VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHOTOBACTERIUM DAMSELAE GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở CÁ BIỂN NUÔI LỒNG TẠI HẢI PHÒNG Giáo viên hướng dẫn: TS Phạm Thị Tâm Sinh viên thực hiện: Trương Thu Hương Lớp: 1102 Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Phạm Thị Tâm, người tận tình hướng dẫn, dìu dắt em suốt trình em thực tập hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán thuộc Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập hoàn thành khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bên em cổ vũ, động viên, cảm ơn anh-chị, bạn bè phòng thí nghiệm Vi Sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tình giúp đỡ suốt thời gian em thực tập hoàn thiện đề tài Trong trình thực tập không tránh khỏi sai sót, kính mong thầy cô giáo, anh-chị bạn đóng góp ý kiến để cá nhân em tiếp thu hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 26 tháng năm 2015 Sinh viên Trương Thu Hương MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Thời qian địa điểm nghiên cứu PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản 1.1.1 Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản giới 1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi trồng thủy sản nước 1.2 Lịch sử phát bệnh vi khuẩn Photobacterium damselae 1.2.1 Lịch sử phát bệnh giới 1.2.2 Lịch sử phát bệnh Việt Nam 1.3 Tổng quan vi khuẩn Photobacterium damselae 1.3.1 Phân loại khoa học 1.3.2 Đặc điểm hình thái 1.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.3.4 Đặc điểm gây bệnh Photobacterium damselae 10 1.3.5 Độc tố vi khuẩn chế gây bệnh 13 1.3.6 Khả kháng kháng sinh vi khuẩn Photobacterium damselae 14 1.3.7 Các phương pháp kiểm tra có mặt Photobacterium damselae 15 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Động vật thí nghiệm 16 2.1.3 Môi trường hóa chất 16 2.1.4 Thiết bị dụng cụ 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 22 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn P.damselae 22 2.2.3 Phương pháp hóa sinh 24 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tính kháng kháng sinh số chủng vi khuẩn P.damselae phân lập 25 2.2.5 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 26 2.2.6 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến phát triển khả gây dung huyết vi khuẩn P.damselae 26 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh cá biển nuôi lồng 27 3.2 Xác định ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến phát triển khả gây dung huyết vi khuẩn P.damselae 31 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy 32 3.2.2 Ảnh hưởng pH 34 3.2.3 Ảnh hưởng độ mặn (NaCl) 36 3.3 Kết thử nghiệm khả kháng kháng sinh chủng Photobacterium damselae phân lập 37 3.3 Khả gây bệnh cho cá mú chủng vi khuẩn phân lập 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Từ viết tắt BHI Broth Brain Heart Infusion Broth TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose KIA Kligler Iron Agar DNA Deoxyribonucleotide Acid PCR Polymerase Chain Reaction D Đường kính R Resistant I Intermediate S Susceptible OD (đo mật độ quang học) Optical Density DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Biểu đồ nuôi trồng thủy sản toàn cầu theo vùng năm 2012 Hình 1.2 Biểu đồ sản lượng thủy sản Việt Nam qua năm 1995-2012 Hình 1.3 Hình thái vi khuẩn P.damselae kính hiển vi điện tử Hình 2.1 Sơ đồ tiếp cận nội dung nghiên cứu đề tài 21 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc môi trường Marine agar 28 Hình 3.2 Hình thái vi khuẩn P.damselae soi kính hiển vi điện tử 28 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc ria môi trường TCBS 29 Hình 3.4 Kết thử nghiệm phản ứng sinh hóa 31 Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến phát triển vi khuẩn P.damselae 33 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH đến phát triển vi khuẩn P.damselae 35 Hình 3.7 Ảnh hưởng độ mặn đến