Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung MỞ ĐẦU Tình hình biến đổi khí hậu toàn cầu (BĐKH) vấn đề thời sự, thu hút quan tâm, lo lắng toàn nhân loại BĐKH diễn thường xuyên diện rộng, vượt tầm kiểm soát người gây tác động lớn đến đời sống kinh tế toàn cầu, đặc biệt nông nghiệp Vì vậy, việc nghiên cứu chọn tạo giống trồng có khả thích ứng cao với bất lợi thời tiết cần thiết cấp bách Việt Nam quốc gia dự đoán bị ảnh hưởng nhiều tác động biến đổi khí hậu Diễn biến thời tiết năm gần cho thấy hạn nguyên nhân làm giảm suất trồng; chí có nơi, có vụ hạn gây thất thu làm sản lượng nông nghiệp không ổn định Vì vậy, việc tạo giống trồng có tính kháng hạn cao có ý nghĩa đặc biệt quan trọng góp phần tăng suất, xóa đói giảm nghèo, ổn định xã hội, tăng dân trí vị quốc gia Từ hàng ngàn năm trước, người biết tạo giống trồng mang đặc tính mong muốn phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính hai dòng mang gen mong muốn) Tuy nhiên, phương pháp cần nhiều thời gian, công sức nhiều trường hợp, lai thu kèm tình trạng không mong muốn Ngày nay, nghiên cứu hệ gen xác định đặc tính, chức gen hữu ích kỹ thuật di truyền chuyển trực tiếp gen hữu ích vào đối tượng trồng khác tạo trồng chuyển gen mang đặc tính quý tăng tính chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng suất chất lượng, cải thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hóa học cần sử dụng… Trong năm vừa qua, hàng loạt nghiên cứu chuyển gen hữu ích vào đối tượng trồng tiến hành nhiều phòng thí nghiệm kết tạo nhiều giống trồng chuyển gen mang đặc tính quý chống sâu, kháng thuốc diệt cỏ, suất cao, chất lượng tốt Đặc biệt số giống Page Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung chuyển gen thương mại diện tích gieo trồng ngày tăng sản xuất, đáp ứng kỳ vọng thực tế sản xuất Tính trạng chịu hạn tính trạng đa gen, nhiều nghiên cứu tạo giống trồng chuyển gen chịu hạn nghiên cứu năm qua kết chưa có giống trồng chịu hạn thương mại hóa [9, 54, 60] Gần đây, xu hướng tạo giống trồng chuyển gen chịu hạn tập trung vào nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn (gen điều khiển chịu hạn) lý do: (1) biểu gen liên quan đến tính chịu hạn liên quan chặt chẽ đến trình phiên mã, (2) gen điều khiển tính chịu hạn mã hoá protein có khả hoạt hoá biểu hàng loạt gen chức liên quan đến chịu hạn thông qua trình phiên mã kết thực vật tăng cường tính chịu hạn Điều giải thích tính trạng chịu hạn tính trạng đa gen cần chuyển gen điều khiển tính chịu hạn tăng sức chống hạn chuyển gen Vì vậy, việc phân lập nghiên cứu đặc tính gen điều khiển trở thành vấn đề thời mang tính toàn cầu nghiên cứu lẫn nghiên cứu áp dụng Hiện có nhiều công bố chuyển thành công gen điều khiển chịu hạn vào mô hình Arabidopsis, lúa, cà chua, đậu tương, ngô Dựa vào thực tế trên, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati“ Với mục tiêu sau: - Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã OsNAC6 điều khiển tính chịu hạn lúa - Tập trung tối ưu hoá quy trình chuyển gen thao tác di truyền lúa - Tạo lúa chuyển gen OsNAC6 có khả chống chịu tốt với điều kiện hạn Chương TỔNG QUAN 1.1 NÔNG NGHIỆP TRONG ĐIỀU KIỆN BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU TOÀN CẦU 1.1.1 TÌNH HÌNH BIẾN ĐỔI KHÍ HẦU TOÀN CẦU Page Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung Theo Bộ Tài