SVTH : Nguyễn Thị Thùy Linh VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài : SÀNG LỌC CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME LACCASE VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM CỦA CHÚNG Người hướng dẫn : TS ĐINH THỊ THU HẰNG Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ THÙY LINH Lớp : YTMT.11-04 Hà Nội – 2015 Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Nguyễn Thị Thùy Linh LỜI CẢM ƠN Trước hết xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà TS Đinh Thị Thu Hằng – Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học Việt Nam tận tình hướng dẫn, bảo, quan tâm giúp đỡ trình thực đề tài Tôi xin ghi nhận chân thành cảm ơn, quan tâm hướng dẫn dạy bảo nhiệt tình cán bộ, anh chị phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam : KS Hoàng Thị Nhung, KS Trần Thị Thu Hiền, KS Nguyễn Hải Vân, Ths Ngô Thị Huyền Trang, CN Nguyễn Văn Huynh , Ths Đào Thị Ngọc Ánh Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy, cô Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội giúp đỡ, dạy bảo suốt năm học vừa qua Cuối xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ người thân yêu tôi, người động viên, giúp đỡ học tập sống Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Linh Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Nguyễn Thị Thùy Linh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU CHƯƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzyme laccase 1.1.1 Giới thiệu chung laccase 1.1.2 Cấu trúc phân tử laccase .3 1.1.3 Cơ chế xúc tác laccase 1.1.4 Tính chất hóa sinh laccase 1.1.5 Sự phân bố khả sinh tổng hợp laccase vi sinh vật 1.1.6 Ứng dụng laccase tiềm nghiên cứu laccase Việt Nam 1.2 Giới thiệu xạ khuẩn 10 1.2.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên 10 1.2.2 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 10 1.2.3 Cấu tạo xạ khuẩn 11 1.2.4 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 12 1.2.5 Ứng dụng xạ khuẩn 12 1.2.6 Đặc tính laccase từ xạ khuẩn 13 1.3 Thuốc nhuộm 14 1.3.1 Thuốc nhuộm vi sinh vật phân hủy thuốc nhuộm 14 1.3.2 Các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm 17 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Nguyễn Thị Thùy Linh 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Thiết bị máy móc 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phân lâp sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh laccase 21 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính laccase 21 2.2.3 Phân loại định tên xạ khuẩn 22 2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện môi trường đến khả sinh tổng hợp laccase chủng xạ khuẩn ACBT20 22 2.2.4.1 Ảnh hưởng tốc độ nuôi lắc 22 2.2.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy 23 2.2.4.3 Ảnh hưởng pH ban đầu 23 2.2.4.4 Ảnh hưởng chất cảm ứng 23 2.2.4.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon 23 2.2.4.6 Ảnh hưởng kim loại 23 2.2.4.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ 24 2.2.5 Đánh giá sinh trưởng chủng ACBT20 24 2.2.6 Đánh giá độ bền nhiệt enzyme thô thu từ chủng ACBT20 24 2.2.7.Nghiên cứu khả loại màu dịch enzyme thô chủng đại diện 24 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh laccase từ compost 26 3.2 Phân loại chủng ACBT20 27 3.3 Ảnh hưởng số điều kiện môi trường đến khả sinh tổng hợp laccase chủng xạ khuẩn ACBT20 27 3.3.1 Ảnh hưởng tốc độ lắc 28 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 28 Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Nguyễn Thị Thùy Linh 3.3.3 Ảnh hưởng pH 30 3.3.4 Ảnh hưởng chất cảm ứng 31 3.3.5 Ảnh hưởng kim loại 32 3.3.