phát triển vi khuẩn P.damselae 36 Hình 3.8 Đánh giá khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn P.damselae phân lập 38 Hình 3.9 Dấu hiệu bệnh lý cá sau gây nhiễm 41 Hình 3.10 Hình ảnh kết phân lập lại chủng P.damselae 42 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn P.damselae 10 Bảng 2.1 Thiết bị dùng nghiên cứu 20 Bảng 3.1 Các mẫu bệnh phẩm đặc điểm hình thái chủng phân lập từ mẫu bệnh phẩm mang biểu nhiễm Photobacterium 27 Bảng 3.2: Các đặc tính sinh hóa điển hình vi khuẩn Photobacterium damselae phân lập cá biển nuôi lồng 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến khả gây dung huyết vi khuẩn P damselae T1.7 T1.8 34 Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH đến khả gây dung huyết vi khuẩn 35 Bảng 3.5 Ảnh hưởng độ mặn đến khả gây dung huyết 37 Bảng 3.6: Khả kháng kháng sinh chủng P.damselae phân lập 37 Bảng 3.7: Kết cảm nhiễm cá mú vi khuẩn P.damselae 40 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản (NTTS) không ngừng phát triển ngày chiếm vị trí quan trọng ngành Thủy sản nói riêng kinh tế đất nước nói chung Với kim ngạch xuất năm 2010 đạt 4,94 tỷ USD, thủy sản ba ngành có đóng góp lớn cho tổng kim ngạnh xuất Việt Nam Trong phát triển chung ngành NTTS nuôi biển coi chiến lược hàng đầu mở nhiều hứa hẹn với mục tiêu xuất tương lai Các đối tượng nuôi biển chủ yếu cá, tôm hùm, động vật thân mềm rong biển cá có nhiều tiềm để phát triển nuôi với quy mô công nghiệp Thống kê Bộ Thuỷ sản năm 2006, số lồng nuôi cá biển nước ta có 16.319 lồng, tổng sản lượng cá nuôi đạt 3.508 Trong đó, vùng nuôi tập trung chủ yếu Hải Phòng (Vịnh Lan Hạ, Bến Bèo - Cát Bà) có 6.000 lồng, với sản lượng nuôi 1.200 tấn; Quảng Ninh (Vịnh Hạ Long) có 5.700 lồng, với sản lượng đạt 1.300 tấn; Kiên Giang (huyện đảo Phú Quốc) có 131 lồng, sản lượng nuôi đạt 90 Tuy nhiên, nghề nuôi cá biển phát triển người nuôi gặp không khó khăn, đó, vấn đề lo ngại lớn dịch bệnh gây cá Qua số nghiên cứu tác nhân gây bệnh chủ yếu cá biển nuôi lồng thường virus, nấm vi khuẩn nguy hiểm bệnh tụ huyết trùng (xuất huyết nhiễm trùng) vi khuẩn Photobacterium damselae gây Vi khuẩn công gây bệnh cá biển nuôi tất giai đoạn phát triển cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm Khi bị bệnh cá biểu dạng mãn tính cấp tính, biểu bệnh tụ huyết trùng như: gây loét da, xuất nốt kem trắng u hạt tubercules màu trắng số quan nội tạng, gây hoại tử nội tạng, hoại tử tập trung thận lách, gây nhiễm trùng hoại tử rộng rãi [30] Dấu hiệu lâm sàng cá bệnh như: cá ăn kém, da tối mầu, mang hoại tử Cá bệnh chết sau 5-10 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100% gây thiệt hại kinh tế nước như: Nhât, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ở Việt Nam, bệnh phân bố hầu hết vùng nuôi nước Bệnh xảy hầu hết giai đoạn cá, vậy, việc tìm phương pháp phòng trị bệnh hạn chế tổn thất dịch bệnh gây cần thiết Thực tế nay, NTTS, người dân thường sử dụng nhiều hóa chất kháng sinh để khống chế vi khuẩn này, song việc sử dụng kháng sinh gây tượng nhờn thuốc không mang lại hiệu cao Vi khuẩn có khả tạo màng bảo vệ (biofilm) trước thuốc diệt khuẩn kháng sinh Chính thế, dịch bệnh thường bùng phát trở lại nhanh sau thuốc hết tác dụng Mặt khác, dư lượng kháng sinh sản phẩm từ cá biển gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng thịt cá sức khỏe người Để giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh đảm bảo chất lượng sản phẩm từ cá biển, việc nghiên cứu giải pháp phòng bệnh hướng đến sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng cá biển mang tính bền vững cần thiết Xuất phát từ lý luận thực tiễn trên, tiến hành đề tài: “Phân lập xác định đặc tính sinh học chủng vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh tụ huyết trùng cá biển nuôi lồng Hải Phòng” làm sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng cá biển quy mô công nghiệp Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Phân