sán gan lớn Bệnh viện Đà Nẵng”, Tạp chí Ngoại khoa, Số 3/2006 (Chuyên đề Hội nghị ngoại khoa toàn quốc lần thứ XII), Tr: 10-17 [45] Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Ngọc Vinh, Nguyễn Duy Sơn CS (2008), “Nghiên cứu đặc điểm lâm sang cận lâm sàng bệnh nhân nhiễm sán gan lớn Fasciola spp Tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên Việt Nam, 2006-2008”, Tạp chí Y học Tp.Hồ Chí Minh, Tập 12, Phụ Số 4/2008 10 Lê Bách Quang CS (2008), “Ký sinh trùng côn trùng y học “, Giáo trình giảng dạy đại học, Nhà xuất Quân đội nhân dân, Tr: 233-236 11 Lê Thanh Hòa (2007), “Chỉ thị di truyền phân tử sử dụng giám định, chẩn đoán, phân loại, phả hệ, dịch tễ học di truyền quần thể ký sinh trùng”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, Tập 11, Phụ số 2/2007, Tr: 9-14 12 Lê Thanh Hòa CS (2007), “Xác định Li ngoại loài F.hepatica F gigantica quần thể sán gan lớn Việt Nam sở phân tích sinh học phân tử”, Tạp chí Y học Tp.Hồ Chí Minh, tập 11, Phụ số 2/2007, Tr: 89-97 13 Lê Thị Tuyết (2009), “Kết xét nghiệm trứng sán gan lớn (Fasciola app.) phân người trâu/bò số xã huyện Xuân Trường, tỉnh Nam Định”, Tạp chí y học thực hành, 12/2009 14 Lê Trần Anh, Phạm Văn Minh (2003), “Thông báo trường hợp nhiễm sán gan lớn Fasciola sp túi mật phát tình cờ sau phẫu thuật cắt bỏ túi mật”, Tạp chí Y dược học Quân sự, Số 2003, Tr: 61-65 15 Ngô Thị Minh Hà, Phan Phú Kiểm (2007), “Báo cáo ba trường hợp viêm tổ chức da bụng Fasciola spp Tại bệnh viện Hoàn Mỹ Đà Nẵng”, Nội san y khoa, Bệnh viện Hoàn Mỹ Đà Nẵng năm 2007, Tr: 48-50 16 Nguyễn Khắc Lực (2010), “Nghiên cứu số đặc điểm nhiễm sán gan lớn (Fasciola spp.) hiệu số biện pháp can thiệp huyện Đại Lộc – Quảng Nam”, Luận án tiến sĩ y học, Học viện Quân y, Hà Nội 17 Nguyễn Khắc Lực CS (2009), “Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh nhân sán gan lớn bệnh viện đa khoa khu vực miền núi phía Bắc tỉnh Quảng Nam (20042008)”,Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, Số 3/2009, Tr: 81-85 18 Nguyễn Quốc Doanh, Lê Thanh Hòa (2006), “Một số đặc điểm hình thái phân tử sán gan (Fasciola sp.) bò tỉnh Nghệ An Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XIII, Số 5/2006, Tr: 59-67 [46] 19 Nguyễn Thế Hùng, Lê Thanh Hòa, Giang Hoàng Hà (2008), “Kết định loại sán gan lớn thu thập lò mổ Hà Nội phương pháp PCR”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, Tập XV, số (2008), Tr: 50-55 20 Nguyễn Thị Giang Thanh, Triệu Nguyên Trung, Lê Thanh Hòa (2010), “Nghiên cứu thẩm định loài sán gan lớn (Fasciola spp.) gây bệnh dê Việt Nam thị phân tử”, Nguồn http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal 21 Nguyễn Thị Lê CS (1977), “Bệnh giun sán từ động vật lây sang người”, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, Tr: 33-49 22 Nguyễn Văn Đề (2004), “Tình hình bệnh sán gan lớn Fascioliasis phát miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Y học thực hành, Số 8/2004, Tr: 40-44 23 Nguyễn Văn Đề CS (2005), “Đánh giá tác dụng Tricloabendazole điều trị sán gan lớn Việt Nam”, Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, Số 6/2005, Tr: 54-62 24 Nguyễn Văn Đề CS (2006), “Bước đầu áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định thành phần loài phân bố sán lá, sán dây thường gặp Việt Nam”,Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng-2006, Tr: 27-43 25 Nguyễn Văn Đề, Đoàn Thanh Tùng, Đỗ Tuấn Anh, Nguyễn Khánh Trạch (2006), “Biểu bệnh lý bệnh sán gan lớn Fascioliasis Việt Nam”, Tạp chí Y học Việt Nam, Số 8/2006, Tr: 29-35 26 Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa (2007), “Xác định thành phần loài sán thường gặp Việt Nam sinh học phân tử”,Tạp chí Y học Tp.Hồ Chí Minh, Tập 11, Phụ số 2/2007, Tr: 80-88 