nguyên- Môi trường, biến đổi khí hậu diễn phạm vi toàn cầu, khu vực Việt Nam Biến đổi khí hậu tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống môi trường phạm vi giới, có Việt Nam Biến đổi khí hậu thay đổi hệ thống khí hậu gồm khí quyển, thuỷ quyển, sinh quyển, thạch tương lai nguyên nhân tự nhiên nhân tạo giai đoạn định từ tính thập kỷ hay hàng triệu năm Sự biển đổi thay đổi thời tiết bình quân hay thay đổi phân bố kiện thời tiết quanh mức trung bình Sự biến đổi khí hậu giới hạn vùng định hay toàn Địa Cầu Trong năm gần đây, biến đổi khí hậu gọi chung tượng nóng lên toàn cầu Nguyên nhân tượng biến đổi khí hậu toàn cầu gia tăng hoạt động tạo chất thải khí gây hiệu ứng nhà kính (bao gồm nước, CO2, CH4, N2O, O3, khí CFC), hoạt động khai thác mức bể hấp thụ bể chứa khí nhà kính sinh khối, rừng, hệ sinh thái biển, ven bờ đất liền khác Theo Trung tâm Nghiên cứu Khí tượng - Khí hậu (Viện Khoa học Khí tượng thủy văn Môi trường), tình hình biến đổi khí hậu Việt Nam diễn theo chiều hướng gia tăng tần suất cường độ tượng bão, mưa lớn, nhiệt độ cao hạn hán Thời tiết năm 2010 diễn biến phức tạp, bất thường, dịch bệnh trồng, vật nuôi xảy nhiều huyện thị, hạn hán nặng vụ hè thu, lũ lụt hồi tháng 10/2010 gây ảnh hưởng không nhỏ đến sản xuất nông nghiệp người dân Theo Phó phòng Dự báo khí tượng hạn vừa dài (Trung tâm dự báo Khí tượng-Thủy văn Trung ương) Nguyễn Đức Hoà tháng mùa khô 2010, Bắc bộ, đặc biệt Bắc Trung hạn hán gay gắt nhiều so với năm ngoái Cùng với đó, vào đầu vụ từ tháng đến tháng 3-2011, mực nước sông lớn mức thấp TBNN, độ mặn vùng cửa sông khả cao TBNN, nước mặn xâm nhập sâu vào cửa sông thẩm thấu ngầm, ảnh hưởng đến nhiều diện tích canh tác địa phương ven biển Page Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung Do khả vào vụ thiếu hụt lượng nước tưới tiêu tương đương với khoảng 200.000 [80] 1.1.2 ẢNH HƯỞNG CỦA BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU TOÀN CẦU ĐẾN SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP Nông nghiệp giới đối mặt với khó khăn lớn tình trạng biến đổi khí hậu gây Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thường xuyên xảy tỉnh miền Bắc Tính trạng hạn hán kéo dài từ cuối tháng năm ảnh hưởng nghiêm trọng vùng trồng ngô lớn Trung Quốc có nguy thu hẹp 60% diện tích trồng trọt Ấn Độ phải đối mặt với đợt hạn hán nghiêm trọng vòng năm qua Hiện có 1/3 số quận Ấn Độ rơi vào tình trạng hạn hán Thiếu hụt lượng mưa cần thiết khiến tăng trưởng kinh tế quốc gia giảm sút 1% năm Đợt hạn hán tồi tệ lịch sử gần 20 năm qua Thái Lan năm đẩy quốc gia xuất gạo lớn giới đối mặt với vụ mùa thất thu Thông báo cho biết, sản lượng gạo nước vụ mùa tới, kết thúc vào tháng 8, đạt triệu so với mức dự báo triệu trước Chưa vấn đề biến đổi khí hậu (BĐKH) lại đề cập nhiều nóng bỏng thời điểm Theo nghiên cứu Liên Hợp Quốc [81], Việt Nam quốc gia bị ảnh hưởng nhiều khu vực Đông Nam Á từ BĐKH Việt Nam, nước phát triển thời kỳ công nghiệp hóa, nằm nhóm nước dễ bị tổn thương vấn đề môi trường BĐKH gây lũ lụt, hạn hán, bão… Bên cạnh đó, với bờ biển dài, vấn đề mực nước biển dâng cao làm 12,2% diện tích đất Việt Nam đe dọa tới chỗ sinh sống 17 triệu người Những biến động thời tiết bất thường gây thiệt hại lớn cho đời sống dân nhân đất nước mà thường gọi thiên tai cần nghiên cứu, xem xét theo hướng báo động toàn cầu gia tăng