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ 33 3.3.7 Ảnh hưởng nguồn cacbon 34 3.3.7.1 Lựa chọn nguồn cacbon 34 3.3.7.2 Ảnh hưởng nồng độ glucose 35 3.4 Đánh giá độ bền nhiệt enzyme thô thu từ chủng ACBT20 35 3.5 Khả loại màu dịch enzyme thô chủng ACBT20 36 CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Nguyễn Thị Thùy Linh DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT 2,6- DMP 2,6-Dimethoxyphenol ABTS 2,2′-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) DDT dichloro diphenyl trichlorothane DNA Axit Deoxyribo Nucleic HOBT Hydroxybenzotriazole HSCC Hệ sợi chất HSKS Hệ sợi khí sinh ISP International Streptomyces Project KHVĐT Kính hiển vi điện tử KHVQH Kính hiển vi quang học PAH Hidrocacbon thơm đa nhân RNA Ribonucleic Acid VIO violuric acid VSV Vi sinh vật XK Xạ khuẩn Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Nguyễn Thị Thùy Linh DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Một số loại thuốc nhuộm thường gặp 16 Bảng2.1Thành phần môi trường 20 Bảng 2 Thành phần phản ứng 21 Bảng Hoạt tính chủng xạ khuẩn khảo sát 26 Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Nguyễn Thị Thùy Linh DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu tạo nguyên tử đồng T1 Hình 1.2 Hình ảnh không gian ba chiều laccase từ nấm đảm trắng M albomyces Hình 1.3 Trung tâm hoạt động laccase từ Bacillus subtilis Hình 1.4 Sơ đồ chế xúc tác laccase Hình 1.5 Cơ chế xúc tác laccase Hình Hình thái khuẩn lạc chủng xạ khuẩn ACBT20 27 Hình Hình thái bào tử chủng xạ khuẩn ACBT20 kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 10.000 lần 27 Hình 3 Ảnh hưởng tốc độ lắc lên khả sinh laccase chủng ACBT20 28 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh laccase chủng ACBT20 29 Hình Ảnh hưởng pH lên khả sinh laccase chủng ACBT20 30 Hình Ảnh hưởng chất cảm ứng lên khả sinh laccase chủng ACBT20 31 Hình Ảnh hưởng kim loại lên khả sinh laccase chủng ACBT20 32 Hình Ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả sinh laccase chủng ACBT20 33 Hình Ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả sinh laccase chủng ACBT20 34 Hình 10 Ảnh hưởng nồng độ glucose lên khả sinh laccase chủng ACBT20 35 Hình 11: Đánh giá độ bền nhiệt enzyme thô thu từ chủng ACBT20 36 Hình 12: Khả loại màu NY1 dịch enzyme thô bổ sung chất gắn kết chủng ACBT20 20 h 38 Hình 13: Khả loại màu NY5 dịch enzyme thô bổ sung chất cảm ứng trung gian chủng ACBT20 13,5h 38 Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Nguyễn Thị Thùy Linh Hình 14 Khả loại màu RBBR dịch enzyme thô bổ sung chất gắn kết chủng ACBT20 13,5 h 39 Hình 15 Phổ UV loại màu RBBR mẫu có dịch enzyme thô chủng ACBT20 mẫu đối chứng 39 Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Cùng với phát triển kinh tế, kéo theo hàng loạt vấn đề ô nhiễm môi trường Vấn đề rác thải vấn đề báo động tỉnh, thành phố nước Các loại rác thải sinh hoạt chủ yếu đem chôn lấp, số xử lý, gây ô nhiễm nguồn nước ngầm ô nhiễm không khí trầm trọng, bãi rác ngày tải hàng loạt vấn đề kéo theo phát thải khí metan, nước rác đặc biệt mùi, kết việc phân hủy tự nhiên chất hữu có rác thải Vì vậy, vấn đề đặt phải có biện pháp xử lý rác thải hiệu quả, không gây ô nhiễm môi trường, tái sử dụng rác thải thành sản phẩm có giá trị kinh tế Do đó, nhiệm vụ nhà khoa học công nghệ phải tìm biện pháp khả thi giúp giải vấn đề ô nhiễm môi trường phù hợp với điều kiện Việt Nam Biện pháp ưu tiên hàng đầu để xử lý rác thải sử dụng phương pháp phân hủy sinh học, thành phần chủ yếu rác thải sinh hoạt chiếm 65-90% thành phần hữu cơ, sử dụng phương pháp sinh học tốn kém, không gây ô nhiễm môi trường phù hợp với quy luật tự nhiên Trong trình phân hủy sinh học hiếu khí chất thải hữu hay gọi ủ compost, nhiều nhà nghiên cứu phát có mặt số chủng xạ khuẩn có khả sinh trưởng phát triển đống ủ compost Streptomyces thermotolerans, S iakyrus, S thermocarboxydus Điều chứng minh rằng, xạ khuẩn có khả phân hủy hợp chất hữu compost sử dụng chúng làm nguồn dinh dưỡng Trong năm gần đây, enzyme ngoại bào nói chung laccase nói riêng chủng vi sinh vật quan tâm ứng dụng to lớn nghành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm v.v đặc biệt lĩnh vực nghiên cứu loại màu thuốc nhuộm Các nghiên cứu laccase chủ yếu tập trung nấm đảm Hiện nay, có thông tin chủng vi khuẩn, đặc biệt xạ khuẩn