Viện đại học mở hà nội KHOA công nghệ sinh học ===***=== Khóa luận tốt nghiệp ti: NGHIấN CU KH NNG PHN HY DU DIESEL CA MNG SINH HC DO CHNG VI KHUN TO THNH C PHN LP T MU U V MU NC ễ NHIM DU TI TNH QUNG NGI Người hướng dẫn : ths Cung thị ngọc mai sinh viên thực : đinh trần thu phương lớp : 1102 Hà nội - 2015 Viện đại học mở hà nội KHOA công nghệ sinh học ===***=== Khóa luận tốt nghiệp ti: NGHIấN CU KH NNG PHN HY DU DIESEL CA MNG SINH HC DO CHNG VI KHUN TO THNH C PHN LP T MU U V MU NC ễ NHIM DU TI TNH QUNG NGI Người hướng dẫn : ths Cung thị ngọc mai sinh viên thực : đinh trần thu phương lớp : 1102 Hà nội - 2015 Li cm n! Trc ht, tụi xin by t li cm n chõn thnh v sõu sc ti ThS Cung Th Ngc Mai, TS Lờ Th Nhi Cụng cỏn b phũng Cụng ngh sinh hc Mụi trng, Vin Hn Lõm khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó tn tỡnh hng dn v ch dy sut thi gian tụi thc hin khúa lun ny Tụi xin chõn thnh cm n ti Ph trỏch Phũng CNSH mụi trng l TS Th T Uyờn cựng ton th cỏn b nhõn viờn Phũng Cụng ngh sinh hc Mụi trng, c bit l ThS V Th Thanh ó giỳp , ch bo tn tỡnh sut quỏ trỡnh tụi hc nghiờn cu hon thnh khúa lun ca mỡnh Bờn cnh ú, tụi xin chõn thnh cm n cỏc thy cụ Khoa cụng ngh Sinh hc, Vin i Hc M H Ni cựng vi Lónh o vin Cụng ngh sinh hc, Viờn Hn lõm khoa hc v Cụng ngh Vit Nam ó to iu kin giỳp tụi sut thi gian hc tp, nghiờn cu ti trng cng nh ti vin Cui cựng, tụi xin gi gi li cm n sõu sc n nhng ngi thõn gia ỡnh, ban bố ó luụn bờn cnh ng h v giỳp tụi rt nhiu c v vt cht v tinh thn tụi cú th hon thnh tt khúa lun tt nghip ny Mt ln na xin chõn thnh cm n! H Ni, ngy 22 thỏng 05 nm 2015 Sinh viờn inh Trn Thu Phng MC LC M U PHN TNG QUAN TI LIU 1.1 Tỡnh trng ụ nhim du v hu qu tỏc ng ca nú 1.1.1 Tỡnh trng ụ nhim du trờn th gii v Vit Nam 1.1.2 Hu qu ca ụ nhim du 1.2 Cỏc phng phỏp x lý ụ nhim du 1.2.1 Phng phỏp c hc 1.2.2 Phng phỏp húa hc 1.2.3 Phng phỏp sinh hc 1.3 Vai trũ ca vi sinh vt x lý nc ụ nhim du 1.3.1 Vi sinh vt cú kh nng phõn hy du 1.3.2 C ch phõn hy du diesel ca vi sinh vt 1.4 Gii thiu chung v mng sinh hc (biofilm) 12 1.4.1 Khỏi nim mng sinh hc (biofilm) 12 1.4.2 S hỡnh thnh, thnh phn v cu trỳc ca biofilm 12 1.4.3 ng dng ca mng sinh hc 15 1.5 nh hng ca mt s iu kin húa lý n s hỡnh thnh v phỏt trin ca biofilm 17 1.5.1 nh hng ca pH 17 1.5.2 nh hng ca nhit 17 1.5.3 nh hng ca ngun carbon 18 1.5.4 nh hng ca ngun nitrogen 19 1.6 Cỏc phng phỏp phõn loi vi sinh vt 20 1.6.1 Phõn loi theo phng phỏp truyn thng 21 1.6.2 Phõn loi theo phng phỏp sinh hc phõn t 21 PHN VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 23 2.1 Vt liu 23 2.1.1 Nguyờn liu 23 2.1.2 Húa cht v mụi trng nuụi cy 23 2.1.3 Mỏy múc v thit b nghiờn cu 24 2.2 Phng phỏp nghiờn cu 25 2.2.1 Lm giu vi khun v phõn lp cỏc chng vi khun cú kh nng s dng du diesel .25 2.2.2 Kho sỏt kh nng s dng du diesel ca cỏc chng vi khun 26 2.2.3 ỏnh giỏ kh nng to mng sinh hc (biofilm) ca cỏc chng vi khun phõn lp c 27 2.2.4 Nghiờn cu mt s c im sinh hc ca vi khun 28 2.2.5 Phõn loi, nh tờn vi khun da vo xỏc nh trỡnh t on gen mó húa 16S rRNA v xõy dng cõy phỏt sinh chng loi 30 2.2.6 Nghiờn cu nh hng ca mt s iu kin húa lý n s hỡnh thnh mng sinh hc ca vi khun 32 2.2.7 ỏnh giỏ kh nng phõn hy du diesel ca mng sinh hc chng vi khun to thnh 33 PHN KT QU V THO LUN 34 3.1 Lm giu v phõn lp tuyn chn cỏc chng vi khun cú kh nng s dng du diesel 34 3.2 Kho sỏt kh nng s dng du diesel ca cỏc chng vi khun phõn lp c 36 3.3 ỏnh giỏ kh nng to mng sinh hc (biofilm) ca cỏc chng vi khun ó phõn lp c 37 3.4 Nghiờn cu c mt s c im sinh hc ca chng vi khun s dng du diesel v to mng tt nht t cỏc chng vi khun ó phõn lp c 38 3.5 nh tờn v xõy dng cõy