nhiệt độ bề mặt trái đất mực nước biển ngày dâng cao Theo nghiên cứu chuẩn bị công bố, đến cuối Page Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung kỷ (2100), nhiệt độ Việt Nam tăng lên khoảng đến 4,5 oC mực nước biển dâng lên khoảng 10 đến 68 cm Và biến đổi khí hậu diễn với tốc độ vòng khoảng 100 năm nữa, nhiều diện tích đất liền trái đất, có vùng đồng châu thổ sông Cửu Long sông Hồng, ngập chìm nước biển [81] Theo ước tính IPCC, mực nước biển dâng cao m làm cho 22 triệu người Việt Nam nhà cửa, đồng Sông Hồng bị ngập 5.000 km2 đồng Sông Cửu Long bị ngập 15.000 - 20.000 km 2; mà hai vựa lúa lớn nhất, tập trung đông dân cư nước Mất đất, sản lượng lương thực Việt Nam giảm 12% (xấp xỉ triệu tấn) Trong miền Trung chưa hết mùa mưa lũ, tỉnh miền Bắc lại phải gồng chống hạn Sự thay đổi khắc nghiệt bất thường thời tiết khiến dải đồng sông Hồng "khát" nước Mực nước sông, hồ chứa xuống thấp, ba hồ thuỷ lợi lớn miền Bắc Hoà Bình, Thác Bà, Tuyên Quang tích 5,2 tỉ m3, thiếu 4,5 tỉ m3 so với thiết kế, đe doạ ảnh hưởng nghiêm trọng đến an ninh lương thực [82] Theo tính toán Tổng cục Thuỷ lợi, kéo dài tình trạng mưa có khoảng 650.000 lúa Đông Xuân 2010- 2011 rơi vào cảnh thiếu nước tưới Trong đó, nhận định Trung tâm Dự báo Khí tượng Thuỷ văn Trung ương cho thấy, thời tiết từ đến cuối năm đặc biệt thời điểm gieo cấy vụ Đông Xuân khắc nghiệt khô hạn tiếp tục kéo dài Đến hết năm 2010, dòng chảy sông Bắc Bộ từ thượng lưu đến hạ lưu giảm nhanh có khả nhỏ mức trung bình nhiều năm (TBNN) từ 20-40% Trong đó, hệ thống sông sông Hồng sông Thái Bình thiếu hụt với mức 35-45% 1.2 HẠN VÀ PHÂN LOẠI HẠN 1.2.1 KHÁI NIỆM HẠN Page Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung Tất sinh vật Trái đất đềucần có nước để trì hoạt động sống thể, nước có ý nghĩa sống sinh vật, đặc biệt thực vật – sinh vật khả di chuyển để tìm nguồn nước Lượng nước cần thiết cho thể thực vật phụ thuộc vào loài giai đoạn phát triển chúng Hạn thực vật khái niệm thiếu nước môi trường gây suốt trình sống hay giai đọan phát triển, làm ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển Mức độ tổn thương thực vật khô hạn gây có nhiều mức độ khác nhau: chết, chậm phát triển hay phát triển bình thường Khả giảm thiểu mức độ tổn thương thiếu hụt nước gây gọi “tính chịu hạn” thực vật trồng có khả phát triển bình thường điều kiện khô hạn gọi “cây chịu hạn” Khả giảm thiểu mức độ tổn thương thiếu hụt nước gây gọi “tính chịu hạn” thực vật [3] Tuy nhiên, khó để xác định trạng thái hạn đặc trưng mức độ khô hạn môi trường gây khác theo mùa, năm, vùng địa lý dự đoán trước Mức độ khô hạn môi trường gây nên ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển cây, làm giảm suất trồng, chí dẫn đến mùa [61] Các yếu tố môi trường thành phần thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ cao, gió nóng gây nên tượng cân áp suất thẩm thấu môi trường, dẫn đễn thiếu hụt nước tế bào, gây tượng hạn hán Hạn phân biệt thành loại hạn không khí, hạn đất hạn toàn diện [11] 1.2.2 PHÂN LOẠI HẠN Page Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 1.2.2.1 Hạn không khí Hạn không khí thường có đặc trưng nhiệt độ cao (39 - 42 0C) độ ẩm thấp (< 65%) Hiên tượng thường gặp tỉnh miền Trung nước ta vào đợt gió Lào vùng Bắc vào cuối thu, đầu đông Hiện tượng xuất số nước giới gió Chamsin Israel; gió Mistral miền