có khả sinh laccase có mặt compost Từ nhu cầu thực tiễn mà đề tài “Sàng lọc chủng xạ khuẩn có khả sinh enzyme Khóa luận tốt nghiệp Page 1136 U/l), CoCl2, ZnSO4, CuSO4 kim loại gần ức chế khả sinh tổng hợp laccase chủng ACBT20 Hoạt tính laccase lại đạt giá trị lớn mẫu đối chứng 1136 U/l môi trường không bổ sung kim loại Trong đó, hoạt tính laccase chủng Streptomyces sp C1 [26] tăng lên 56,1% bổ sung Co2+ với nồng độ mM vào môi trường nuôi cấy, nồng độ đó, bổ sung K+ lại làm hoạt tính laccase giảm 98,4% Với S lydicus [29] hoạt tính lacase tăng lên gấp lần bổ xung Ca2+ hoạt tính loài bị ức chế hoàn toàn môi trường có chứa Ag+ Như vậy, chủng ACBT20 đạt hoạt tính cao môi trường nuôi cấy không cần bổ sung thêm kim loại khác 3.3.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ Cùng với cacbon, nitơ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng sinh enzyme vi sinh vật Để đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh laccase, chủng ACBT20 nuôi cấy môi trường có chứa nguồn nitơ khác nhau, bao gồm NH4NO3, (NH4)2SO4, cao thịt, pepton, bột đậu tương Kết xác định hoạt tính laccase trình bày hình3.8 Hình Ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả sinh laccase chủng ACBT20 Chủng ACBT20 khả sinh enzyme laccase môi trường chứa nguồn nitơ hữu Còn với môi trường chứa nguồn nitơ vô cơ, chủng sinh laccase nguồn nitơ sử dụng có gốc nitrat gốc nitrat kết hợp với gốc amoni Kết cụ thể trình bày hình 3.8 sau: hoạt tính laccase lớn Khóa luận tốt nghiệp Page 33 679,5 (U/l) nguồn nitơ sử dụng KNO3, đạt 404,5 (U/l) sử dụng NH4NO3 Một nghiên cứu Prema cộng (2008) cho thấy, chủng S psammoticus [35] lại cho hoạt tính laccase cao nguồn nito hữu cao nấm men với U/ml , nguồn nito vô lại cho hoạt tính laccase thấp nguồn NaNO3 hoạt tính laccase đạt 3,2 U/ml Kết thu cho thấy, chủng vi sinh vật phù hợp với nguồn nitơ khác Như vậy, với chủng ACBT20 môi trường chứa nguồn nitơ ban đầu KNO3 giúp cho chủng sinh laccase tốt so với nguồn nitơ khác nghiên cứu 3.3.7 Ảnh hưởng nguồn cacbon 3.3.7.1 Lựa chọn nguồn cacbon Chủng ACBT20 nuôi cấy môi trường chứa nguồn cacbon khác nhau, bao gồm glucose, rỉ đường, laccase, cellulose, saccharose để đánh giá ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng khả sinh laccase Kết trình bày hình 3.9 Hình Ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả sinh laccase chủng ACBT20 Kết cho thấy, chủng xạ khuẩn ACBT20 có sinh trưởng tốt hai nguồn cacbon cellulose, saccharose Tuy nhiên hoạt tính laccase thu nguồn saccharose không cao (352 U/l), thấp nhiều so với nguồn glucose rỉ đường (hoạt tính 965,5 U/l 870 U/l) Hoạt tính laccase cao Khóa luận tốt nghiệp Page 34 môi trường sử dụng glucose (965,5 U/l ), glucose dạng đường đơn giản nên vi sinh vật dễ dàng hấp thụ để sinh trưởng phát triển Do đó, glucose sử dụng cho thí nghiệm Một số nghiên cứu cho thấy glucose nguồn cacbon thích hợp cho sinh tổng hợp laccase xạ khuẩn [7] Như loài S pasammoticus [35], hoạt tính laccase cao 32,1 (U/g) với nguồn cacbon thích hợp glucose, nguồn cacbon khác làm giảm hoạt tính laccase loài 3.3.7.2 Ảnh hưởng nồng độ glucose Dải nồng độ glucose gồm 5; 10; 15 20 g/l sử dụng để đánh giá ảnh hưởng nồng độ glucose lên sinh tổng hợp laccase chủng ACBT20 Kết trình bày hình 3.10 Hình 10 Ảnh hưởng nồng độ glucose lên khả sinh laccase chủng ACBT20 Kết thí nghiệm cho thấy, chủng ACBT20 sinh trưởng phát triển tốt nồng độ glucose từ 10 – 20 g/l với lượng sinh khối thu đươc 2,5 (g/l) nồng độ 10 (g/l), 2,65 (g/l) nồng độ 15 (g/l) (g/l) nồng độ 20 (g/l) Hoạt tính laccase chủng ACBT20 nồng độ g/l 20 g/l tương đối gần (hoạt tính laccase 7,2 % ) Như vậy, nồng độ glucose g/l thích hợp để lựa chọn cho thí nghiệm tiếp theo, giúp tiết kiệm chi phí sản xuất phù hợp để đưa chủng vi sinh vật vào quy mô công nghiệp 3.4 Đánh giá độ bền nhiệt enzyme thô thu từ chủng ACBT20 Khóa luận tốt nghiệp Page 35 Để đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính dịch enzyme thô, dịch