phỏt sinh chng loi 39 3.5.1 Tỏch chit DNA tng s ca chng vi khun QND10 39 3.5.2 Nhõn on gen mó húa 16S rRNA bng k thut PCR 40 3.6 Nghiờn cu nh hng ca mt s iu kin húa lý n s hỡnh thnh mng sinh hc ca chng Acinetobacter sp QND10 42 3.6.1 nh hng ca pH 42 3.6.2 nh hng ca nhit 43 3.6.3 nh hng ca ngun carbon 45 3.6.4 nh hng ca ngun nitrogen 46 3.7 ỏnh giỏ kh nng s dng du diesel ca mng sinh hc chng Acinetobacter sp QND10 to thnh 47 KT LUN V KIN NGH 51 TI LIU THAM KHO 52 PH LC 58 DANH MC BNG Bng 1.1 Ngun C c vi sinh vt s dng 18 Bng 1.2 Ngun N c vi sinh vt s dng 19 Bng 2.1: Mỏy múc v thit b dung ti 24 Bng 3.1: c im hỡnh thỏi khun lc ca cỏc chng vi khun trờn mụi trng HKTS vi mu lm giu khụng v cú b sung glucose 36 DANH MC HèNH NH Hỡnh S hot ng ca cht phõn tỏn Hỡnh 1.2 Quỏ trỡnh chuyn húa alkane Hỡnh 1.3 Quỏ trỡnh phõn hy Hydrocarbon v sinh trng ca vi sinh vt hiu khớ 10 Hỡnh 1.4 Con ng phõn hy hiu khớ ca n-alkane 11 Hỡnh 1.5 Quỏ trỡnh hỡnh thnh mng sinh hc ca vi sinh vt 13 Hỡnh 1.3: nh hin vi in t phúng i 21.850 ln, hin th cu trỳc khụng gian ca mt mng sinh hc vi mng li ngoi bo xung quanh 15 Hỡnh 3.1 Mu lm giu trờn mụi trng khoỏng Gost dch cú b sung 1% du DO 35 Hỡnh 3.2: Kh nng sinh trng ca chng vi khun trờn mụi trng khoỏng Gost dch cú b sung 1% du diesel 37 Hỡnh 3.3: Kh nng bt gi tinh th tớm ca mng sinh hc ca cỏc chng vi khun 38 sau 48 gi nuụi cy 38 Hỡnh 3.4: kh nng to mng ca cỏc chng vi khun 38 Hỡnh 3.5: Hỡnh thỏi khun lc (A) v hỡnh thỏi t bo (B) ca chng QND10 39 Hỡnh 3.6: in di DNA tng s ca chng vi khun QND10 39 Hỡnh 3.7 in di sn phm PCR nhõn on gen 16S rRNA ca chng QND10 40 Hỡnh 3.8: Cõy phỏt sinh chng loi ca chng vi khun QND10 41 Hỡnh 3.9: Kh nng bt gi tớm tinh th ca mng sinh hc chng Acinetobacter sp QND10 to thnh cỏc pH khỏc sau 48 gi 42 Hỡnh 3.10: nh hng ca pH n kh nng to mng sinh hc ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 43 Hỡnh 3.11: Kh nng bt gi tớm tinh th ca mng sinh hc chng Acinetobacter sp QND10 to thnh cỏc nhit khỏc sau 48 gi 44 Hỡnh 3.12: nh hng ca nhit n kh nng to mng sinh hc ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 44 Hỡnh 3.13: Kh nng bt gi tớm tinh th ca mng sinh hc chng Acinetobacter sp QND10 to thnh cỏc ngun carbon khỏc 45 Hỡnh 3.14: nh hng ca ngun carbon n kh nng to mng sinh hc ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 45 Hỡnh 3.15: Kh nng bt gi tớm tinh th ca mng sinh hc chng Acinetobacter sp QND10 to thnh cỏc ngun nitor khỏc 46 Hỡnh 3.16: nh hng ca ngun carbon n kh nng to mng sinh hc ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 47 Hỡnh 3.17: Kh nng sinh trng ti cỏc nng du DO khỏc ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 48 Hỡnh 3.18: Kh nng sinh trng ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 ti cỏc nng du DO khỏc 48 Hỡnh 3.19 Biu th hin hiu sut phõn hy du diesel ca mng sinh hc chng vi khun Acinetobacter sp.QND10 49 BNG CH VIT TT Kớ hiu í ngha Bp : Base pair (cp baz) DNA : Deoxyribonucleic acid DO : Diesel oil (du diesel) HKTS : Hiu khớ tng s LB : Luria Bertani Nm : Nanomet PCR : Polymease Chain Reaction (phn ng chui trựng hp) RNA : Ribonucleic acid rRNA : Ribosomal Ribonucleic acid àl : Microlit àm : Micromet Hỡnh 3.11: Kh nng bt gi tớm tinh th ca mng sinh hc chng Acinetobacter sp QND10 to thnh cỏc nhit khỏc sau 48 gi (Mu i chng khụng cú VSV) OD 570 nm nh hng ca nhit 20 18 16 14 12 10 24h 48h 72h 25oC 30oC 37oC 40oC 45oC 50oC Nhit Hỡnh 3.12: nh hng ca nhit n kh nng to mng sinh hc ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 Quan sỏt hỡnh 3.11 v 3.12 nhn thy, chng Acinetobacter sp QND10 cú kh nng hỡnh hnh mng sinh hc tt khong nhit t 