lập xác định đặc tính sinh học điển hình vi khuẩn Photobacterium damselae 2.2 Mục tiêu cụ thể - Phân lập 06-08 chủng vi khuẩn P.damselae từ mẫu bệnh phẩm số loài cá biển (cá mú, cá hồng, cá bớp) nghi mắc bệnh tụ huyết trùng cá biển nuôi lồng Cát Bà - Xác định đặc tính sinh học chủng vi khuẩn P damselae phân lập được: khả sinh enzym catalase, tryptophanase, khả sử dụng loại đường, khả sinh H2S, khả sinh hơi, khả gây dung huyết - Xác định khả gây bệnh chủng P.damselae phân lập - Xác định tính kháng kháng sinh chủng P.damselae phân lập Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Kết đề tài sở liệu khoa học cho nghiên cứu dịch tễ học giải pháp phòng, trị bệnh 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Là sở khoa học cho việc nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Photobacterium damselae giảm độc lực đánh giá kỹ tính an toàn, khả tạo kháng thể bảo hộ nguyên liệu có chất lượng tốt để sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng cá Vắc-xin giải pháp hữu hiệu việc hạn chế dịch bệnh làm tăng hiệu kinh tế sản xuất cá biển Thời qian địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu từ 9/2014 đến 5/2015 Phòng Vi Sinh, khoa Công Nghệ Sịnh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến phát triển vi khuẩn P.damselae Sự ảnh hưởng thời gian nhiệt độ nuôi cấy lên khả sinh sản mẫu P.damselae T4.3 giống với mẫu P.damselae T1.7 Điều giải thích giống đặc tính sinh học chủng loài Ở nhiệt độ 4ºC nhiệt độ 40oC vi khuẩn P.damselae T1.7 T1.8 không sinh sản Ở nhiệt độ 20oC, sinh sản vi khuẩn P.damselae tương đối cao, tăng nhanh trì trạng thái tối ưu nhiệt độ 28-37oC Sự sinh sản vi khuẩn đạt trạng thái cực thịnh nhiệt độ 28oC vào thời điểm 48 sau nuôi cấy Trong thực tế khu vực nuôi cá biển với mật độ cao thường xảy dịch bệnh nhiệt độ môi trường có biến đổi tăng cao thời điểm giao mùa Một điều đáng quan tâm khoảng nhiệt độ phát triển lý tưởng vi khuẩn P.damselae từ 20-37oC tương đồng với nhiệt độ thích hợp cho cá Mú, cá Giò, cá Vược… loài cá có giá trị kinh tế nuôi nhiều 20 – 35oC việc kiểm soát nhiệt độ môi trường nuôi cá biển nuôi lồng cho tạo điều kiện tốt cho phát triển cá đồng thời hạn chế sinh sản vi khuẩn toán khó nhà nghiên cứu người nuôi trồng thuỷ sản Cùng với việc xác định khả sinh sản chủng vi khuẩn ngưỡng nhiệt độ khác nhau, tiến hành kiểm tra khả sinh độc tố gây dung huyết chủng ngưỡng nhiệt độ Kết thể bảng sau: 33 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến khả gây dung huyết vi khuẩn P damselae T1.7 T1.8 Thời Nhiệt độ ( oC) gian (giờ) 20 28 37 40 T1.7 T1.8 T1.7 T1.8 T1.7 T1.8 T1.7 T1.8 T1.7 T1.8 12 ++ ++ + + 18 + + ++ ++ + + 24 + + + + + + 36 + + + + + + 48 + + + + + + 60 + + + + + + Ghi chú: (+): có dung huyết β; (-): không dung huyết Kết thu từ thí nghiệm cho thấy: Mật độ vi khuẩn đạt cao sau 48 nuôi cấy 28oC sau 12 nuôi cấy chủng sản sinh độc tố dung huyết Ở nhiệt độ 28oC, vòng dung huyết quan sát rõ sau 12 - 18 mờ dần nhiệt độ 37oC Ở 4oC 40oC chủng không sinh trưởng không sinh độc tố dung huyết Ở nhiệt độ lý tưởng cho phát triển vi khuẩn P.damselae T1.7 T1.8 28oC khả sinh độc tố gây dung huyết cao Điều chứng tỏ phát triển vi khuẩn có tương quan thuận với khả sinh độc tố dung huyết Hay nói cách khác, phát triển vi khuẩn mạnh độc tố gây dung huyết mà chúng tiết cao, chúng có liên quan đến khả gây bệnh đối tượng cá nuôi 3.2.2 Ảnh hưởng pH Độ pH ảnh hưởng tới tính thấm qua màng, hoạt động chuyển hoá vật chất tế bào, hoạt tính enzim, hình thành ATP vi khuẩn Các vi khuẩn gây bệnh môi trường pH < 4,5; khoảng pH thuận lợi 4,6- 9,0 hầu hết vi khuẩn không sống môi trường pH > 9,0 Vi khuẩn P.damselae xác định nguyên nhân gây bệnh tụ huyết trùng cá biển nhiều vùng địa lý khác Hai chủng vi khuẩn P.damselae T1.7 T1.8 tăng sinh môi trường BHI có độ pH là: 5; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0 nằm