enzyme thô chủng ACBT20 ly tâm, đun sôi xác định hoạt tính laccase sau 30 phút Hoạt tính laccase dịch enzyme thô trình bày hình 3.11 Hình 11: Đánh giá độ bền nhiệt enzyme thô thu từ chủng ACBT20 Kết cho thấy, hoạt tính laccase dịch enzyme thô thu từ chủng ACBT20 giữ 100% hoạt tính sau đun sôi 100oC ( khoảng hoạt tính thay đổi không đáng kể Một số loài khác có độ bền nhiệt thấp hơn, laccase từ T versicolor bền 60oC (Call and Mucke, 1997), laccase từ loài S.cyaneus lại bền 10oC, S lavendulae 100 phút 70oC (Suzuki et al., 2003) Bacillus subtilis Cota 112 phút 80°C (Martins et al., 2002), laccases phân lập từ chủng marasmius quercophilus (Famet et al., 2000) tìm thấy ổn định 60°C, loài S.psammoticus hoạt tính enzyme bền 70oC sau 48 [35] Kết thu chứng tỏ, chủng ACBT20 bền nhiệt độ cao, cao chủng nghiên cứu trước Đây tiềm ứng dụng chủng ACBT20 vào công nghiệp sản xuất xử lý ô nhiễm môi trường 3.5 Khả loại màu dịch enzyme thô chủng ACBT20 Để đánh giá loại màu dịch enzyme thô chủng ACBT20, màu NY1, NY5, RBBR sử dụng Tất màu bị loại bỏ mức độ khác Khóa luận tốt nghiệp Page 36 sau 24 h bổ sung chất gắn kết với hoạt tính enzyme laccase ban đầu 900 U/l (hình 3.12, 3.13 3.14) Trong loại màu nghiên cứu, RBBR bị loại bỏ nhiều với 87,5% sau 0,25 h (sau 15 phút) đạt 95% sau 13,5 h (hình 3.14) Bên cạnh NY5 loại bỏ tới 88,9% sau 13,5 h (hình 3.13) NY1 32,1% sau 20h (hình 3.12) Dịch enzyme thô ACBT20 có khả loại màu tốt từ 0,25 h đến khoảng 13,5 h Kết có ý nghĩa lớn áp dụng phân hủy sinh học mô hình công nghiệp công nghệ xử lý màu thuốc nhuộm rút ngắn thời gian xử lý đem lại hiệu kinh tế cao Trong số màu nghiên cứu, hiệu loại màu NY1 chủng ACBT20 tăng 13,8% có mặt chất gắn kết VIO tăng 4,2% có HBT (hình 3.12) Đối với NY5 RBBR, chất gắn kết hiệu ứng làm tăng khả loại màu trình loại màu Điều giải thích hai chất gắn kết chọn chưa thực phù hợp với chủng ACBT20 màu chọn nghiên cứu, cần có nghiên cứu để làm tăng hiệu loại màu chủng laccase thu từ chủng ACBT20 cách tốt Laccase từ chủng xạ khuẩn khác coa khả loại màu khác loài Streptomyces krainskii SUK-5 [30] loại 95% reactive blue –59 sau 24h, hay loài Streptomyces sp C1 [26] có khả loại 83,7% màu diamond black PV sau h Hoặc loài Streptomyces XKBH65 ( phân lập từ đất nhiễm chất độc hóa học Biên Hòa) có khả loại đươc 94,99% màu RBBR 88,3% màu NY5 sau nuôi cấy Khóa luận tốt nghiệp Page 37 ĐC E HBT VIO E ĐC Màu NY1 sau 0,25 h HBT VIO Màu NY1 sau 13,5 h Hình 12: Khả loại màu NY1 dịch enzyme thô bổ sung chất gắn kết chủng ACBT20 20 h ĐC E HBT Màu NY5 sau 0,25 h VIO ĐC E HBT VIO Màu NY5 sau 13,5 h Hình 13: Khả loại màu NY5 dịch enzyme thô bổ sung chất cảm ứng trung gian chủng ACBT20 13,5h Khóa luận tốt nghiệp Page 38 E ĐC HBT Màu RBBR sau 0,25 h VIO ĐC E HBT VIO Màu RBBR sau 13,5 h Hình 14 Khả loại màu RBBR dịch enzyme thô bổ sung chất gắn kết chủng ACBT20 13,5 h Hình 15 Phổ UV loại màu RBBR mẫu có dịch enzyme thô chủng ACBT20 mẫu đối chứng • Đường cong phía : mẫu enzyme thô • Đường cong phía : mẫu có enzyme thô Để thể rõ khả loại màu RBBR chủng ACBT20, mẫu có enzyme thô mẫu đối chứng quét phổ UV từ bước sóng 550 đến 650 nm sau thời gian22h (hình 3.15) Theo kết phân tích khối phổ dịch enzyme thô thu từ chủng ACBT20 có khả loại khoảng 82% màu RBBR CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Năm mười hai chủng xạ khuẩn phân lập tử compost Ba Trại, Ba Vì, Hà Nội có khả sinh laccase với hoạt tính ban đầutừ 44 - 300 (U/l) Chủng ACBT20 có khả sinh tổng hợp laccase cao môi trường Gause M pH 6; chất cảm ứng thích hợp vanillin 0,25 mM; nuôi tĩnh 37oC, nguồn Khóa luận tốt nghiệp Page 39 cacbon sử dụng glucose vói nồng độ g/l , nguồn nitơ sử dụng KNO3 hoạt tính laccase đạt 900,5 U/l sau ngày nuôi cấy Dịch enzyme thô thu từ chủng ACBT20 bền với nhiệt độ, hoạt tính dao động khoảng 873-880 U/l Laccase thô từ chủng ACBT20 có khả loại 95% màu thuốc nhuộm RBBR 88,9 % màu NY5 sau 13,5 h; 32,1% màu thuốc nhuộm NY1 sau 20 h Phân loại chủng ACBT20 dựa vào