25oC n 37oC Tuy nhiờn, nhit ti u nht cho chng ny to mng sinh hc l 30oC sau sau 48 gi nuụi cy tnh iu ny chng t chng Acinetobacter sp QND10 thuc nhúm vi sinh vt u m trung bỡnh (Mesophiles) a thớch nhit trung bỡnh khong 20-40oC Do ú chng ny cú kh nng chu c nhit v nú lm tng gii hn nhit v kh nng phõn hy ca on vi sinh vt [14] 44 3.6.3 nh hng ca ngun carbon Carbon l yu t dinh dng quan trng nht i vi s sinh trng ca vi sinh vt, l b khung cu trỳc ca cht sng, nguyờn t ny rt cn thit cho s hỡnh thnh t bo sng ca vi sinh vt Vỡ vy, quỏ trỡnh hỡnh thnh mng sinh hc carbon rt cn thit hỡnh thnh mng li cỏc hp cht ngoi bo kho sỏt ngun carbon no vi sinh vt d s dng, sinh trng v to mng tt nht chỳng tụi tin hnh nuụi tnh chng vi khun ny mụi trng KHTS cú ngun carbon khỏc (glucose, maltose, sacharose, lactose) nhit 30oC, pH7 nh mụ t mc 2.2.6 C glucose maltose saccharose lactose Hỡnh 3.13: Kh nng bt gi tớm tinh th ca mng sinh hc chng Acinetobacter sp QND10 to thnh cỏc ngun carbon khỏc (C: Mu i chng khụng cú vi sinh vt) OD 570 nm nh hng ca ngun carbon 40 35 30 25 20 15 10 24h 48h 72h Saccharose Lactose Glucose Maltose Ngun carbon Hỡnh 3.14: nh hng ca ngun carbon n kh nng to mng sinh hc ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 45 Quan sỏt trờn hỡnh 3.13 v 3.14 cho thy , chng vi khun Acinetobacter sp QND10 u cú kh nng to mng sinh hc c ngun carbon nhiờn chng vi khun ny cú kh nng to mng tt nht mụi trng cú b sung ngun carbon l ng maltose Kt qu ny khỏ phự hp vi nghiờn cu ca Lờ Gia Hy (2010) Theo tỏc gi ny ng maltose l mt oligosaccharide, chỳng c thy phõn thnh ng n, t ú tip tc tham gia vo chu trỡnh chuyn húa cung cp nng lng cho hot ng sng ca t bo, tham gia xõy dng nờn peptidoglycan ca thnh t bo hoc tham gia xõy dng nờn cu trỳc ca acid nucleic[11] 3.6.4 nh hng ca ngun nitrogen Vi sinh vt s dng nitor ch yu to thnh nhúm amin ca cỏc acid amin Chỳng phõn gii cỏc protein thnh acid amin ri s dng acid amin ny tng hp protein mi [22] Trong quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin ca vi sinh vt, nitrogen l mt nhng nguyờn t c bn to nờn cỏc thnh phn t bo Trong s hỡnh thnh mng sinh hc, nitor rt cn thit vic to cỏc hp cht ngoi bo mt nhng thnh phn quan trng to nờn mng sinh hc xỏc nh xem ngun nitor no Acinetobacter sp QND10 s dng tt nht, chỳng tụi s dng c hai ngun nitor vụ c v hu c gm: cao men, KNO3, peptone, (NH4)2SO4 tin hnh nghiờn cu Kt qu c th hin hỡnh 3.15 v hỡnh 3.16 C KNO3 (NH4)2SO4 Peptone Cao nm men Hỡnh 3.15: Kh nng bt gi tớm tinh th ca mng sinh hc chng Acinetobacter sp QND10 to thnh cỏc ngun nitrogen khỏc (C: Mu i chng khụng cú VSV) 46 nh hng ca ngun nitrogen OD 570 nm 50 40 30 24h 20 48h 10 72h (NH4)2SO4 KNO3 Peptone Cao men Ngun nitrogen Hỡnh 3.16: nh hng ca ngun carbon n kh nng to mng sinh hc ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 T hỡnh 3.15 v hỡnh 3.16 cho thy, chng vi khun Acinetobacter sp QND10 u cú kh nng to mng tt c ngun nitrogen vụ c v hu c, nhiờn chng vi khun cú kh nng to mng tt nht b sung ngun nitrogen l pepton Nh vy, iu kin ti u cho s hỡnh thnh mng sinh hc ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 l pH 7, nhit 30oC, ngun carbon l ng maltose v ngun nitrogen l pepton 3.7 ỏnh giỏ kh nng s dng du diesel ca mng sinh hc chng Acinetobacter sp QND10 to thnh ỏnh giỏ kh nng phõn hy du diesel ca mng sinh hc, chỳng tụi tin hnh nuụi cy chng vi khun Acinetobacter sp QND10 HKTS lng iu kiờn ti u vi nhit 30oC, pH 7, cú b sung pepton v ng maltose Sau mng sinh hc c hỡnh thnh, chỳng tụi tin hnh ỏnh giỏ kh nng sinh trng v phỏt trin ca chng vi khun ny trờn ngun c cht du DO cỏc nng 1%, 2%, 3%, 4%, 5% v 6% nh mụ t mc 2.2.7 Kt