27 Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa (2008), “Những nghiên cứu sinh học phân tử lĩnh vực ký sinh trùng Việt Nam”, Kỷ yếu Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghệ thực phẩm Nhà xuất Khoa học Kỹ Thuật – 2008, Tr: 456 28 Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, Lê Khánh Thuận (2004), “Xác định loài sán gan lớn từ trứng phân bệnh nhân phương pháp phân tử hệ gen ty thể”,Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, Số 4/2004, Tr: 72-79 [47] 29 Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa, Lê Thị Xuân (2006), “Xác định thành phần loài sán gan lớn ký sinh người Việt Nam phương pháp sinh học phân tử”,Tạp chí thông tin Y dược, Số 4/2006, Tr: 31-34 30 Nguyễn Văn Đề, Phan Thị Hương Liên, Phạm Ngọc Minh, Đỗ Tuấn Anh (2012), “Tỷ lệ nhiễm sán gan lớn nhóm bệnh nhân chẩn đoán “u gan” bệnh viện Hà Nội năm 2010-2011”, Kỷ yếu Hội Nghị khoa học quốc tế Meskong Santé III, Tr: 22-29 31 Nguyễn Văn Đề, Trần Ngọc Ân, Hoàng Xuân Thiệu, Võ Văn Xy (2006), “Thông báo hai trường hợp sán gan lớn Fasciola gigantica di chuyển đến đầu gối, tuyến vú Hà Tây Quảng Bình”, Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, Số 1/2006, Tr:95-99 32 Nguyễn Văn Đức, Phạm Ngọc Doanh, Đặng Thị Cẩm Thạch, Phạm Văn Lực, Nguyễn Xuân Thao, Nguyễn Khắc Lực (2010), “Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh sán gan lớn (Fasciolosis) huyện Lăk tỉnh Đắc Lắc”,Tạp chí Y học thực hành (729), Số 8/2010, Tr: 24-29 33 Nguyễn Văn Thọ CS (2009), “Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh sán gan lớn người động vật số tỉnh vùng đồng song Hồng”, Tạp chí Ydược học quân sự, Số 9/2009, Tr: 13-19 34 Phạm Ngọc Hoa, Lê Văn Phước (1999), “Hình ảnh tổn thương gan sán gan lớn Fasciola sp Trên chụp cắt lớp điện toán CT cộng hưởng từ MRI”, Tạp chí Y học Việt Nam, Tr: 89-93 35 Phạm Văn Lực CS (2006), “Bệnh sán gan trâu bò (Fasciolaliasis) yếu tố nguy lây nhiễm sang người tỉnh Đắc Lắc”, Tạp chí Y học thực hành, Số năm 2006, Tr: 41-43 36 Phạm Văn Thân, Huỳnh Hồng Quang (2007), “Đặc điểm sinh học vài nét dịch tễ sán gan lớn (Fasciola hepatica, Fasciola gigantica) người”,Tạp chí Y học Tp.Hồ Chí Minh, Tập 11, Phụ Số 2/2007, Tr: 15-23 37 Trần Vinh Hiển CS (2006), “Bước đầu đánh giá hiệu Triclabendazole điều trị bệnh nhân nhiễm sán gan lớn gan”, Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng, Số 6-2005, Tr: 63-71 [48] 38 Trần Tịnh Hiền CS (2008), “Nghiên cứu so sánh Artesunat Triclabendazole bệnh sán gan Fasciola miền Trung Việt Nam”, Tạp chí thời Y học, Số 7/2008, Tr: 3-8 39 Triệu Nguyên Trung Huỳnh Hồng Quang (2010), “Một số ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử bệnh lý vi sinh học ký sinh trùng học” Nguồn http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal 40 Võ Thị Hải Lê (2010), “Tình hình nhiễm sán gan lớn trâu, bò số điểm thuộc tỉnh Nghệ An”,Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, Tập XVII, Số 5-2010, Tr: 30-33 Tiếng Anh 41 A Shahbazi, M Akbarimoghaddam, S Izadi, A Ghazanchaii, N Jalali, A Bazmani (2011), “Identification and Genetic Variation of Fasciola Species from Tabriz, North-Western Iran”,Iranian J Parasitol, Vol 6, No 3, 2011, pp.52-59 42 Ahmet Erensoy, Salih Kuk, Mehmet Ozden (2009), “Genetic identification of Fasciola hepatica and ITS-2 sequence of nuclear ribosomal DNA in Turkey”.Parasitol Res (2009) 105: 407-412 43 Ali H et al (2008), “Genetic characterization of Fasciola sample from different host species and geographical localities revealed the existence of F hepatica and F gigantica in Nigeria”,Parasitol Res (2008) 102: 1021-1024 44 Amor N et al (2011), “Molecular characterization of Fasciola spp From the endemic area of northern Iran based