đặc điểm hình thái, chủng ACBT20 thuộc chi Streptomyces 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu vê ACBT20 ứng dụng quy mô khác việc phân hủy hợp chất hữu chứa vòng thơm ứng dụng loại màu thuốc nhuộm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: [1] Bùi Thị Hà (2008) “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống gây bệnh chè Thái Nguyên” Luận văn thạc sĩ sinh hoc Khóa luận tốt nghiệp Page 40 [2] Nguyễn Nguyên Quang (2010) “Phân lập nghiên cứu khả chuyển hóa số hợp chất đa vòng thơm nấm sợi sinh tổng hợp enzyme laccase từ đất nhiễm chất diệt cỏ /dioxin” Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học bách Khoa Hà Nội Tài liệu tiếng anh : [3] A Kunamneni, A Ballesteros, F J Plou, and M Alcalde (2007) “Fungal laccase- a versatile enzyme for biotechnological applications” in CommunicatIng Current Research and Educational Topics and Trends In Applied Microbiology pp 233–245 [4] A Kunamneni, J Plou, Antonio Ballesteros and Miguel Alcalde (2008) “Laccases and their applications: A patent review ” Recent Pat Biotechnol 2(1):1024 [5] A Levasseur, Markku Saloheimo, David Navarro , A.Martina, Pontarotti P, Kristiina Kruus, Eric Record (2010) “Exploring laccase-like multicopper oxidase genes from the Aascomycete Trichoderma reesei: a functional, phylogenetic and evolutionary study” Bulgarian Journal of Agricultunal Science, 13: 171-176 [6] Aramayo R1, Timberlake WE (1990) “Sequence and molecular structure of the Aspergillus nidulans yA (laccase I) gene” Nucleic Acids Res 18(11):3415 [7] Banci L1, Ciofi-Baffoni S, Tien M (1999)“Lignin and Mn peroxidase-catalyzed oxidation of phenolic lignin oligomers” Biochemistry 38(10): 3205-3210 [8]Bes-Piá A, (2002) “Reuse of wastewater of the textile industry after its treatment with a combination of physic-chemical treatment and membrane technologies” Desalination 149 169-174 [9] Dubé E1, Shareck F, Hurtubise Y, Daneault C, Beauregard M (2008) “Homologous cloning, expression, and characterisation of a laccase from Streptomyces coelicolor and enzymatic decolourisation of an indigo dye” Appl Microbiol Biotechnol 79(4):597-603 [10] Egostinelli A, L Cervoni, A Giartosio, and L Morpurgo (1883) “Stability of Japanese-lacquer-tree (Rhus vernicifera) laccase to thermal and chemical Khóa luận tốt nghiệp Page 41 denaturation: comparison with ascorbate oxidase” Biochemical Journal 306(Pt 3): 697–702 [11] Eduardo T, Ismael Bustos-Jaimes, Sylvie Le Borgne, (2003) “Potential use of oxidative enzymes for the detoxification of organic pollutants” 46.1–15 [12] Eggert C., Temp U., Erikson K E., (1996), “The ligninolytic system of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarius: purification and characterization of the laccase”, App Environ Microbiol, 602, pp 1151-1158 [13]Endo K., Hayashi, Y., Hibi, T., Hosono, K., Beppu, T and Ueda, K (2003) “Enzymological Characterization of EpoA,a Laccase-Like Phenol Oxidase Produced by Streptomyces griseus” The Journal of Biochemistry, 133, 671-677 [14] Enriqueta Arias M., María Arenas, Rodríguez Juan Soliveri, Andrew S.Ball, Manuel Hernández Kraft Pulp “Biobleaching and Mediated Oxidation of a Nonphenolic Substrate by Laccase from Streptomyces cyaneus CECT 3335” [15]Hairaishi A (2003) “Biodiversity of dioxin-degrading microorganism and potential utilization in bioremediation” Microbes and Environments 18(3) 105125 [16]Hullo MF1, Moszer I, Danchin A, Martin-Verstraete I (2001)” CotA of Bacillus subtilis is a copper-dependent laccase” J Bacteriol 183(18): 5426-5430 [17] Inbar E1, Green SJ, Hadar Y, Minz D (2005)“Competing factors of compost concentration and proximity to root affect the distribution of streptomycetes.” Microb Ecol ;50(1):73-81 [18] Koschorreck K1, Richter SM, Ene AB, Roduner E, Schmid RD, Urlacher VB (2008) “Cloning and characterization of a new laccase from Bacillus licheniformis catalyzing dimerization of phenolic acids” Appl Microbiol Biotechnol 