qu thu c th hin trờn hỡnh 3.17 47 C 1% 2% 3% 4% 5% 6% Hỡnh 3.17: Kh nng sinh trng ti cỏc nng du DO khỏc ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 (C: Mu i chng khụng cú vi sinh vt) Sau mi 24 gi nuụi cy, hỳt 0,1 ml dch pha loóng (10 ln) v o OD bc súng 600 nm, tin hnh o vũng ngy Kt qu thu c trỡnh by OD 600 nm hỡnh 3.18 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 1% 2% 3% 4% 5% 6% Ngy Hỡnh 3.18: Kh nng sinh trng ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 ti cỏc nng du DO khỏc Qua quan sỏt hỡnh 3.17 v 3.18 cú th nhn thy kh nng phõn hy du DO ca mng sinh hc chng vi khun Acinetobacter sp QND10 to thnh ngy vi cỏc nng du DO khỏc Vi nng du 5% thỡ chng vi khun ny sinh trng v phõn hy tt hn c Tuy nhiờn ỏnh giỏ chớnh xỏc chỳng tụi ó gi mu i phõn tớch kh nng phõn hy du DO ca mng sinh hc bng phng phỏp phõn tớch lng Vin Húa cụng nghip, B Cụng thng Kt qu thu c th hin hỡnh 3.19 48 Hiu sut phõn hy (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 77.7 1.5 i chng Thớ nghim Hỡnh 3.19 Biu th hin hiu sut phõn hy du diesel ca mng sinh hc chng vi khun Acinetobacter sp.QND10 sau ngy Da trờn hỡnh 3.19 nhn thy, sau ngy x lý, hm lng du DO cũn li mu thớ nghim l 6255,15 mg/l v mu i chng l 27629,25 mg/l (so vi mu ban u l 28050 mg/l) T ú chỳng tụi tớnh toỏn c hiu sut phõn hy du DO mng sinh hc chng Acinetobacter sp QND10 to thnh ca mu thớ nghim l 77,7% v mu i chng l 1,5% Trờn th gii ó cú nhiu nghiờn cu v kh nng phõn hy du diesel ca vi khun Anicetobacter , nhiờn cỏc nghiờn cu v kh nng phõn hy du DO ca cỏc chng vi khun thuc chi Acinetobacter cú kh nng to biofilm cũn hn ch Nm 2013, nhúm nghiờn cu ca Huang thuc trng Cao ng Húa hc v K thut húa hc, Trung Quc ó phõn lp c chng vi khun Anicetobacter beijerinckii 302PWB-OH1 t t b ụ nhim du cú kh nng phõn hy du DO lờn ti 80,4% ngy nuụi cy vi hm lng du DO ban u l 0,5% (w/v) [33] Ti nhit 22oC, hn hp cỏc chng vi khun bao gm cỏc loi Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis v Acinetobacter lwoffi Al-Wasify v Hamed (2014) phõn lp t t v nc ụ nhim du cú kh nng phõn hy 88,5% sau 10 ngy nuụi cy vi hm lng du thụ ban u l 1% [16] Chng Acinetobacter baumannii phõn lp c t t ụ nhim diesel ti kho xng du n ó phõn hy ti 99% lng du DO iu kin pH v 35oC vi nng du DO ban u l 4% [42] Chng vi khun Acinetobacter sp Y2 Luo v cng s phõn lp t nc bin ụ nhim du c ly 49 t tnh Chit Giang, Trung Quc, iu kin ti u pH 7,5, 30oC cú hiu sut phõn hy du diesel l 80% 10 ngy x lý vi nng diesel ban u l 2% (v/v) [43] Ti Vit Nam, nhúm nghiờn cu Li Thỳy Hin v cng s (2007-2008) quỏ trỡnh thc hin ti ó th nghim nh hng ca cht hot húa b mt sinh hc (CHHBMSH) ca chng Pseudomonas aeruginosa H33 v Pseudomonas pseudomalei H24 lờn kh nng phõn hy du thụ cỏt bin v du diesel nc bin, kt qu cho thy hm lng du diesel b phõn hy ti 67% cũn du thụ b phõn hy 41% b sung CHHBMSH Hm lng hydrocarbon no gim t 328,7 mg/l xung ch cũn 88 mg/l v hm lng hidrocarbon thm cng gim ti 96% i vi du DO [10] So sỏnh vi cỏc kt qu ó c cụng b trờn th gii v Vit Nam, chỳng tụi thy rng chng Acinetobacter sp QND10 cú kh nng phõn hy du DO khỏ tt (77,7%) vỡ chng vi khun ny chỳng tụi ó c nghiờn cu nng du 5% v cú kh nng to mng sinh hc tt iu ny cng khng nh rng vic x lý cht ụ nhim du DO bng mng biofilm cú hiu qu cao hn so vi dng t bo t Ngoi ra, chi Acinetobacter cựng vi cỏc chi Pseudomonas, Alcaligenes, Bacilluss, v.v cú kh nng tớch ly phosphore cao vy ngoi vic ng dng chi Acinetobacter x lý ụ nhim du cũn c ng dng x lý ụ nhim du diesel, chng Acinetobacter sp QND10 cú th ng dng x lý giu phosphore [20] Do vy, cú th kt hp chng Acinetobacter sp QND10 vi cỏc chng vi khun