khoảng thuận lợi vi khuẩn nói chung, 28ºC 24 để xác định pH thích hợp cho phát triển vi khuẩn, đồng thời, thạch 34 máu chuẩn độ với điều kiện pH để theo dõi tượng dung huyết Kết theo dõi pH thích hợp cho sinh trưởng sinh độc tố vi khuẩn thể Hình 3.6 Bảng 3.4 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH đến phát triển vi khuẩn P.damselae Theo dõi sau 24h nuôi cấy 28oC cho thấy, hai chủng P.damselae có khả thích nghi tương đối giống yếu tố pH có xu hướng phát triển mạnh miền pH kiềm tính Cụ thể, chủng P.damselae T1.7 sinh trưởng tốt khoảng pH từ 8,0- 8,5 chủng P.damselae T1.8 thích nghi với pH thấp khoảng 7,5- 8,0 Điều giải thích vi khuẩn phân lập từ đối tượng sống môi trường khác nhau, khả thích nghi phát triển chúng có sai khác định Hai chủng vi khuẩn P.damselae T1.7 T1.8 không sinh độc tố dung huyết pH 5- 6,5; pH từ - 9, hai chủng sinh độc tố dung huyết Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH đến khả gây dung huyết vi khuẩn P damselae T1.7 T1.8 Chủng vi khuẩn P damselae pH 5,5 6,5 7,5 8,5 T1.7 - - - - + + + + + T1.8 - - - - + + + + + 35 3.2.3 Ảnh hưởng độ mặn (NaCl) Vi khuẩn P.damselae có khả gây bệnh động vật nước mặn người Do để tìm độ mặn thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng phân lập, khảo sát sinh trưởng phát triển vi khuẩn nồng độ muối: 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; môi trường BHI nhiệt độ 28oC, bên cạnh đó, thạch máu cừu bổ sung muối NaCl với nồng độ để theo dõi khả sinh độc tố dung huyết Kết theo dõi thể Hình 3.7 Bảng 3.5 Hình 3.7 Ảnh hưởng độ mặn đến phát triển vi khuẩn P.damselae Kết hình 3.12 cho thấy: độ mặn thích hợp cho chủng vi khuẩn thí nghiệm sinh trưởng từ – 2,5%, độ mặn cao khả sinh trưởng vi khuẩn giảm dần thấp nồng độ 6% Hai chủng vi khuẩn thích nghi tốt điều kiện nước mặn nước lợ Ở nồng độ muối từ - 5,5%, chúng sản sinh độc tố dung huyết (Bảng 3.5) Như vậy, tốc độ tăng trưởng chậm điều kiện bất lợi, mức độ sản sinh độc tố P.damselae không thay đổi Ở nồng độ muối 6% vi khuẩn không sinh sản dẫn đến độc tố gây dung huyết 36 Bảng 3.5 Ảnh hưởng độ mặn đến khả gây dung huyết vi khuẩn P damselae T1.7 T1.8 Chủng vi khuẩn Nồng độ muối NaCl (%) P damselae 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 T1.7 + + + + + + + + + + - T1.8 + + + + + + + + + + - 3.3 Kết thử nghiệm khả kháng kháng sinh chủng Photobacterium damselae phân lập Trong thí nghiệm này, đánh giá khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập T1.7, T1.8, T4.2, T4.3, T4.4, B5.22, B10.25 với loại kháng sinh cho phép sử dụng động vật thủy sản là: Ampicilin 25µg, Gentamycin 30µg, Norfloxacin 10µg, Enrofloxacin 5µg, Erythromycin 15µg (Hãng sản xuất: MAST/ Anh) Kết thử nghiệm kháng sinh thể Bảng 3.6 Hình 3.8 Bảng 3.6: Khả kháng kháng sinh chủng P.damselae phân lập Tên Ampicilin Gentamycin Norfloxacin Enrofloxacin Erythromycin chủng 25µg 30µg 10µg 5µg 15µg D D D D D T1.7 R 20 S R R 13 R T1.8 R 20 S 22 S 20 S 25 S T4.2 R 20 S 20 S 23 S 22 S T4.3 R 24 S 16 I 22 S 23 S T4.4 R 20 S 20 S 17 I 27 S B5.22 R 20 S 20 S 18 I 15 I B10.25 R 12 R 25 S 20 S 12 R S: Nhạy (≥20 mm), I: Nhạy trung bình (15-19 mm), R: Kháng (≤14 mm), D: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) 37 Kết thử khả kháng kháng sinh mẫu vi khuẩn P.damselae phân lập cho thấy: - Tất chủng thử nghiệm có khả kháng kháng sinh Ampicilin - chủng nhạy cảm, chủng kháng với kháng sinh Gentamycin - chủng nhạy cảm, chủng trung tính, chủng kháng với kháng sinh Norfloxacin - chủng nhạy cảm, chủng trung tính, chủng kháng với kháng sinh Enrofloxacin - chủng nhạy cảm, chủng trung tính, chủng kháng với kháng sinh Erythromycin Hình 3.8 Đánh giá khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn P.damselae phân lập Đánh giá chủng vi khuẩn P.damselae phân lập được, nhận thấy chủng kháng không mẫn cảm với kháng sinh Ampicilin Các chủng vi khuẩn tương đối mẫn cảm với