VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA LUMBROKINASE TÁI TỔ HỢP Ở PICHIA PASTORIS Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Tuyên Sinh viên thực : Nguyễn Ngọc Minh Lớp : KS CMSH 11-01 Đề tài thực phòng Công nghệ sinh học enzyme Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phó trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa luận văn giúp đỡ trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn cố PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, thời gian giúp đỡ hoàn thiện đề tài Tôi xin cảm ơn Ths Vũ Thị Bích Ngọc trực tiếp hướng dẫn trình hoàn thành luận văn Tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, sinh viên phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tận tình suốt trình làm khóa luận, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập hoàn thiện luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2015 Nguyễn Ngọc Minh i BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên đầy đủ APS Ammonium persulfate BSA Bovine serum albumin (albumin huyết bò) Bp Base pairs cs Cộng cDNA Complement DNA DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 2’ Deoxynucleoside 5’ triphosphate ĐC EDTA kb kDa Đối chứng Ethylene diamine tetraacetic acid Kilo base Kilo dalton M Marker (thang chuẩn) OD Optical density PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease rLK Recombinant lumbrokinase (lumbrokinase tái tổ hợp) Rpm Revolutions per minute (vòng quay/ phút) SDS Sodium dodecyl sulfate SDSPAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA TEMED v/v WHO N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine Volume/ volume World Health Organization Nguyễn Ngọc Minh ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Hóa chất enzyme 15 Bảng 2 Dung dịch đệm 16 Bảng Môi trường 17 Bảng Máy móc thiết bị 17 Bảng Thành phần gel co gel tách 20 Bảng Hàm lượng protein hoạt tính riêng dịch sau hòa tủa nồng độ muối bão hòa khác 25 Bảng Hiệu suất tinh rLK 27 Bảng 3 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme 33 Nguyễn Ngọc Minh iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Cơ chế hoạt động LK Hình Vector pPICZαA 13 Hình Đường chuẩn BSA (Sigma) 20 Hình 2 Đường chuẩn plasmin (Sigma) 22 Hình Điện di đồ protein ngoại bào thu từ dịch nuôi cấy chủng nấm men tái tổ hợp 24 Hình Đĩa thử hoạt tính thủy phân fibrin sau khảo sát nồng độ tủa muối ammonium sulfate dịch lên men chủng nấm men tái tổ hợp XpPLK11 26 Hình 3 (A) Điện di đồ sản phẩm tinh rLK, (B) Đĩa thử hoạt tính thủy phân fibrin 27 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rLK 29 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền enzyme rLK 30 Hình Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme 30 Hình Ảnh hưởng pH đến độ bền enzyme 31 Hình Ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính enzyme 32 Hình 9.Ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính enzyme 33 Nguyễn Ngọc Minh iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT .ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv MỤC LỤC v MỤC LỤC v MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh tắc nghẽn mạch máu 1.1.1 Sơ lược bệnh tắc nghẽn mạch máu 1.1.2 Khái niệm bệnh tắc nghẽn mạch máu 1.1.3 Nguyên nhân gây tắc nghẽn mạch máu 1.1.4 Các phương pháp điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu 1.2 Khái quát lumbrokinase 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Nguồn gốc 1.2.3 Cơ chế hoạt động 1.2.4 Ứng dụng 1.3 Tình hình nghiên cứu 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu lumbrokinase nước 10 1.4 Gỉớỉ thiệu hệ biểu P pastoris 11 1.4.1 Hệ biểu P pastoris 11 1.4.2 Vector biểu pPICZαA 13 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15 2.1 Vật liệu hóa chất 15 2.1.1 Chủng vi sinh vật 15 2.1.3 Dung dịch đệm 15 2.1.4 Môi trường 16 2.1.5 Máy móc thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Biểu lumbrokinase tái tổ hợp chủng P pastoris 18 2.2.2 Tủa muối ammonium sulfate 18 2.2.3 Tinh protein tái tổ hợp 18 2.2.4 Xác định hàm lượng protein 19 2.2.5 Điện di biến tính protein (SDS-PAGE) 20 2.2.5 Xác định hoạt tính thủy phân fibrin 21 2.2.6 Xác định yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1 Biểu lumbrokinase P pastoris 24 3.2 Tinh lumbrokinase tái tổ hợp 25 3.2.1 Tủa protein muối ammonium sulfate 25 Nguyễn Ngọc Minh v 3.2.2 Tinh lumbrokinase 26 3.3 Đánh giá tính chất rLK 27 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính độ bền enzyme rLK 27 3.3.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính độ bền enzyme rLK 30 3.3.3 Ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính enzyme rLK 31 3.3.4 Ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính enzyme rLK 32 3.3.5 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme rLK 33 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 39 Nguyễn Ngọc Minh vi MỞ ĐẦU Bệnh tim mạch nguyên nhân gây tử vong cao toàn giới Theo tổ chức Y tế giới (WHO), hàng năm có khoảng 17 triệu người chết bệnh tim mạch, dự tính lên tới 23,3 triệu người vào năm 2030 Trên 80% ca tử vong xảy nước có thu nhập thấp trung bình, điển hình nước phát triển vùng Nam Á Đông Nam Á, nơi bệnh tim mạch gia tăng với tốc độ công nghiệp hóa, đô thị hóa thay đổi lối sống [18] Tại Việt Nam, theo thống kê Viện tim mạch, tỷ lệ người dân mắc bệnh tim mạch đột quỵ khoảng 16% dân số Có nhiều nguyên nhân dẫn tới rối loạn tim mạch mạch máu não như: chứng tràn máu não, tăng huyết áp, sơ cứng động mạch [21] Trong tổng số bệnh nhân bị tai biến mạch máu não có đến 24% tử vong, 50% sống bị di chứng nặng nhẹ, có 26% số bệnh nhân sống làm việc bình thường Nguyên nhân chủ yếu xuất cục máu đông gây tắc mạch cản trở lưu thông máu Do đó, việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng việc điều trị bệnh Vào khoảng năm 90, nhà nghiên cứu Nhật Bản phát enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, bao gồm izozyme đặt tên chung lumbrokinase [30] Về phương diện lâm sàng, lumbrokinase xem thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng làm thuốc uống hấp thu từ ruột vào máu hoạt hóa hệ thống fibrin nội sinh [35] Một ưu điểm lớn lumbrokinase so với thuốc điều trị bệnh tắc nghẽn mạch thông dụng khác - thường sử dụng làm thuốc tiêm tPA (tissue type plasminogen activator), urokinase streptokinase [24] tác dụng phụ, không gây chảy máu hệ thống, giá thành rẻ Hiện nay, hầu hết thuốc đặc trị tắc nghẽn mạch máu có mặt Việt nam phải nhập từ nước có giá thành cao Vì vậy, năm gần đây, nghiên cứu sản xuất yếu tố chống tắc nghẽn mạch máu dạng tự nhiên tái tổ Nguyễn Ngọc Minh hợp bắt đầu quan tâm nước Trong việc ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp nhà nghiên cứu giới quan tâm Các chủng tái tổ hợp có ưu điểm: chủ động giống, hoạt tính cao, ổn định, thuận lợi cho trình sản xuất tạo sản phẩm Nhằm góp phần vào việc tạo sản phẩm chủ động nguồn nguyên liệu để sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp, đề tài KC04.01/11-15 (2012-2014) “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp làm thuốc phòng chống tắc nghẽn mạch máu’’ cấp Bộ Khoa học Công nghệ PGS.TS Quyền Đình Thi làm chủ nhiệm đề xuất xây dựng quy trình công nghệ sản xuất lumbrokinase tái tổ hợp Chúng tiến hành nghiên cứu “Tinh đánh giá tính chất lumbrokinase tái tổ hợp Pichia pastoris” Với đề tài trên, luận văn tập trung giải mục tiêu sau: (1) Tinh lượng lớn protein lumbrokinase tái tổ hợp có hoạt tính thủy phân fibrin; (2) Đánh gía tính chất lumbrokinase tái tổ hợp tinh Nguyễn Ngọc Minh CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh tắc nghẽn mạch máu 1.1.1 Sơ lược bệnh tắc nghẽn mạch máu Bệnh tắc nghẽn mạch máu gây rối loạn tim mạch tai biến mạch máu não nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới Liên đoàn tim mạch giới đưa thống kê ba người có người tử vong có người tử vong bệnh tim mạch Ở Mỹ 29 giây có người bị bệnh mạch vành, phút có người tử vong Tử vong bệnh tim mạch chiếm 42% toàn ca tử vong, phí tổn bệnh chiếm 128 tỉ usd năm Hiện giới số người chết chịu di chứng nặng nề từ bệnh tim mạch tai biết mạch máu não ngày gia tăng, nước phát triển Ngoài có nhiều bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu não như: tràn máu não, nhồi máu tim, tắc động mạch phổi Nguyên nhân chủ yếu bệnh cục máu đông làm tắc nghẽn mạch máu Do để hạn chế thấp tỉ lệ tử vong biến chứng bệnh tim mạch gây ra, nhà khoa học theo hướng xử lý huyết khối hình thành thành mạch Và việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng việc điều trị bệnh tim mạch 1.1.2 Khái niệm bệnh tắc nghẽn mạch máu Bệnh tắc nghẽn mạch máu chứng bệnh fibrin bị đóng cục tạo thành cục máu đông lưu giữ mạch gây tắc mạch cản trở lưu thông máu Bệnh tác động nên hệ thống động mạch (gọi huyết khối động mạch xơ vữa) hệ thống tĩnh mạch (gọi thuyên tắc- huyết khối tĩnh mạch) [33] Huyết khối động mạch xơ vữa tượng chất béo tích tụ thành động mạch tạo thành mảng xơ vữa động mạch Khi mảng xơ vữa bị vỡ ra, chỗ này, máu bị hoạt hóa đông cục gây tắc động mạch Những cục máu đông gọi huyết khối Bệnh gây tượng nhồi máu tim, hoại tử [33] Thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch chứng bệnh có liên quan đến tình Nguyễn Ngọc Minh Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền enzyme rLK 3.3.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính độ bền enzyme rLK pH môi trường ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa gốc hydrocacbon acid amin phân tử enzyme, ion hóa nhóm chức trung tâm hoạt động, ion hóa chất, ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến hoạt tính rLK, dịch enzyme rLK pha đệm 20 mM acetate (pH 3- 5,5), phosphate (pH 6- 8) tris- HCl (pH 8,5- 11), để ổn định nhiệt độ phòng 30 phút, nhỏ dịch lên đĩa fibrin, ủ 37oC xác định hoạt tính lại Mẫu đối chứng đệm với giá trị pH tương ứng không chứa enzyme rLK Hình Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme Nguyễn Ngọc Minh 30 Nhận thấy, tăng pH từ 3- 6, hoạt tính enzyme tăng dần Hoạt tính enzyme cao khoảng pH từ 6,5- 8,5 (hoạt tính tương đối 100%) Hoạt tính enzyme giảm nhanh pH tăng từ 9- 11 (hoạt tính lại 62%) Như vậy, enzyme hoạt động tối ưu khoảng pH trung tính từ 6,5- 8,5 (Hình 3.4) Độ bền enzyme phụ thuộc vào trạng thái ion hóa phân tử Để xác định độ bền enzyme pH khác nhau, dịch enzyme pha vào đệm potassium phosphate, pH 6,5- 8,5, ủ 10- 60 phút, sau dịch enzyme nhỏ lên đĩa fibrin, ủ phản ứng 370C Đo diện tích vòng phản ứng xác định hoạt tính lại Hoạt tính giảm dần theo thời gian, pH 6,5, hoạt