khỏc cú kh nng to mng sinh hc cựng vi cỏc chng cú kh nng phõn hy du diesel hay phosphore to mt hp a chng nhm nõng cao hiu qu x lý du DO cng nh nhng ngun ụ nhim phosphore tng t 50 KT LUN V KIN NGH Kt lun T mu t v nc ụ nhim thu thp t tnh Qung Ngói, phõn lp c 11 chng vi khun Trong ú chng QND10 cú kh nng sinh trng v phỏt trin tt nhttrờn ngun c cht du diesel va cú kh nng to biofilm mnh nht Chng vi khun QND10 l vi khun Gram õm, di kớnh hin vi in t quột vi phúng i 15.000 ln, t bo cú hỡnh que ngn, u tự, xung quanh cú nhiu hp cht ngoi bo, kớch thc t bo khong (0,67-0,73) x (0,93-1,17) àm Chng vi khun ny c t tờn l Acinetobacter sp QND10 v c ng ký trờn ngõn hng EMBL vi mó s l LC033904 Kh nng to mng sinh hc ca chng vi khun Acinetobacter sp QND10 tt nht nhit 30oC, pH 7, ngun carbon l ng maltose v ngun nitrogen l pepton Mng sinh hc chng Acinetobacter sp QND10 to iu kin ti u cú hiu sut phõn hy du diesel t 77,7% sau ngy nuụi cy vi hm lng ban u l 28.050 mg/l Kin ngh Nghiờn cu thờm kh nng phõn hy du diesel ca mng sinh hc t chng Acinetobacter sp QND10 cựng cỏc chng vi khun cú kh nng to mng sinh hc tt khỏc ó c phõn lp nhm nõng cao hiu qu x lý ụ nhim du 51 TI LIU THAM KHO Ting Vit Cụng ty c phn Composite v Cụng ngh nh Dng Bn composite x lý nc thi nh Dng Boncomposite.com Cụng ty c phn Cụng ngh Nng lng v Mụi trng NUSA Vit Nam Cụng ngh x lý nc thi NUSA Septic F nusa.vn Cụng ty c phn Phỏt trin cụng ngh mi H Ni, X lý nc thi bng cụng ngh mng lc sinh hc MBR Cụng ty c phn Vit Nam APTES Bin phỏp khc phc s c trn du Vit Nam Cung Th Ngc Mai (2011), Nghiờn cu kh nng phõn hy sinh hc cỏc hp cht vũng thm ca vi khun phõn lp t nc thi khu cụng nghip T Liờm, lun thc s sinh hc Vin sinh thỏi v Ti nguyờn sinh vt Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam Cung Th Ngc Mai, Nguyn Thựy Linh, Nguyn Vn Bc, V Th Thanh, Nghiờm Ngc Minh (2011), Nghiờn cu kh nng phõn hy diesel ca chng vi khun BTL5 phõn lp t nc thi cụng nghip, Tp sinh hc 33(4): 86-91 ng Xuõn Nghiờm (2010) Giỏo trỡnh vi sinh vt hc, NXB Khoa Hc v Cụng Ngh: 111 136 inh Thỳy Hng, Lờ Gia Hy, Lu Th Bớch Tho (1998), Vi sinh vt phõn hy hydrocarbon du m, Tp Khoa hc v Cụng ngh, 16(3): 1-12 H Th Tin (2010), Bỏo ng ụ nhim du ti Vnh H Long Cụng ty c phn dch v k thut hng hi Vit Long 10 Li Thỳy Hin (2007-2008), Nghiờn cu sn xut cỏc cht hot húa b mt sinh hc t vi sinh vt bin dựng ngnh cụng nghip du khớ v x lý mụi trng, ti c lp cp nh nc 11 Lờ Gia Hy (2010), Giỏo trỡnh vi sinh vt hc, NXB Khoa Hc v Cụng ngh: 111- 136 52 12 Nguyn Quang Huy v cng s (2011), c im ca chng vi khun cú kh nng to mng sinh hc c phõn lp t t Vit Nam, Tp Khoa hc ,i hc Quc Gia H Ni 27(2S): 187 13 Nguyn Quang Huy, Ngụ Th Kim Toỏn (2014), Kh nng tớch ly photpho v to biofilm ca chng Bacillus licheniformis A4.2 phõn lp ti Vit Nam, Tp Khoa hc H Quc gia H Ni, Khoa hc T nhiờn v Cụng ngh 30(1): 43-50 14 Nguyn Thnh t (2004), C s Sinh hc vi sinh vt, Nh xut bn Giỏo dc Ting Anh 15 Abdel-Megeed A, Al-Harbi N, Al-Deyab S (2010) Hexadecane degradation by bacterial strains isolated from contaminated soils, African Journal of Biotechnology 9(44): 74877494 16 Al-Wasify SR and Hamed RS (2014), Bacterial Biodegradation of crude oil using local isolates, International Journal of Bacteriology: 1-8 17 Andersson S, Dalhammar G, Land C J, Kuttuva RG (2009), Characterization of extracellular polymeric substances from denitrifying organism Comamonas denitrificans, Application Microbiology Biotechnology 82(3): 535-543 18 Atlas RM (1995) Bioremediation of petroleum pollutants, Biodeterioration and Biodegradation 35(1-3): 317-327 19 Ayala M, Torres E (2004) Enzymatic activation of