Gentamycin, Norfloxacin, Enrofloxacin Norfloxacin Thực tế, vài chủng vi khuẩn P.damselae phân lập từ cá nuôi trang trại nuôi cá, vậy, trình nuôi thả, nhiều có sử dụng kháng sinh với mục đích phòng bệnh kích thích tăng trưởng Từ kết kết luận sơ bộ: kháng sinh có hiệu lực dùng điều trị bệnh tụ huyết trùng Gentamycin, Norfloxacin, Enrofloxacin Erythromycin 38 3.3 Khả gây bệnh cho cá mú chủng vi khuẩn phân lập Qua kết phân lập định danh vi khuẩn, thu chủng chủng sinh độc tố gây dung huyết (hemolysin), yếu tố định độc lực khả gây bệnh P.damselae Theo tài liệu nước nghiên cứu tình hình bệnh P.damselae, độc tố không gây bệnh cho cá mà chúng gây bệnh người trường hợp có vết thương hở tiếp xúc với nguồn vi khuẩn Để đánh giá mối tương quan độc lực độc tố dung huyết với mức độ gây bệnh cho cá, tiến hành nghiên cứu sau: Cá đưa vào gây bệnh hoàn toàn khoẻ mạnh trước tiến hành cảm nhiễm nhân tạo Cá nuôi điều kiện yếu tố thuỷ lý, thuỷ hoá thích hợp Thời gian tiêm 14h00 ngày 20 tháng năm 2015, cá nuôi có sục khí liên tục, cá lô đối chứng tiêm nước muối sinh lý 0,85%/con Kết tiến hành cảm nhiễm gây bệnh thực nghiệm chủng vi khuẩn phân lập cho cá Mú phòng thí nghiệm có kết cụ thể sau: sau 24 gây nhiễm cá có biểu bệnh điển hình xuất huyết, cá bị nhiễm bệnh chết sau 48 sau xuất dấu hiệu bệnh lý Trong nghiên cứu bệnh học, người ta xác định khả bị bệnh vật nuôi phụ thuộc vào yếu tố: môi trường sống, mầm bệnh, độc lực thể vật chủ Khi yếu tố giao thoa với tạo nên tình trạng bệnh lý Ở tất liều thí nghiệm có cá chết, ngoại trừ lô đối chứng không gây chết cá thí nghiệm Kết gây bệnh thực nghiệm thể qua (Bảng 3.7) 39 Bảng 3.7: Kết cảm nhiễm cá mú vi khuẩn P.damselae Chủng vi Tỷ lệ cá chết Tỷ lệ cá chết Tỷ lệ cá chết Tỷ lệ cá chết khuẩn sau ngày sau ngày sau ngày sau ngày (%) (%) (%) (%) T1.7 50 70 100 B5.22 20 20 50 T4.4 40 20 60 B10.25 10 20 30 T4.2 30 20 60 T4.3 20 30 60 T1.8 50 30 100 Lô đối 0 0 chứng Chủng T1.7 chủng T1.8 gây chết cá thí nghiệm với tỷ lệ cao, gây chết 100% cá thí nghiệm sau ngày tiêm, dấu hiệu bệnh tích: bong vẩy vị trí tiêm, xuất huyết mang, gốc vây thân, bề mặt gan xuất u hạt màu trắng Chủng T4.2, T4.3, T4.4 có độc lực tương đối cao, gây chết 60% cá thí nghiệm sau ngày tiêm với dấu hiệu bệnh tích: xuất huyết nhẹ mang hàm, lở loét vị trí tiêm, nội tạng bắt đầu hoại tử Chủng B5.22 B10.25 có độc lực không cao, gây chết cá thí nghiệm 50% sau ngày tiêm dấu hiệu xuất huyết rõ rang thể cá Kết cảm nhiễm cho thấy vi khuẩn P.damselae tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng cho cá biển nuôi lồng 40 Hình 3.9 Dấu hiệu bệnh lý cá sau gây nhiễm Những cá chết gần chết sau gây bệnh thực nghiệm giải phẫu để kiểm tra, quan sát biến đổi bệnh lý quan nội tạng bên thể Sau lại tiến hành tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận, mắt não cá môi trường thạch nước biển sau 24h nhiệt độ 28ºC Kết cho thấy khuẩn lạc có màu sắc hình thái giống với khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ mẫu cá biển lúc thu mẫu Vi khuẩn tái phân lập từ cá bệnh khoảng 24 – 48 sau gây nhiễm xác định có tiêu hình thái, sinh hoá giống chủng vi khuẩn cảm nhiễm P.damselae Dưới hình ảnh kết trình phân lập lại vi khuẩn P.damselae từ mẫu cá sau cảm nhiễm (Hình 3.11.) 41 Hình 3.10 Hình ảnh kết phân lập lại chủng P.damselae a Hình thái khuẩn lạc ria TCBS b Phản ứng sinh Catalase c Phản ứng sinh Indol với Kovac’s d Phản ứng KIA Kết cho thấy, chủng vi khuẩn Photobacterium damselae tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng cá biển nuôi lồng 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A Kết luận Từ 46 chủng ban đầu, qua trình phân lập nghiên cứu đặc tính sinh hoá xác định chủng có đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý sinh hoá phù hợp với Photobacterium damselae: trực khuẩn, gram âm, lưỡng cực, phản ứng dương tính với catalase, âm tính với Indol, sử dụng Glucose sinh acid, sinh hơi, không