on nuclear ribosomal DNA sequences”, Experimental Parasitology, 128 (2011): 196-204 45 Ashrafi K et al (2006), “Phenotypic analysis of adults of Fasciola hepatica, Fasciola gigantica and intermediate forms from the endemic region of Gilan, Iran”,Parasitology International, 55 (2006): 249-260 46 Dalton J.P et al (1999), “Fascioliasis” CABI Publishing, Walling ford, UK [49] 47 Dorchies Ph (2007), “Comparison of methods for the Veterinary Diagnosis of live flukes (Fasciola hepatica) in Cattle”, Bulletin USAMV-CN, 64/2007 (1-2): 1419 48 Farjallah S et al (2009), “Genetic characterization of Fasciola hepatica from Tunisia and Algeria based on mitochondrial and nuclear DNA sequences”, Parasitol Res (2009), 105: 1617-1621 49 Ghavami MB, Rahimi P, Haniloo A, Mosavinasab SN (2009), “Genotypic and Phenotypic Analysis of Fasciola Isolates”, Iranian J Parasitol, Vol.4, No.3, 2009, pp.61-70 50 Hussein A.A, Refaat M.A, Khalifa (2010), “Phenotypic description and prevalence of Fasciola species in Qena Governorate, Egypt with special reference to a new strain of Fasciola hepatica”, Journal of King Saud University (Science) (2010) 22: 1-8 51 Ichikawa M, Itagaki T (2010), “Discrimination of the ITS1 types of Fasciola spp Based on a PCR-RFLP method”, Parasitol Res (2010), 106: 757-761 52 Itagaki T et al (2005), “Genetic characterization of parthenogenic Fasciola sp in Japan on the basis of the sequences of ribosomal and mitochondrial DNA”, Parasitology (2005), 131: 1-7 53 Itagaki T et al (2009), “Occurrence of spermic diploid and aspermic triploid forms of Fasciola in Viet Nam and their molecular characterization based on nuclear and mitochondrial DNA”, Parasitology International, 58 (2009): 81-85 54 Karimi A (2008), “Genetic Diagnosis of Fasciola Species Based on 18S Ribosomal DNA Sequence”, Journal of Biological Sciences (2008): 1-8 55 Lin Ai et al (2011), “Genetic characterization, species differentiation and detection of Fasciola spp by molecular approaches”, Parasites & Vectors, 2011, (101): 1-6 56 Lotfy W.M (2002), “Identification of the Egyptian species of Fasciola”, Veterinary Parasitology, 103 (2002): 323-332 57 Mahami-Oskouei M, Dalimi A, Forouzandeh-Moghandam M, Rokni MB (2011), “Molecular Identification and Differentiation of Fasciola Isolates Using [50] PCR-RFLP Method Based on Internal Transcribed Spacer (ITS1, 5.8S rDNA, ITS2)”, Iranian J Parasitol, Vol 6, No 3, 2011: 35-42 58 Marcilla A, Bargues M.D and Mas-Coma S (2002), “A PCR-RFLP assay for the distinction between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica”, Molecular and cellular Probes (2002), 16: 327-333 59 Mas-Coma S (2005), “Epidemiology of fascioliasis in human endemic areas”, Journal of Helminthology (2005), 79: 207-216 60 Mas-Coma S et al (1999), “Epidemiology of human fascioliasis: a review and proposed new classification”, Bulletin of the World Health Organization, 1999, 77 (4): 340-346 61 Mas-Coma S et al (2005), “Fascioliasis and other plant-borne trematode zoonoses”, Int J Parasitol, 35: 1255-1278 62 Mas-Coma S, Bargues MD, Esteban JG (1999), “Human fasciolosis” in Daton, JP.Fasciolosis Wallingford, Oxon, UK: CABI Pub pp 411-434 63 Michael Asrat (2004), “Infection prevalence of ovine Fasciolosis in irrigation schemes along the Upper Awash River Basin and effects of strategic anthelmintic treatment in selected upstream areas”, Thesis Master of Science in Biology, pp 171 64 Mohammad K et al (2012), “Differential diagnosis of Egyptian Fasciola species by deoxyribonucleic acid (DNA) sequences of nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS1) based on a PCR-RFLP method”, New York Science Journal, 5(5): 46-49 65 Mohsen Moghadami, M Mardani (2008), “Case report: A cause of Obstructive Jaundice in an Elderly Man from Iran”, The Saudi Journal of Gastroenterology, Vol.14, No 4, October 2008: 208-210 66 Mufti S, Maqbool Ahmad M, Yusuf Zafar and Mazhar Qayyum (2011), “Phenotypic Analysis of Adult Fasciola spp From Potoha Region of Nothern Punjab, Pakistan”, Pakistan J Zool, Vol 43(6): 1069-1077 67 Periago M.V et al (2008), “First phenotypic description of Fasciola hepatica/Fasciola gigantica intermediate forms from human endemic area of the Nile Delta, Egypt”, Infection, Genetics and Evolution, (2008): 51-58 [51] 68 Periago M.V, Valero M.A, Panova M, Mas-Coma S (2006), “Phenotyphic comparison of allopatric populations of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica from European and African bovines using a computer image analysis system (CIAS)”,Parasitol Res (2006) 99: 368-378 69 Ramadan N I et al (2010), “Molecular Genetic Approach by using the RAPDPCR Technique for Detection of Genetic Variability in Non-Human Isolates of Fasciola”, Journal of American Science, 6(9): 773-780 70 Rokni MB et al (2010), “Identification and differentiation of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica using a simple PCR-restriction enzyme method”, Experimental Parasitology, 124 (2010): 209-213 71 Rokni MB, Mirhendi H, Behnia M, Fasihi Harandi M, Jalalizand N (2010), “Molecular Characterization of Fasciola hepatica Isolates by RAPD-PCR and Ribosomal ITS1 Sequencing”, Iranian Red Crescent Medical Journal, Vol 12, 1/2010: 27-32 72 S.Simek et al (2011), “Molecular differentiation of turkey cattle isolates of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica”,Helminthologia, 48, (2011): 3-7 73 Saki Jasem, Shahram Khademvatan and Elham yousefi (2011), “Molecular Identification of Animal Fasciola Isolates in Southwest of Iran”, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 5(11): 1878-1883 74 Sierra RM, Veronica H.A, Cuervo P and Mas-Coma S (2011), “Human fascioliasis in Argentina: retrospective overview, critical analysis and baseline for future research”, Parasites & Vectors, 4: 104: 1-8 75 Simsek S, Utuk A.E, Balkaya I (2011), “Molecular differentiation of Turkey cattle isolates of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica”, Helminthologia, 48 (1): 3-7 76 Thanh H Le, David Blairand, Donald P McManus (2002), Mitochondrial genomes of parasitic flatworms”, TRENDS in Parasitology Vol 18, No.5, May 2002: 206-213 77 Toner E et al (2008), “Physiological and morphological effects of genistein against the liver fluke, Fasciola hepatica”, Parasitology (2008), 135: 1189-1203 [52] 78 Traub R.J, Monis P.T, Robertson I.D (2005), “Molecular epidemiology: A multidisciplinary approach to understanding parasitic zoonoses”, Intenational Journal for Parasitology, 35 (2005): 1295-1307 79 Valero MA et al (2009), “Fluke egg characteristics for the diagnosis of human and animal fascioliasis by Fasciola hepatica and Fasciola gigantica”, Acta Tropica, 111 (2009): 150-159 80 Valero MA, Marcos MD, Mas-Coma S (1996), “A mathematical model for the ontogeny of Fasciola hepatica in the definitive host”, Red Rev Parasitol(1996), 56: 13-20 [53] [54] [...]