alkanes: constraints and prospective, Applied Catalysis 272(1-2): 113 20 Bao LL, Li D, Li XK, Huang RX, Zhang J, Yang LV, Xia GQ (2007), Photphorus accumulation by bacteria isolated from a continuous-flow two-sludge system, Journal of Environmental Sciences 19(4): 391 21 Barken KB, Pamp SJ, Yang L, Gjermansen M, et al (2008), Roles of type IV pili, flagellum mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms, Environmental Microbiology 10(9): 233-439 53 22 Burdman S, Jurkevitch E, Soria- Diaz M E, serrano AM, Okon Y (2000), Extracellular polysaccharide composition of Azospirillum brasilense and its relation with cell aggregation, FEMS Microbiology Letters, 189(2): 259-264 23 Cheng KC, Demirci A and Catchmark JM ( 2010), Advances in biofilm reactors for prodution of value added products, Applied Microbiology and Biotechnology 87: 445-456 24 Chenier MR, Beaumier D, Roy R, Driscoll BT, Lawrence JR, Greer CW (2003), Impact of seasonal variations and nutrient inputs on nitrogen cycling and degradation of hexadecane by replicated river biofilms, Applied and Environmental Microbiology 69: 5170-5177 25 Coon MJ (2005), Omega oxygenases: nonheme-iron enzymes and P450 cytochromes, Biochemical and Biophysical Research Communications 338: 378 385 26 Costerton JW, Geesey GG and Cheng KJ (1978), How bacteria stick, Scientific American 238: 86-95 27 Czaczyk KMK (2007), Biosynthesis of Extracellular Polymeric Substances (ESP) and its role in microbial biofilm formation, Polish Journal of Evironmental Studies 16: 799-806 28 Das N, Basak LVG, Salam JA, Abigail MEA (2012), Application of Biofilms on Remediation of Pollutants An Overview, Journal of Microbiology and Biotechnology Research 2(5): 783-790 29 Eastcott L, Shiu WY, Mackay D (1988), Environmentally relevant physical chemical properties of hydrocarbons: a review of data and development of simple correlations, Oil and Chemical Pollution 4: 191-216 30 Garett R T, Bhakoo M, Zhang Z (2008), Review: Bacterial adhesion and biofilm on surfaces, Progress in Natural Science 18: 1049-1056 31 Head IM, Jones DM, Roling WF (2006), Marine microorganisms make a meal of oil, Nature Reviews Microbiology 4: 173-182 54 32 Herald PJ, Zottola SA (1988), Attachment of Listeria monocytogenes to stainless steel surfaces at various temperatures and pH values, Journal of Food Science 53: 1549-1552 33 Huang L, Xie J, Lv BY, Shi XF, Li GQ, Liang FL, Lian JY (2013), Optimization of nutrient component for diesel oil degradation by Acinetobacter beijerinckii ZRS, Marine Pollution Bulletin 76(1): 325-332 34 Jesus GM, Silvia G A, Ana IA, Francisco RV (1999), Use of 16S 23S ribosomal gene spacer region in studies of prokaryotic diversity, Journal of Microbiological Methods 36: 55-64 35 Jomeo T (2008), Bacterial biofilms, Current Topics in Microbiology and Immunology, Atlanta United States of American 36 Labinger JA, Bercaw JE (2002), Understanding and exploiting CH bond activation, Nature 417: 507 37 Lane DJ (1991), 16S-23S rRNA sequencing, Nucleic acid technique bacterial systematics: 125-175 38 Lieberman RL, Rosenzweig AC (2004), Biological methane oxidation: regulation, biochemistry, and active site structure of particulate methane monooxygenase, Critcal Reviews Biochemistry And Molecular Biology 39: 147164 39 Morikawa M, Kagihiro S, Haruki M, Takano K, Branda S, Kolter R, and Kanaya S (2006), Biofilm fromation by a Bacillus subtillis strain that produces gamma polyglutamate, Microbiology 152: 2801-2807 40 OToole G A., Heidi K.B., Kolter R (2000), Biofilm formation as microbial development, Annual Review of