79.217-224 [19] Laura-Leena Kiiskinen (2005) “Characterization and Heterologous Production of a Novel Laccase from Melanocarpus albomyces” Doctor Thesis, Helsinki University of Technology ISSN 1235-0621 [20] Levin L, Herrmann C, Papinutti V L,(2008) “Optimization of lignocellulolytic enzyme prduction by the white rot fungus Trametes trogii in solidKhóa luận tốt nghiệp Page 42 state fermentation using respone surface methodology” Biochemical Engineering Journal 39 207-214 [21] Levin L, Melignani E,Ramos A M,(2009) “Effect of nitrogen sources and vitamins on ligninolytic enzyme production by some white-rot fungi Dye decolorization by selected culture filtrates” Bioresource Technology 101 45544563 [22] Levin L, Melignani E,Ramos A M,(2009) “Effect of nitrogen sources and vitamins on ligninolytic enzyme production by some white-rot fungi Dye decolorization by selected culture filtrates” Bioresource Technology 101 45544563 [23] Lı́gia O Martins, Cláudio M Soares, Manuela M Pereira, Miguel Teixeira, Teresa Costa, George H Jones¶ and Adriano O Henriques (2002) “Molecular and Biochemical Characterization of a Highly Stable Bacterial Laccase That Occurs as a Structural Component of theBacillus subtilis Endospore Coat” Journal of Biological Chemistry 277(21):18849-59 [24] Loera Corral, O.; Pérez Pérez, M C I.; Barbosa Rodríguez, J R.; Villaseñor Ortega, F (2006)“Advances in Agricultural and Food Biotechnology” : New & Forthcoming Titles 323-340 ISBN: 81-7736-269-0 [25] Lu, L., Zeng, G., Fan, C., Ren, X., Wang, C., Zhao, Q., Zhang, J., Chen, M., Chen, A and Jiang, M (2013) “Characterization of a Laccase-Like Multicopper Oxidase from Newly Isolated Streptomyces sp C1 in Agricultural Waste Compost and Enzymatic Decolorization of Azo Dyes” Biochemical Engineering Journal, 72, 70-76 [26] Lunhui Lu, Guangming Zeng, Changzheng Fan, Xiujuan Ren, Cong Wang, Qianru Zhao, Anwei Chen, Min Jiang, Jiachao Zhang, Ming Chen “Characterization of a laccase-like multicopper oxidase from newly isolated Streptomyces sp C1 in agricultural waste compost and enzymatic decolorization of azo dyes” Biochemical Engineering Journal 72: 70-76 Khóa luận tốt nghiệp Page 43 [27] Francis L, M Fiorella De Los Reyes; De Los Reyes III; Mark Hernandez; Lutgarde Raskin (1998) “Quantification of Gordona amarae strains in foaming activated sludge and anaerobic digester systems with oligonucleotide hybridization probes” Applied Environ Microbiol 64(21) 2503-2512 [28] Machczynski, M.C., Vijgenboom, E., Samyn, B and Canters, G.W (2004) “Characterization of SLAC: A Small Laccase from Streptomyces coelicolor with Unprecedented Activity” Protein Science, 13, 2388-2397 [29] Mahmoud,M.G., Rifaat, H.M., El Sayed, O.H., El Beih, F.M and Selim, M.S (2013) “Effect of inducers and process parameters on laccase production by locally isolated marine Streptomyces lydicus from Red Sea, Egypt” International Journal of ChemTech Research ISSN : 0974-4290, pp 15-2 [30] Mane, U V.,1 Gurav, P N., Deshmukh, A M.3,and Govindwar, S P.4(2008) “Degradation of textile dye reactive navy – blue Rx (Reactive blue–59)” Malaysian Journal of Microbiology, pp 1-5 [31] McMullan G, Meehan C, Conneely A,Nirby N, Robinson T,Nigam P,Banat I.M, Marchant S.W.F (2001) Mini review “ microbial decolorization and degradation of textile dyes” Appl Micriobiol Biotechnol 56 81-87 [32] Mermod, NicolasRamos Martin, Juan-Luis Bairoch, Amos Marc Timmis, Kenneth N.