... bệnh này một cách hiệu quả 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LOÀI SLGL 1.5.1 Phương pháp hình thái Nhiều tác giả cho rằng .hình thể của F gigantica và F hepatica có nhiều điểm khác nhau Điểm khác biệt dễ thấy nhất là F gigantica có kích thước dài hơn, trong khi F hepatica có kích thước ngắn hơn.Theo một số tác giả, dựa vào một số [11] chỉ số hình thái có thể xác định và phân biệt các loài SLGL.Các chỉ số cơ... cho dòng bố Từ đó, việc phân tích dòng lai sẽ xác định được di truyền theo bố hay mẹ [11] 1.5.2.2 Các kỹ thuật sử dụng trong xác định và phân biệt 2 loài F hepatica và F gigantica Trong hai thập kỉ qua, công nghệ ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định và phân biệt loài sán lá gan đã có những định hướng phát triển vượt bậc Nhiều công cụ khác nhau đã được thiết kế để xác định và phân biệt... quan trọng; và xác nhận kết quả bằng cách đánh giá sự hiển thị của sản phẩm ADN trong điều kiện thích hợp [39] Đặc biệt ở nghiên cứu này chúng tôi tiến hành tìm hiểu sâu về kỹ thuật PCRRFLP để xác định và phân biệt 2 loài sán lá gan F hepatica và F gigantica 1.5.3 Nghiên cứu xác định loài ở Việt Nam Trong nước, nghiên cứu sán lá gan lớn dưới góc độ phân tử được một số tác giả thực hiện từ năm 2002.Bước... giúp xác định loài sán lá gan lớn gây bệnh ở nhiều điểm khác nhau trong nước Các công trình nghiên cứu sau này bằng sinh học phân tử đã khẳng định loài F gigantica gây bệnh chủ yếu cho gia súc ở Việt Nam[ 2], [5], [6], [18], [19], [20], [24], [25], [26], [27], [29] Một số nghiên cứu khác sử dụng hệ gen nhân và hệ gen ty thể đã cho kết luận sán lá gan lớn gây bệnh trên người và trên động vật ở Việt Nam. .. BL/BW và VS-P có sự khác biệt căn bản giữa F hepatica và F gigantica Một số khác lại cho thấy các chỉ số này có một phần gối lên nhau Chính điềunày gây rất nhiều khó khăn trong việc xác định loài sán bằng hình thái học 1.5.2 Phương pháp sinh học phân tử 1.5.2.1 Đặc điểm hệ gen ty thể và vai trò của hệ gen ty thể trong giám định loài Hệ gen ty thể là một vòng kép ADN có kích thước khoảng 16-20 kb, gồm... đổi sang ADN bằng phản ứng sao chép ngược (reverse transcription), cả PCR và LAMP cũng đều có thể thực hiện quá trình tổng hợp chuỗi nucleotide cho sản phẩm ADN [39] Multiplex -PCR đã được xây dựng để ứng dụng chẩn đoán phân biệt các loài sán lá /sán dây, bao gồm sán lá gan nhỏClonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini; sán lá gan lớn F hepatica và F giganticatừvật chủ trung gian; sán lá phổi Paragonimus.spp;... điểm hình thái * Hình thể con trưởng thành A B Hình 1.1 Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành (A: F gigantica, B: F hepatica) Con trưởng thành của F hepatica có dạng hình lá dẹt (Hình 1.1), hình dạng đặc trưng cho các loài sán lá. Kích thước từ 20-30 mm chiều dài và 8-15 mm chiều rộng [10], [45], [62].Cơ thể của nó kéo dài về phía trước phía đầu có dạng hình nón, trên đó có giác miệng xấp xỉ như nhau Hình. .. gigantica có một số điểm khác biệt với Fasciola hepatica là kích thước thường dài hơn, trung bình 2575 mm chiều dài và 15mm chiều rộng [62] Ngoài ra, tỷ lệ phần đầu hình nón thì nhỏ hơn của F hepatica và phần cơ thể của nó hình dạng giống chiếc lá [6] hơn[45].Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp rất khó phân biệt 2 loài này về mặt hình thái *Hình thể trứng Hình 1.2 Hình thể trứng sán lá gan lớn Trứng sán. .. [7] Hình 1.3 Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn Các nang ấu trùng (metacercaria) nằm trong thực vật thủy sinh được động vật ăn cỏ và người ăn vào Khi đến ruột chúng xuyên qua ruột non, đi vào khoang phúc mạc Từ đó, nó di chuyển trực tiếp đến gan. Quá trình di chuyển từ đường tiêu hóa đến gan mất khoảng 7 ngày.Các sán lá gan chưa trưởng thành ngay mà nó chui vào nhu mô gan và tiếp tục di chuyển sâu vào... Paragonimus.spp; sán dây Taenia saginata, Taenia solium, Taenia saginata asiatica và ấu trùng sán lợn Còn đối tượng của LAMP là các loài sán dây Taenia.spp, sán lá gan lớn F hepatica và F.gigantica ;sán dẹt, trong đó có loài sán máng Schistosoma japonicum [39] Bên cạnh PCR sử dụng khuôn ADN, còn có RT -PCR sử dụng khuôn ARNvà bên cạnh LAMP sử dụng khuôn ADN, còn có RT-LAMP sử dụng khuôn ARN.Cả hai phương pháp PCR/ RT-PCR