Microbiology 54: 49-79 41 OToole GA and Kolter R (1998), Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis, Molecular Microbiology 28: 449-461 42 Palanisamy N, Ramya J, Kumar S, Vasanthi N, Chandran P, Khan S (2014), Diesel biodegradation capacities of indigenous bacterial species isolated from 55 diesel contaminated soil, Journal of Environmental Health Science and Engineering 12(1): 142 43 Qun Luo, Jian-Guo Zhang et al (2013), Isolation and characterization of marine diesel oil-degradingAcinetobacter sp strain Y2, Annals of Microbiology, 63(2): 633-640 44 Riser-Roberts E (1998), Remediation of petroleum contaminated soils, CRC Press: 35-72 45 Schneiker S, dos Santos VAPM, Bartels D, Bekel T, et al (2006), Genome sequence of the ubiquitous hydrocarbon-degrading marine bacterium Alcanivorax borkumensis, Nature Biotechnology 24: 9971004 46 Steiert JG, Pignatello JJ, Crawford RL (1987), Degradation of chlorinated phenols by a pentachlorophenol degrading bacterium, Applied and Environmental Microbiology 53: 907910 47 Steyn B (2005), Proteomic analysis of the biofilm and biofilm asociated phenotypes of Pseudomonas aeruginosa cultured in batch, PhD dissertation, The Faculty of Natural and Agricultural Sciences, University of Pretoria 48 Throne-Holst M, Wentzel A, Ellingsen TE, Kotlar HK, Zotchev SB (2007), Identification of novel genes involved in long-chain n-alkane degradation by Acinetobacter sp strain DSM 17874, Applied and Environmental Microbiology 73(10): 33273332 49 Wentzel A, Ellingsen TE, Kotlar HK, Zotchev SB, Throne-Holst M (2007), Bacterial metabolism of long-chain n-alkanes, Applied and Environmental Microbiology 576: 12091221 50 Yakimov MM, Timmis KN, Golyshin PN (2007), Obligate oil-degrading marine bacteria, Current Opinion in Biotechnology 18: 257266 51 Yamaga F, Washio K and Morikawa M (2010), Sustainable Biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoacetius P23 isolated from the rhizosphere of Duckweed Lenma aoukikusa, Environment Science and Technology 44: 64706474 56 52 Zhou J, Bruns MA and Tiedje JM (1996), DNA Recovery from soils of diverse compostion, Applied and Evironmental Microbiology 62(2): 316-322 Trang website tham kho 53 http://dujs.dartmouth.edu/fall-2009/biofilms-bacterias-elixer-of-survival 54 http://khoahoc.tv/congnghemoi/cong-nghe-moi/37083_dung-lop-mang-sinh-hoclam-sach-doc-to-trong-qua-trinh-tai-che-cat-dau.aspx 55 http://hoachatonline.blogspot.com/2012/02/chat-hoat-ong-be-mat.html 56 http://khoahoc.tv/doisong/moi-truong/tham-hoa/42934_nhung-hau-qua-o-nhiemmoi-truong-bien-do-tran-dau.aspx- 57 http://kttvttb.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=1312:nhng-huqu-o-nhim-moi-trng-bin-do-s-c-tran-du-&catid=73:mc-tin-tc 58 http://nangluongvietnam.vn/news/vn/nhan-dinh-phan-bien-kien-nghi/nhan-dinhdu-bao/iea-du-bao-nhu-cau-dau-mo-toan-cau-trong-nam-2015.html 59 http://vi.wikipedia.org/wiki/D%E1%BA%A7u_m%E1%BB%8F 57 PH LC Kt qu th nghim kh nng phõn hy du diesel ca chng Acinetobacter sp QND10 Kt qu ng ký trỡnh t gen 16S rRNA trờn ngõn hng EMBL 58 [...]... năng tạo màng tốt nhất từ các chủng vi khuẩn phân lập được tại các mẫu đất và mẫu nước ô nhiễm dầu thu thập được tại tỉnh Quảng Ngãi Nội dung nghiên cứu: - Làm giàu và phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu diesel - Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của các chủng vi khuẩn phân lập được - Đánh giá khả năng tạo màng sinh học (biofilm) của các chủng vi khuẩn phân lập được - Nghiên cứu một... suất phân hủy các hợp chất ô nhiễm khi xử lý ngoài hiện trường.  