( 1987) “The xyls gene positive regulator of TOL plasmid pWWO: Identification, sequence analysis and overproduction leading to constitutive expression of meta cleavage operon, molecular and General Genetics” Molecular and General Genetics 207, pp, 349-353 [33] Mesarch MB1, Nakatsu CH, Nies L (2010) “Development of catechol 2,3dioxygenase-specific primers for monitoring bioremediation by competitive quantitative PCR” Applied and Environmental Microbiology, 66, pp, 678-683 [34] Nguyen Thi Lan Anh, Dang Thi Cam Ha (2012) “Purification charactezization and of laccase, enzyme inhibiting human cancer cells and dye decolorization from Bavi-forest Basidiomycet” Master Thesis, University of Science and technology of Hanoi institute of biotechnology Khóa luận tốt nghiệp Page 44 [35] P Prema, Scientist F, Biotechnology Division,Niladevikn., Trivandrum — 695 019, INDIA (2008) “Characterization of laccase from Streptomyces psammoticus: an enzyme for eco-friendly treatment of environmental pollutants” Biotechnology Division, pp 245 [36] Patricio Peralta-Zamora, Cláudia M Pereira, Elaine R.L Tiburtius, Sandra G Moraes, Maria A Rosa, Rosana C (2003) “Minussi, Nelson Durán Decolorization of reactive dyes by immobilized laccase” Prog Polym Science 28 1015-1048 [37] Piontek K1, Antorini M, Choinowski T (2002) “Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90-A resolution containing a full complement of coppers” J Biol Chem 277(40):37663-9 [38] Qingxiang Yang, Min Yang, Karin Pritsch (2003) “Decolorization of synthetic dyes and production of manganese-dependent perozidase by new fungal isolate” Biotechnology Letters 25 709-713 [39] Rosli (2006) “Development of biological treatment system for reduction of COD from textile wastewater Master Dessertation” University Technology Malaysia [40]Ruijssenaars HJ1, Hartmans S (2004) “A cloned Bacillus halodurans multicopper oxidase exhibiting alkaline laccase activity” Appl Microbiol Biotechnol 65(2):17782 [41]Ryu W (1992) “Decolorization of azo dyes by Aspergillus sojae B10” Journal Microbiol Biotechnol 215-219 [42] Sadhasivam S1, Savitha S, Swaminathan K (2007) “Exploitation of Trichoderma harzianum mycelial waste for the removal of rhodamine 6G from aqueous solution” J Environ Manage 85(1):155-61 [43] Saratale G.D, Kalme S.D, Godvindwar S.P (2006) “ Decolorization of textile dyes by Aspergillus ochraceus NCIM-1146” Ind J Biotechnol 407-415 [44] Sen S, Demirer G.N,(2003) “Anaerobic treatment of real textile wastewater with a fluidized bed reactor” Water Research 37 1868-1878 Khóa luận tốt nghiệp Page 45 [45] Shedbalkar U, Dhanve R, Jadhave J (2008) “ Biodegradation of triphenylmethane dye cotton blue by Pinicillium ochorochloron MTCC 517” Journal of Hazardous Materials 157 472-479 [46] Stolz A (2001) “Bacisc and applied aspects in the microbial degradation of azo dyes” Appl Microbiol Biotechnol 56 69-80 [47] Susana (2006) “Department of Chemical Engineering Rovira i Virgili University” Av Paisos Catalans 26, 43007 Tarragona, Spain [48] Suzuki T1, Endo K, Ito M, Tsujibo H, Miyamoto K, Inamori Y (2003) ” A thermostable laccase from Streptomyces lavendulae REN-7”: purification, characterization, nucleotide sequence, and expression Biosci Biotechnol Biochem 67(10):2167-75 [49] Timothy P Ruggaber, and Jeffrey W Talley (2006) “Enhancing Bioremediation with Enzymatic Processes: A Review” Toxic Radioact Waste Manage.10(2): 73-85 [50] Wallace T.H (2001) “Biological treatment of a synthetic dye water and an industrial textile wastewater containing azo dye compounds” Master Thesis, Virginia Polytechnic Institue and State University 7(30), pp 3885-3890 [51] Wang J.W, Wu J.H, Huang.W.Y, Tan R.X (2006) “Laccase production by Monotospora sp and endophytic fungus in Cynodon dactylon” Bioresourece Technology, 97(5) 786-789 [52] Wang J.W, Wu J.H, Huang.W.Y, Tan R.X (2006) “Laccase production by Monotospora sp and endophytic fungus in Cynodon dactylon” Bioresourece Technology, 97(5) 786-789 [53]Wesennberg D, Buchon F, Agathos S.N (2002) Degradation of dyecontaining textile effluent by the agaric white-rot fungus Clitocybula dusenii”, Biotechnology Letters 24 989-993 Khóa luận tốt nghiệp Page 46 [54] Wesennberg D, Kyriakides I, Agathos S.N (2003) A review: White-rot fungi and their enzymes for the treatment of industrial dye effluents Biotechnol Advance.2 161-187 [55] Muyzer G., de Waal E.C., Uitterlinden A.G “Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA” Appl