tính enzyme lại 49,8% sau 60 phút ủ Hoạt tính tương đối lại 85,9% pH sau ủ 60 phút Tại pH 7,5- 8, hoạt tính lại 72,8% 49,8% Trong đó, pH 8,5, hoạt tính lại 31% sau 60 phút ủ (Hình 3.7) Điều chứng tỏ enzyme bền khoảng pH trung tính (7- 7,5) Hình 3.7 Ảnh hưởng pH đến độ bền enzyme 3.3.3 Ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính enzyme rLK Tất dung môi nồng độ khác ảnh hưởng đến hoạt tính rLK Với Aceton, hoạt tính tương đối rLK nồng độ 10% 6,5%, 20% 2,4%, 30% 12,4% Ethanol làm giảm hoạt tính từ 34% đến tăng nồng độ từ 10% đến 30% Methanol làm bất hoạt hoàn toàn hoạt tính enzyme nồng độ Nguyễn Ngọc Minh 31 10% 20%, nồng độ 30% hoạt tính tương đối rLK 4,2% Với nButanol, hoạt tính tương đối rLK 34,3% nồng độ 10% sau tăng lên 109,4% nồng độ 20% giảm xuống 100% nồng độ 30% Còn với isopropanol hoạt tính tương đối rLK 66,6% nồng độ 10% 20% sau giảm xuống 39,9% nồng độ 30% Như vậy, rLk ủ với với n-Butanol nồng độ 20%- 30% giữ nguyên hoạt tính so với đối chứng Hình Ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính enzyme 3.3.4 Ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính enzyme rLK Một số chất tẩy rửa có hoạt động bề mặt Tween 20, Tween 80, Triton X100 SDS ảnh hưởng tới hoạt tính rLK Khi tăng nồng độ chất tẩy rửa làm giảm hoạt tính enzyme Ở nồng độ 0,5% , Tween 20 làm giảm hoạt tính 34,6% so với đối chứng, 2% Tween 20 làm giảm hoạt tính 76,4% so với đối chứng Ở nồng độ 0,5%, Tween 80 làm giảm hoạt tính 95,5% so với đối chứng, 2% Tween80 làm bất hoạt hoàn toàn hoạt tính enzyme Ở nồng độ 0,5%, Triton X100 làm giảm hoạt tính 94,5% so với đối chứng Còn 2%, Triton X-100 làm giảm hoạt tính 62,1% so với đối chứng Ở nồng độ 0,5%, SDS làm giảm hoạt tính 53,3% so với đối chứng Còn 2% SDS làm bất hoạt hoàn toàn hoạt tính enzyme Như vậy, chất tẩy rưả khảo sát, rLK ủ với Tween 20 nồng độ 0, 5%- 1%, hoạt tính thủy phân giữ 55%- 65% so với đối chứng Nguyễn Ngọc Minh 32 Hình Ảnh hưởng chất tẩy rửa đến hoạt tính enzyme 3.3.5 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme rLK Bảng 3 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme Các ion Hoạt tính thủy phân fibrin tương đối (%) mM 10 mM 15 mM ĐC 100 100 100 Na+ 113 142 100 2+ 191 142 76 3+ 24 2+ Fe2+ 12 24 55 K+ 65 0 Mg2+ 65 100 127 Ni2+ 100 100 100 2+ 100 113 127 46 46 76 Ca Al Cu Zn EDTA Mức độ ảnh hưởng ion kim loại nồng đô khác hoạt tính rLK khác (bảng 3.3) Kết bảng 3.3 cho thấy, nồng độ mM, hầu hết ion kim loại giảm hoạt tính enzyme, thấp ion Al3+, ion làm bất hoạt hoàn toàn hoạt tính enzyme Nhưng ion Na+ Ca2+ lại làm tăng hoạt tính enzyme lần Nguyễn Ngọc Minh 33 lượt 13% 91% Ion Ni2+ Zn2+ giữ nguyên hoạt tính so với đối chứng Ở nồng độ 10 mM, ion Al3+, Cu2+, Fe2+, K+, làm giảm hoạt tính enzyme, thấp ion K+ làm bất hoạt hoàn toàn hoạt tính enzyme Các ion Mg2+, Ni2+ giữ nguyên hoạt tính so với đối chứng Còn ion Na+ Zn2+ làm tăng hoạt tính 42 % 13% so với đối chứng Ở nồng độ 15 mM, hầu hết ion làm giảm hoạt tính enzyme ion Cu2+ làm bất hoạt hoàn toàn hoạt tính enzyme Ion Na+ ion Ni2+ giữ nguyên hoạt tính so với đối chứng Còn ion Zn2+ làm tăng hoạt tính 27% so với đối chứng Như vậy, hầu hết ion kim loại khảo sát ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme, trừ ion Zn2+ không ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme Ion Al3+ Cu2+ ức chế mạnh đến hoạt tính rLK Ion Zn2+, Ca2+, Mg2+ hoạt hóa nhẹ đến hoạt tính rLK Nguyễn Ngọc Minh 34 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Lumbrokinase tái tổ hợp