sinh H2S, không sử dụng đường Sucrose, tán huyết môi trường thạch máu cừu,… Đối với chủng P.damselae phân lập được: có tính kháng cao Ampicilin, chủng mẫn cảm với Gentamycin, Norfloxacin, Erythromycin Enrofloxacin Các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho tăng trưởng sinh độc tố gây dung huyết P.damselae T1.7 P damselae T1.8 là: nhiệt độ từ 20 - 37oC, pH từ 7,5 – 8,5; độ mặn từ 1,5 - 2,5% Các chủng vi khuẩn P damselae phân lập chủng có khả sản sinh độc tố dung huyết Các vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng cá biển thực nghiệm với biểu bệnh tích xuất huyết sâu mang, miệng, gốc vây, lở loét vị trí tiêm, trướng bụng, bơi không định hướng…Chủng vi khuẩn P.damselae T1.7 P.damselae T1.8 có độc lực cao, gây chết 100% cá thí nghiệm sau ngày tiêm B Kiến nghị Có thể sử dụng số kháng sinh như: Gentamycin, Norfloxacin, Enrofloxacin, Erythromycin để điều trị bệnh tụ huyết trùng P.damselae gây cá biển Do thời gian có hạn nên hoàn thành đề tài với nội dung Cần có nhiều thời gian nghiên cứu mức độ sinh phân tử để tìm loại kháng sinh điều trị bệnh sản xuất vắc-xin thương mại phòng trị bệnh tụ huyết trùng cho cá biển nuôi lồng Việt Nam 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu Tiếng Việt Bộ Thủy Sản (2006) Báo cáo đánh giá kết thực chương trình phát triển nuôi trồng thủy sản giai đoạn 2000-2005 biện pháp thực đến năm 2010 168 trang Phạm Công Hoạt (2005), “Bài giảng vấn đề vi sinh vật” Bộ khoa học công nghệ Marketing nông nghiệp, ngành Thủy sản Tổng quan ngành thuỷ sản Việt Nam, 14/6/2013 PGS.TS.Nguyễn Thanh Phương (chủ biên) Giáo trình nuôi trồng thủy sản Trang tin thị trường xúc tiến thương mại, chuyên trang thủy sản, tin xuất nhập phát ngày 06/01/2015: Xuất thuỷ sản năm 2015 đối mặt nhiều thách thức Trang thông tin điện tử – tổng cục thủy sản, Tổng quan nuôi trồng thủy sản giới giai đoạn 2000-2012, 16/10/2014 B Tài liệu Tiếng Anh Agariños B., Romalde J.L., Cid A., and Toranzo A.E (1997), Viability of starved Pasteurella piscicida in seawater monitored by fl o w cytometry and the effects of antibiotics on its resusci- tation Letters in Applied Microbiology 24, 122–126 Alvarez J.R., Lamba S., Dyer KY., Apuzzio J.J (2006) An unusual case of urinary tract infection in a pregnant woman with Photobacterium damselae Infect Dis Obstet Gynecol.80682 :1–3 Asato J., Kanaya F 2004 Fatal infection of the hand due to Photobacterium damsela: a case report Clin Infect Dis 38:e100–e101 10 Austin, B., Austin, D.A., Blanch, A.R., Cerdà, M., Grimont, F., Grimont, P.A.D., Jofre, J., Koblavi, S., Larsen, J.L., Pedersen, K., Tiainen, T., Verdonck, L and Swings, J (1997) A comparison of methods for the typing of fish-pathogenic Vibrio spp Systematic and Applied Microbiology 20, 89–101 44 11 A Labella, C Berbel, M Manchado, D Castro and Borrego J.J (2011) Photobacterium damselae subsp Damselae, an emerging pathogen affecting new culture marine fish species in Southern Spain Archives of virology 142, 2345-2364 12 Clarridge, J.L & Zighelboim-Daum S (1985) Isolation and characterization of two hemolytic phenotypes of Vibrio damsela associated with a fatal wound infection Journal of Clinical Microbiology 21: 302-306 13 Cutter D.L., Kreger A.S 1990 Cloning and expression of the damselysin gene from Vibrio damsela.Infect Immun 58:266–268 14 Fouz B., Barja J.L., Amaro C., Rivas C., Toranzo A.E 1993 Toxicity of the extracellular products of Vibrio damsela isolated from diseased fish Curr Microbiol 27:341–347 15 Fouz B., Biosca, E.G and Amaro, C (1997) High af fi nity iron-uptake systems in Vibrio damsela: role in the acquisition of iron from transferrin Journal of Applied Microbiology 82 , 157–167 16 Fouz B., Toranzo, A.E., Millan, M & Amaro, C (2000) Evidence that water transmits the disease caused by the fish pathogen Photobacterium damselae subsp damselae Journal of Applied Microbiology 