1    Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu khả năng phân hủy dầu diesel của màng sinh học do chủng vi khuẩn tạo thành được phân lập từ mẫu đất và mẫu nước ô nhiễm dầu tại tỉnh Quãng Ngãi Mục tiêu đề tài: Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy dầu diesel và có khả năng tạo. .. hình thành màng sinh học của chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và tạo màng tốt nhất - Đánh giá khả năng phân hủy dầu diesel của màng sinh học do chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và tạo màng tốt nhất tạo thành tại điều kiện tối ưu 2    PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình trạng ô nhiễm dầu và hậu quả tác động của nó 1.1.1 Tình trạng ô nhiễm dầu trên thế giới và ở Vi t Nam ™ Trên thế giới Theo báo cáo của. .. phân lập được - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và tạo màng tốt nhất từ các chủng vi khuẩn đã phân lập được - Định tên chủng vi khuẩn sử dụng dầu diesel và tạo màng tốt nhất từ các chủng vi khuẩn đã phân lập được dựa vào xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý (pH, nhiệt... trò của vi sinh vật trong xử lý nước ô nhiễm dầu 1.3.1 Vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu Trong dầu mỏ chủ yếu là các hợp chất hydrocarbon nên dễ bị vi sinh vật phân hủy trong điều kiện hiếu khí và kị khí Có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sử dụng hydrocarbon như nguồn carbon và năng lượng duy nhất [5, 8, 9] Trong tự nhiên các vi sinh vật phân hủy dầu và các sản phẩm từ dầu mỏ luôn tồn tại và phân. .. pháp của Sanger 22    PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguyên liệu Mẫu đất và mẫu nước ô nhiễm dầu được thu thập tại khu công nghiệp Dung Quất, tỉnh Quảng Ngãi được lưu trữ tại Phòng Công nghệ sinh học môi trường, Vi n Công nghệ sinh học, Vi n Hàn lâm khoa học và Công nghệ Vi t Nam trong vòng 24h để phân tích 2.1.2 Hóa chất và môi trường nuôi cấy ™ Hóa chất Các hóa chất được. .. polysaccharide, khi vi khuẩn đã bám vào bề mặt, chúng phân chia và liên tục sản xuất nhiều polysaccharide để tạo nên màng sinh học hoàn chỉnh [21] 1.4.2 Sự hình thành, thành phần và cấu trúc của biofilm ™ Sự hình thành màng sinh học 12    Hình 1.5 Quá trình hình thành màng sinh học của vi sinh vật Quá trình hình thành màng sinh học gồm 5 giai đoạn: - Giai đoạn 1 và 2: Các tế bào vi sinh vật dạng tự do được gắn... tác nhân sinh học như vi sinh vật và các chất có hoạt tính sinh học do vi sinh vật sản sinh ra đã được sử dụng kết hợp cùng với các phương pháp vật lý, hóa học để xử lý nước nhiễm dầu và đã cho kết quả khả quan Gần đây, các nhà khoa học đã đưa ra phương pháp sử dụng màng sinh học (Biofilm) để xử lý các hợp chất hữu cơ khó phân hủy trong nước bị ô nhiễm dầu Màng sinh học là tập hợp các nhóm vi sinh vật... giàu vi khuẩn và phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu diesel ™ Làm giàu tập đoàn vi sinh vật trên môi trường có chứa 1% dầu DO Nguyên tắc: Tạo môi trường thích hợp làm gia tăng số lượng vi sinh vật từ mẫu thu thập ban đầu trên nguồn cơ chất quan tâm Tiến hành: - Cân 5g mẫu đất (5 ml nước) ô nhiễm dầu vào 2 bình tam giác thể tích 250 ml có chứa 45 ml môi trường muối khoáng Gost dịch, 1% dầu. .. gạt được bao gói cẩn thận và nuôi tĩnh ở tủ ấm 30oC cho tới khi xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ (thường từ 24- 36 tiếng), từ đó đánh dấu các khuẩn lạc khác nhau dựa vào hình thái và màu sắc của khuẩn lạc 2.2.2 Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của các chủng vi khuẩn Nguyên tắc: Khi nuôi vi sinh vật trong môi trường khoáng Gost có bổ sung dầu DO, vi sinh vật sẽ sử dụng dầu DO như là nguồn carbon và