tinh có khối lượng phân tử khoảng 47 kDa, hoạt tính thủy phân fibrin đạt 5,69 U/mg Hiệu suất tinh đạt 16,6% độ đạt 1,75 lần Lumbrokinase tái tổ hợp hoạt động tối ưu nhiệt độ khoảng 3545oC, pH đạt 6,5- 7,5 Lumbrokinase tái tổ hợp bền pH trung tính Sau 60 phút ủ, hoạt tính thủy phân fibrin lại 80% Lumbrokinase bền 37 o C, sau 60 phút ủ, hoạt tính thủy phân fibrin trì ổn định đạt 100% Lumbrokinase tái tổ hợp bị ảnh hưởng dung môi hữu cơ, chất tẩy rưả ion kim loại Hầu hết chất dung môi hữu ảnh hưởng tới lumbrokinase tái tổ hợp, trừ n-butanol nồng độ 20%- 30%, hoạt tính thủy phân fibrin không bị ảnh hưởng Các ion kim loại ảnh hưởng tới hoạt tính lumbrokinase tái tổ hợp, ion Ni2+ Zn2+ tất nồng độ nghiên cứu, hoạt tính tăng nhẹ so với đối chứng Riêng ion Na+ Ca2+ hoạt tính thủy phân fibrin tăng từ 13%- 91% so với đối chứng Kiến nghị Hoàn thành quy trình tinh lumbrokinase tái tổ hợp từ chủng nấm men P pastoris XpPLK để tạo sản phâm làm nguyên liệu ứng dụng điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu Nguyễn Ngọc Minh 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Ngọc Dao., Tạo dòng phân tích trình tự gen serine protease thủy phân fibrin từ giun quế (Perionyx excavatus) 2004 Vũ Thị Bích Ngọc., Tạo dòng biểu gen mã hóa lumbrokinase Pichia pastoris 2013 Vũ Thị Bích Ngọc., Biểu hiện, tinh đánh tính chất lumbrokinase P.pastoris 2014 Quyền Đình Thi., Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất Lumbrokinase tái tổ hợp làm thuốc phòng chống tắc nghẽn mạch máu 2012 Lý Thị Bích Thủy., Tinh khảo sát số tính chất enzyme thủy phân fibrin dịch chiết từ loài giun quế p excavatus 2006 Phan Thị Bích Trâm., Tách chiết tinh enzyme thủy phân fibrin từ p excavatus 2007 Tài liệu tiêng Anh 10 11 12 13 14 15 Bassam, B.J., G Caetano-Anolles, and P.M Gresshoff, Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels Anal Biochem, 1991 196(1): p 80-3 Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem, 1976 72: p 248-54 Craven, L.L., Coronary thrombosis can be prevented J Insur Med, 1950 5(4): p 47-8 Cregg, J.M., T.S Vedvick, and W.C Raschke, Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris Biotechnology, 1993 11(8): p 905-10 Cho, I.H., E.S Choi, and H.H Lee, Molecular cloning, sequencing, and expression of a fibrinolytic serine-protease gene from the earthworm Lumbricus rubellus J Biochem Mol Biol, 2004 37(5): p 574-81 Choong, P.F and A.P Nadesapillai, Urokinase plasminogen activator system: a multifunctional role in tumor progression and metastasis Clin Orthop Relat Res, 2003 415(58): p S46-58 Daly, R and M.T Hearn, Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production J Mol Recognit, 2005 18(2): p 119-38 El-Bessoumy, A.A., M Sarhan, and J Mansour, Production, isolation, and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation J Biochem Mol Biol, 2004 37(4): p 387-93 Fan, Q., et al., Some features of intestinal absorption of intact fibrinolytic Nguyễn Ngọc Minh 36 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 enzyme III-1 from Lumbricus rubellus Biochim Biophys Acta, 2001 15(3): p 286-92 Ge, T., et al., Cloning of thrombolytic enzyme (lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris Protein Expr Purif, 2005 42(1): p 20-8 Ge, T., et al., High density fermentation and activity of a recombinant lumbrokinase (PI239) from Pichia pastoris Protein Expr Purif, 2007 52(1): p 1-7 Grieger, F., H Baumann, and I Wolf, [Cardiovascular effects of angiotensin II implantates on the