88: 531-535 17 Fraser, S.L., Purcell, B.K., Delgado, B., Jr., Baker, A.E & Whelen, A.C (1997) Rapidly fatal infection due to Photobacterium (Vibrio) damsela Clinical Infectious Diseases 25: 935- 936 18 Gauthier, G., Lafay, B., Ruimy, R., Breittmayer, V., Nicolas, J.L., Gauthier, M & Christen, R (1995) Small-subunit rRNA sequences and whole DNA relatedness concur for the reassignment of Pasteurella piscicida (Snieszko et al.) Janssen and Surgalla to the genus Photobacterium as Photobacterium damsela subsp piscicida comb Nov International Journal of Systematic Bacteriology 45: 139-144 19 Hawke, J.P., Plakas, S.M., Minton, R.V., McPhearson, R.M., Snider, T.G & Guarino, A.M (1987) Fish pasteurellosis of cultured striped bass (Morone saxatilis) in coastal Alabama Aquaculture: Volume 65, Issues 3–4, 15 September 1987, Pages 193–204 20 Kim H.R., Kim J.W., Lee M.K., Kim J.G 2009 Septicemia progressing to fatal hepatic dysfunction in a cirrhotic patient after oral ingestion of Photobacterium damsela: a case report Infection 37:555–556 45 21 Labella A., et al 2010 Toxicity of Photobacterium damselae subsp damselae strains isolated from new cultured marine fish Dis Aquat Org 92:31–40 22 Morris J.G., Jr., et al 1982 Illness caused by Vibrio damsela and Vibrio hollisae Lancet i: 1294–1297 23 Nicky B (author), Department of Agriculture and Food, Western Australia Bacteria and Fungi from Fish and other Aquatic Animals: A Practical Identification Manual, 2nd Edition 24 Osorio C.R., Romalde J.L., Barja J.L., Toranzo A.E 2000 Presence of phospholipase D (dly) gene coding for damselysin production is not a pre-requisite for pathogenicity in Photobacterium damselae subsp damselae Microb Pathog 28:119–126 25 Pasqualina Laganas, Gabriella Caruso, Eleonora Minutoli, Renata Zaccone, Santi Delia Susceptibility to antibiotics of Vibrio spp and Photobacterium damsela ssp Piscicida strains isolated from Italian aquaculture farms The new microbiologica 34, 1/2011, 53-63 26 Rajan P.R1 , J.H.-Y Lin1 , M.-S Ho1 and H.-L Yang1,2 Simple and rapid detection of Photobacterium damselae ssp piscicida by a PCR technique and plating method Journal of Applied Microbiology 2003, 95, 1375– 1380 With 1Institute of BioAgricultural Sciences, Academia Sinica, Nankang, Taipei, Taiwan and 2Institute of Biotechnology, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan 27 Robohm R.A (1983) Pasteurella piscicida In: Anderson DP, Dorsonand M, Dubourget P (eds) Antigens of fish pathogens Collection Foundation Marcel Merieux, Lyon, France, pp 161–175 28 S.Botella, M.-J.Pujalte, M.-C.Maciasn, J Hernandez and E Garay (2002) Amplified fragment length polymorphism (AFLP) and biochemical typing of Photobacterium damselae subsp Damselae Journal of Applied Microbiology, Volume 93, Issue 4, 681–688 29 Thyssen, A., Van Eygen S., Hauben L., Goris, J., Swings J and Ollevier F The applica- tion of AFLP for taxonomic and epidemiological studies of Photobacterium damselae subsp piscicida International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50, 1013–1019 30 Yamane K., et al 2004 Two cases of fatal necrotizing fasciitis caused by Photobacterium damsela in Japan J Clin Microbiol 42:1370–1372 46 C Tài liệu Internet 31 http://en.wikipedia.org/wiki/Photobacterium_damselae_subsp._piscicida 32 http://www.slideshare.net/thuysantruongphat/chi-tit-v-bnh-ca-c-bin 33 www.intechopen.com/download/pdf/24078 34 www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24093021 47 [...]