Environ Microbiol 1993;59:695–700 Khóa luận tốt nghiệp Page 47 [...].. .laccase và đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của chúng đã được thực hiện Các nội dung chính trong đề tài bao gồm: • Sàng lọc các chủng xạ khuẩn từ đống ủ compost có khả năng sinh enzyme laccase • Nghiên cứu một số yếu tố môi trường lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng đại diện • Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi enzyme laccase thô sinh tổng hợp bởi chủng. .. hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh) 1.2.5 Ứng dụng của xạ khuẩn Đặc tính của xạ khuẩn là khả năng tiết kháng sinh (antibiotic), dùng làm thuốc điều trị bệnh cho người và gia súc và cây trồng Xạ khuẩn còn có khả năng sinh ra các vitamin thuộc nhóm B, một số acid amin và các acid hữu cơ Xạ khuẩn còn có Khóa luận tốt nghiệp Page 12 khả năng tiết ra các enzyme (protease, amylase ) và trong tương lai có thể... thể dùng xạ khuẩn để chế biến thực phẩm thay cho nấm và vi khuẩn vì nấm có thể sinh ra aflatoxin độc cho người và gia súc 1.2.6 Đặc tính của laccase từ xạ khuẩn Sau nấm thì xạ khuẩn được xem là nhóm vi sinh vật có nhiều tiềm năng sinh laccase Độ tinh sạch và đặc tính của enzyme laccase từ xạ khuẩn đặc biệt từ các chủng xạ khuẩn khác nhau đã được công bố Laccase từ loài xạ khuẩn S griseus có nhiều đặc... các nhóm vi sinh vật ủ compost, nấm và xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng do khả năng phát triển mạnh mẽ nhờ hệ sợi và khả năng sinh enzyme ngoại bào của chúng Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong đất, khi gặp độ ẩm và nhiệt độ thích hợp chúng tham gia vào các qua trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất như cellulose, tinh bột [49] v.v Khả năng sinh enzyme ngoại bào laccase của các. .. pepton, bột đậu tương với nồng độ cuối là 2 g/l để đánh giá ảnh hưởng đến nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của chủng ACBT20 2.2.5 Đánh giá sinh trưởng của chủng ACBT20 Sinh trưởng của chủng xạ khuẩn ACBT20 được đánh giá thông qua xác định trọng lượng khô của chủng sau 7 ngày nuôi cấu Sinh khối từ chủng ACBT20 được thu qua giấy lọc, tiến hành sấy khô ở 70oC Sau khoảng 2 giờ,... nấm sợi, xạ khuẩn có thể làm giảm hoặc hấp thụ nhiều loại thuốc nhuộm, ngoại trừ một số nấm đảm có khả năng loại màu rất tốt [22] Nhiều nghiên cứu đáng chú ý đã ghi nhận khả năng sử dụng vi sinh vật để xử lý và khử độc vấn đề ô nhiễm màu công nghiệp Sử dụng vi sinh vật phân hủy và loại màu tập trung vào loại nhóm màu azo, các màu anthraquinone thường khó phân hủy bởi cấu trúc vòng benzene của chúng [20]... Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản 1.2.3 Cấu tạo của xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. .. 2.2.3 Phân loại và định tên xạ khuẩn Phân loại theo phương pháp truyền thống Chủng xạ khuẩn ACBT 20 được phân loại theo phương pháp truyền trống dựa vào hình thái khuẩn lạc của chúng trên môi trường Gause M và hình thái khuẩn ty dưới kính hiển vi quang học 2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp laccase của chủng xạ khuẩn ACBT20 2.2.4.1 Ảnh hưởng của tốc độ... cho đến khi trọng lượng không thay đổi 2.2.6 Đánh giá độ bền nhiệt của enzyme thô thu từ chủng ACBT20 Dịch enzyme thu được từ chủng xạ khuẩn ACBT20 được đun sôi ở các thời gian khác nhau 30, 60 và 90 phút để đánh giá độ bền nhiệt của laccase từ chủng ACBT20 Sau 30 phút, xác định hoạt tính laccase 2.2.7 Nghiên cứu khả năng loại màu bằng dịch enzyme thô của chủng đại diện Sau 4 ngày nuôi cấy trên môi... phẩm của quá trình sản xuất này làm nguồn cơ chất nuôi cấy 1.3 Thuốc nhuộm 1.3.1 Thuốc nhuộm và vi sinh vật phân hủy thuốc nhuộm Thuốc nhuộm đã tạo ra một cuộc cách mạng trong công nghiệp dệt và thương mại hóa các sản phẩm của nó Gần như mọi ngành công nghiệp đều sử dụng chất màu bằng cách này hay cách khác [38] Nước thải màu từ công nghiệp dệt được đánh giá là loại hình gây ô nhiễm nhất trong tất cả các