intact unanesthesized rat A contribution to produce a medium-term experimental hypertension] Acta Biol Med Ger, 1972 28(1): p 99-107 Hu, R., et al., Codon optimization, expression, and characterization of recombinant lumbrokinase in goat milk Protein Expr Purif, 2004 37(1): p 83-8 Hu, W., et al., Cytoplasmic impact on cross-genus cloned fish derived from transgenic common carp (Cyprinus carpio) nuclei and goldfish (Carassius auratus) enucleated eggs Biol Reprod, 2005 72(3): p 510-5 Innerfield, I., Clinical syndromes associated with impaired fibrinolytic activity Am Pract Dig Treat, 1960 11: p 189-200 Jakoby, W.B., Crystallization as a purification technique, Enzyme Purification and Related Techniques, in Methods in Enzymology Academic Press, 1971 22 Kanai, T., et al., Recombinant thermostable cycloinulo-oligosaccharide fructanotransferase produced by Saccharomyces cerevisiae Appl Environ Microbiol, 1997 63(12): p 4956-60 Kunamneni, A., T.T Abdelghani, and P Ellaiah, Streptokinase the drug of choice for thrombolytic therapy J Thromb Thrombolysis, 2007 23(1): p 923 Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature, 1970 227(5259): p 680-5 Li, G., et al., Cloning, expression and characterization of a gene from earthworm Eisenia fetida encoding a blood-clot dissolving protein PLoS One, 2012 7(12): p 27 Macauley-Patrick, S., et al., Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system Yeast, 2005 22(4): p 249-70 Mahendra, P and S Bisht, Anti-anxiety activity of Coriandrum sativum assessed using different experimental anxiety models Indian J Pharmacol, 2011 43(5): p 574-7 Melbye, A.G., et al., Chemical and toxicological characterization of an unresolved complex mixture-rich biodegraded crude oil Environ Toxicol Chem, 2009 28(9): p 1815-24 Mihara, H., [Fibrinolytic enzymes extracted from the earthworm Lumbricus rubellus: a possible thrombolytic agent] Nihon Seirigaku Zasshi, 1991 53(7): p 231-43 Mihara, H., et al., A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Nguyễn Ngọc Minh 37 32 33 34 35 36 Lumbricus rubellus Jpn J Physiol, 1991 41(3): p 461-72 Pomero, F., et al., Poor predictive value of contemporary bleeding risk scores during long-term treatment of venous thromboembolism A multicentre retrospective cohort study Thromb Haemost, 2014 112(3): p 511-21 Smith, H.C., et al., Coronary artery thrombosis in patients with unstable angina Br Heart J, 1981 45(4): p 411-6 Xu, Z.R., et al., Expression, purification, and characterization of recombinant lumbrokinase PI239 in Escherichia coli Protein Expr Purif, 2010 69(2): p 198-203 Yan, X.M., et al., Intestinal Absorption of Fibrinolytic and Proteolytic Lumbrokinase Extracted from Earthworm, Eisenia andrei Korean J Physiol Pharmacol, 2010 14(2): p 71-5 Yang, J.S and B.G Ru, Purification and characterization of an SDSactivated fibrinolytic enzyme from Eisenia fetida Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 1997 118(3): p 623-31 Nguyễn Ngọc Minh 38 PHỤ LỤC Bảng P Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme Nhiệt độ Hoạt tính Hoạt tính riêng Hoạt tính lumbrokinse lumbrokinase tương đối (%) Đc+ 0,071 5,695 100 20 0,016 1,344 23 25 0,021 1,729 30,3 30 0,039 3,157 55,4 35 0,071 5,695 100 37 0,071 5,695 100 40 0,071 5,695 100 45 0,071 5,695 100 50 0,054 4,335 76,1 55 0,054 4,335 76,1 60 0,016 1,344 23,6 (oC) Nguyễn Ngọc Minh 39 Bảng P Ảnh hưởng cua pH đến hoạt tính enzyme pH Hoạt tính Hoạt tính riêng Hoạt tính lumbrokinase (U/ml) (U/mg) tương đối (%) Đc 0,040 3,240 100 0,004 0,384 11,9 3.5 0,004 0,384 11,9 0,013 1,064 32,9 4.5 0,013 1,064 32,9 0,013 1,064 32,9 5.5 0,013 1,064 32,9 0,025 2,016 62,2 6.5 0,040 3,240 100,0 0,040 3,240 100,0 7.5 0,040 3,240 100,0 0,040 3,240 100,0 8.5 0,040 3,240 100,0 0,025 2,016 62,2 9.5 0,025 2,016 62,2 10 0,025 2,016 62,2 10.5 0,025 2,016 62,2 11 0,025 2,016 62,2 Nguyễn Ngọc Minh 40 Bảng P Ảnh hưởng pH đến độ bền enzyme rLK (%) pH thời 6.5 7.5 8.5 gian 100 100 100 100 100 10 100 100 100 100 100 20 100 100 100 100 100 30 72,8 100 100 72,8 49,8 40 72,8 100 100 72,8 49,8 50 72,8 85,9 72,8 49,8 31,0 60 49,8 85,9 72,8 49,8 31,0 Bảng P Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền enzyme rLK (%) Nhiệt độ Thời gian 35 37 40 45 100 100 100 100 10 100 100 100 60,8 20 100 100 100 49,8 30 100 100 100 49,8 40 100 100 72,8 31,0 50 72,8 100 60,8 31,0 60 72,8 100 60,8 31,0 Nguyễn Ngọc Minh 41 Bảng P Ảnh hưởng chất tẩy rưả đến hoạt tính enzyme Mẫu pH Hoạt tính Hoạt tính riêng Hoạt tính lumbrokinase lumbrokinase tương đối (U/ml) (U/mg) (%) 0,071 5,695 100 0.5 0,046 3,724 65,4 0,039 3,157 55,4 1.5 0,016 1,344 23,6 0,016 1,344 23,6 0.5 0,003 0,256 4,5 0,003 0,256 4,5 1.5 0,003 0,256 4,5 -0,001 -0,106 0,0 0.5 0,003 0,256 4,5 Triton 0,008 0,709 12,5 X-100 1.5 0,016 1,344 23,6 0,027 2,160 37,9 0.5 0,033 2,636 46,3 0,021 1,729 30,4 1.5 -0,001 -0,083 -0,001 -0,106 Đc Twen 20 Twen 80 SDS Nguyễn Ngọc Minh 42 Bảng P Ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt tính enzyme Mẫu % Hoạt tính Hoạt tính riêng Hoạt tính lumbrokinase lumbrokinase tương đối (U/ml) (U/mg) (%) 0,136 10,863 100 10 0,008 0,709 6,5 20 0,003 0,256 2,3 30 0,016 1,344 12,3 10 0,046 3,724 34,2 20 0,027 2,160 19,8 30 -0,001 -0,106 10 -0,001 -0,106 20 0 30 0,005 0,460 4,2 10 0,046 3,724 34,2 20 0,149 11,882 109,3 30 0,136 10,863 100 10 0,091 7,236 66,6 Isopropanol 20 0,091 7,236 66,6 30 0,054 4,335 39,9 Đc Aceton Ethanol Methanol n-Butanol Nguyễn Ngọc Minh 43 Bảng P Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính enzyme Mẫu Nồng độ 2+ Ca 3+ Al Cu Fe 2+ 2+ + K 2+ Mg 2+ Ni Zn 2+ EDTA Nguyễn Ngọc Minh Hoạt tính tương đối (U/ml) (U/mg) (%) 23,922 100 10 15 0,081 0,101 0,071 6,443 8,075 5,695 113,1 141,7 100 0,136 10,863 190,7 10 15 0,101 0,054 8,075 4,335 141,7 76,1 -0,001 0,001 0,016 -0,10 0,097 1,344 1,7 23,6 0,003 0,001 0,256 0,097 -0,015 4,5 1,7 0,008 0,016 0,039 0,709 1,344 3,157 12,4 23,6 55,4 0,046 -0,001 3,724 -0,015 -0,106 65,3 0 0,046 0,071 0,091 3,724 5,695 7,236 65,3 100 127 0,071 0,071 0,071 5,695 5,695 5,695 100 100 100 0,071 0,081 0,091 5,695 6,443 7,236 100 113,1 127 0,033 0,033 0,054 2,636 2,636 4,335 46,2 46,2 76,1 Na Hoạt tính riêng lumbrokinase 0,071 ĐC + Hoạt tính lumbrokinase 10 15 10 15 10 15 10 15 10 15 10 15 10 15 10 15 44 [...]... LK ở 3 hệ biểu hiện E coli, Bacillus và P pastoris Đã tiến hành tinh sạch và nhận dạng enzyme lumbrokinase tái tổ hợp bằng khối phổ Maldi- Tof, chọn lựa được 1 chủng nấm men tái tổ hợp (ký hiệu XpPLK 11) có khả năng sinh tổng hợp LK cao trong 3 hệ biểu hiện đã tạo được, tối ưu các điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp LK từ chủng tái tổ hợp trên thiết bị 5 lít, 10 lít và 80 lít để thu sản phẩm LK tái tổ hợp, ... quy mô phòng thí nghiệm[4] Năm 2013 Vũ Thị Bích Ngọc và cộng sự đã tạo dòng và biểu hiện thành công gen mã hóa lumbrokinase ở Pichia pastoris [2] Năm 2014 Vũ Thị Bích Ngọc và cộng sự đã hoàn thành đề tài “Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của