... Dựa vào các kết quả sinh hóa tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn P.damsalae Dựa vào các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Photobacterium damselae: sử dụng và sinh gas từ đường glucose, khả năng sinh indole, phản ứng dung huyết, catalase và dựa vào kết quả sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, ta lựa chọn được các chủng vi khuẩn Photobacterium damselae Bước 6: Tiến hành giữ giống các chủng vi khuẩn. .. gây bệnh tụ huyết trùng của các chủng vi khuẩn P .damselae phân lập được trên cá thí nghiệm 2.2.6 Phương pháp đánh giá sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P .damselae - Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy: Thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng và khả năng gây dung huyết ở các nhiệt độ: 4ºC, 20ºC, 28ºC, 37ºC, 40ºC Kiểm tra mật độ vi khuẩn và khả... với các chủng cho thấy một quầng tán huyết lớn (LH) và các chủng sản xuất một quầng tán huyết nhỏ (SH), ngoài ra có các chủng lại có thể được mô tả như vừa tán huyết (MH) [12,13,14,21,24] 1.3.5 Độc tố vi khuẩn và cơ chế gây bệnh Photobacterium damselae, trước đây là Vibrio damselae, là một tác nhân gây bệnh của một loạt các động vật biển như cá, động vật giáp xác, động vật thân mềm và các loài thú biển. .. tính; (-) âm tính; (V) dương tính hoặc âm tính 1.3.4 Đặc điểm gây bệnh của Photobacterium damselae Gây bệnh trên cá: Rất nhiều báo cáo khoa học đề cập đến bệnh do Photobacterium damselae (P .damselae) trên cá biển nuôi công nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới Các loài cá tự nhiên (cá Trinh nữ, cá da trơn, cá Mập, cá Đuối gai độc, vv…), cũng như các 10 loài cá có tầm quan trọng kinh tế trong nuôi trồng... vô khuẩn và xác định tính kháng kháng sinh của các chủng phân lập 2.2.5 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm Vi khuẩn P .damselae gây bệnh cho cá biển nuôi lồng với triệu chứng điển hình là: xuất hiện vết loét, có mủ trên da, cá kém ăn hoặc bỏ ăn, da màu sẫm; trong nội tạng, thận bị sưng, xuất hiện các đốm trắng dạng hạt trong lách, thận, gan tuỵ Nghiên cứu đặc tính gây bệnh tụ huyết trùng trên cá. .. cá biển của vi khuẩn P.damsalae được tiến hành theo phương pháp sau: Bước 1: Tăng sinh các chủng vi khuẩn P.damsalae đã phân lập được Bước 2: Gây nhiễm cho cá thí nghiệm với các chủng vi khuẩn P.damsalae bằng đường tiêm gốc vây đuôi với liều tiêm 0,5ml/ con Bước 3: Tiến hành nuôi, theo dõi tiến trình bệnh và mổ xác định mức độ gây bệnh trên các con cá thí nghiệm Bước 4: Đánh giá đặc tính và mức độ gây. .. và trimethoprim-sulfamethoxazole [29] Nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh là cơ sở quan trọng để đưa ra các biện pháp trong phòng và điều trị bệnh trên cá nuôi biển Hiện nay, chưa có một công trình nghiên cứu nào trong nước công bố về khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P .damselae phân lập tại Vi t Nam 1.3.7 Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Photobacterium damselae. .. thành vi n trong chi Listonella Đến năm 1991, được chuyển giao cho các chi Photobacterium Trong một nghiên cứu sau đó của Gauthier và các cộng sự (1995) về các tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng ở một số loài cá đã xác định chủng 8 vi khuẩn này là một thành vi n của Photobacterium damselae bằng phương pháp phân tích loài theo các trình tự 16S rDNA và DNA [18] 1.3.2 Đặc điểm hình thái Hình 1 3 Hình thái vi. .. sót sau dịch bệnh có thể trở thành nguồn mang mầm bệnh P .damselae trong nước [28] Cá có thể được gây nhiễm bằng cách tiêm, ngâm, cho ăn thức ăn chứa vi khuẩn, nuôi chung cá khoẻ với cá bệnh - Khả năng gây dung huyết 12 P damselae, tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng ở cá Chúng có khả năng dung huyết trên đĩa thạch máu cừu (dạng β) Mức độ khác nhau giữa các tán huyết P .damselae đã được phân lập Hai kiểu... thủy sản (cá Mú, cá Giò, cá Tráp, cá Bống bớp, cá Vược) đã chịu rất nhiều thiệt hại do P .damselae gây ra [7] Các báo cáo gần đây về sự cô lập của tác nhân gây bệnh này từ cá biển bị bệnh trên các loài nuôi mới, cho rằng P .damselae có thể được coi như là một tác nhân gây bệnh mới nổi trong nuôi trồng thủy sản biển (Labella et al, 2011) P .damselae được tìm thấy nhiều hơn trong các loài cá biển trong