của lumbrokinase ở P pastoris [3] 1.4 Gỉớỉ thiệu về hệ biểu hiện P pastoris 1.4.1 Hệ biểu hiện P pastoris Hơn 3 thập niên trước, E coli được sử dụng... bằng phương pháp thẩm tích trong nước cất qua đêm ở 4oC để sử dụng cho quá trình tinh sạch tiếp theo 2.2.3 Tinh sạch protein tái tổ hợp Nguyên lý Protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng cột resin gắn nikel chuyên dùng cho các protein tái tổ hợp có đuôi polyhistidine Trong đó, resin là chất mang dạng agarose liên kết chéo, chứa thụ thể iminodiacetic acid và chất này làm cầu nối với niken2+ Cột resin-nikel... 65, 70%: dịch hòa tủa ở nồng độ 60, 65 và 70% muối bão hòa) 3.2.2 Tinh sạch lumbrokinase Protein tái tổ hợp rLK được thiết kế gắn thêm đuôi gồm 6 gốc Histidine, phục vụ cho việc tinh sạch enzyme được dễ dàng và hiệu quả Protein này được tinh sạch qua cột resin của hãng Invitrogen cho hệ thống tinh sạch ProbondTM Độ sạch của rLK được kiểm tra trên gel polyacrylamide 12,5%, nhuộm bạc và quan sát kết quả... enzyme (5 µg protein) được ủ với các chất tẩy rửa Tween 20, Tween 80, SDS và triton X-100 ở các nồng độ 0,5 – 2 % Ủ hỗn hợp trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, nhỏ dịch lên đĩa fibrin, tính diện tích vòng phản ứng sau 5 giờ ủ Hoạt tính còn lại của enzyme được xác định Ảnh hưởng của ion kim loại Để đánh giá mức độ của ion kim loại lên hoạt tính của LK tái tổ hợp, 100 µl dịch enzyme (5 µg protein)... nghiên cứu 2.2.1 Biểu hiện lumbrokinase tái tổ hợp ở chủng P pastoris Chủng nấm men P pastoris tái tổ hợp được nuôi cấy qua đem ở 20oC trong 5 ml môi trường YPG Sau đó tiếp giống 2% dịch giống sang bình 500 ml chứa 100 ml YP lỏng bổ sung 1 % methanol nuôi lắc ở 28 oC, cứ 24h lại bổ sung chất cảm ứng methanol và nuôi lắc 200 vòng ở 28 oC để cảm ứng tế bào biểu hiện protein tái tổ hợp Sau 96 giờ nuôi cấy... trong năm 2004, Hu và cộng sự đã tối ưu hóa dòng tế bào, biểu hiện và đánh giá tính chất lý hóa của LK tái tổ hợp trong sữa dê Hai gen LK đã được nhân dòng và tối ưu hóa đưa vào vector biểu hiện tế bào tuyến vú pIbCP Vector pIbPCLK đã được trực tiếp đưa vào tế bào tuyến vú ở dê Kết quả đã chỉ ra rằng cả 2 gen LK-w và LK-m đã được thể hiện trong sữa dê Hoạt tính thủy phân fibrin của LK-w trong sữa là... SDS-PAGE và Western blot, kết quả đã chỉ ra rằng PI239 tái tổ hợp đã tiết vào dịch nuôi cấy và có hoạt tính thủy phân fibrin [16] Năm 2007, Ge và cộng sự đã dùng vector biêu hiện pPICZαA và tế bào vật chủ là P pastoris KM71 để biẻu hiện LK tái tổ hợp (rPI239), kết quả là thu được protein táí tổ hợp có trọng lượng phân tử cao hơn trong lượng của phân tử PI239 hoàn chỉnh (29 kda) [17] Tới năm 2010, Xu và. .. 7,98±0,0015 3,24 25,85 Dịch qua cột 5,73±0,0023 0,067 0,38 Dịch tinh sạch 0,756±0,0015 5,69 4,30 Độ sạch Hiệu suất (%) 1 100 1,75 16,6 Kết quả trên bảng 3.2 cho thấy hiệu suất tinh sạch từ P pastoris X33/pPLK đạt 16,6 % với độ sạch 1,75 lần, hoạt tính riêng rLK đạt 5,69 U/mg 3.3 Đánh giá tính chất của rLK 3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền enzyme rLK Do enzyme là protein nên khác với các... 4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rLK Theo nghiên cứu của Lý Thị Bích Thủy và cs (2006), ở 400C, hoạt tính enzyme là cao nhất (100%) và không đổi trong các khoảng thời gian 10- 60 phút Ở các nhiệt độ 500C và 600C, hoạt tính enzyme giảm dần và giảm nhanh hơn theo thời gian đối với 600C (hoạt tính còn 65% sau 60 phút ủ) Ở 700C, hoạt tính enzyme còn 20% sau 60 phút ủ và mất hoàn toàn ở 800C sau