nam nước Pháp… làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến số loài trồng phong lan, cam, chanh, đậu tương… [56] Hạn không ảnh hưởng trực tiếp lên phận hoa, lá, chồi non… ảnh hưởng đến trình tung phấn Đối với thực vật nói chung lúa nói riêng hạn không khí thường gây tượng héo tạm thời nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, làm cho mức độ thoát nước nhanh vượt qua mức độ bình thường, lúc rễ hút nước không đủ bù lại lượng nước mất, lâm vào tình trạng cân nước Nước sản phẩm khởi đầu, trung gian giai đoạn cuối trình chuyển hóa hóa sinh, môi trường để phản ứng trao đổi chất xảy [63] Vì vây, việc cung cấp đủ nước cho biện pháp canh tác quan trọng Hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn trồng mục tiêu nhà tạo chọn giống Mức độ thiếu hụt nước lớn ảnh hưởng xấu đến trình sinh trưởng Thiếu nước nhẹ giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, làm tăng trình già hóa tế bào Khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ học dẫn đến tế bào mô bị tổn thương chết 1.2.2.2 Hạn đất Mức độ khô hạn đất tùy thuộc vào bốc nước bề măt khả giữ nước đất Hạn đất làm cho áp suất thẩm thấu đất tăng cao đến mức lấy nước qua tế bào rễ, hạn đất gây cho héo lâu dài Hạn đất tác động trực tiếp đến phận rễ làm ảnh hưởng lớn đến trình sinh trưởng phát triển Đối với trồng cạn, hạn đất ảnh Page Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn gieo hạt nảy mầm Lượng nước đất không đủ làm co mầm héo; thiếu nước nặng gây thui chột mầm chết 1.2.2.3 Hạn toàn diện Hạn toàn diện tượng có hạn đất hạn không khí xảy lúc Trong trường hợp này, với nước không khí làm cho hàm lượng nước giảm nhanh dẫn đến nồng độ dịch bào tăng lên, sức hút nước từ rễ tăng lượng nước đất cạn kiệt không đủ cung cấp cho Hạn toàn diện thường dẫn đến tượng héo vĩnh viễn, khả phục hồi Ở nước ta, hạn toàn diện thường xảy tỉnh miền Trung (Nghệ An, Hà Tĩnh…), gây nên thiệt hại đáng kể trồng nói chung lúa nói riêng 1.3 PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN Điều kiện bất lợi môi trường gây hàng loạt thay đổi hình thái, sinh lí, sinh hoá phân tử, ảnh hưởng bất lợi cho sinh trưởng phát triển thực vật Trong điều kiện bất lợi môi trường, hạn yếu tố quan trọng nhất, đặc biệt bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu Điều kiện hạn hán làm cho thực vật phải tạo hàng loạt thay đổi mặt sinh lý để tồn thích nghi với điều kiện hạn như: Cụ thể hạn hán dẫn đến việc thực vật đóng khí khổng, giảm hô hấp quang hợp, giảm thể tích nước mô, chậm trình sinh trưởng Ở mức độ phân tử, điều kiện hạn làm cho thực vật gia tăng mức độ biểu tích luỹ gen/protein chống chịu stress [15, 59, 74] Ở Arabidopsis, protein kinase, nhân tố phiên mã (transcription factor), phosphatase, protease, protein biểu giai đoạn muộn phôi (late embryogenesis abundant(LEA), protein sinh tổng hợp Abscisic acid (ABA), protein sinh tổng hợp đường (proline, mannitol, sorbitol) hàng loạt protein chức khác tham gia vào trình chịu hạn thực vật [59] Page Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung Các protein tham gia vào trình chống hạn thực vật phân thành hai nhóm: (1) nhóm protein chức trực tiếp tham gia chống lại với điều kiện hạn (ABA, LEA, proline, mannitol, sorbitol ); (2) nhóm protein điều khiển biểu gen chức liên quan đến tính chịu hạn (nhân tố phiên mã, kinase ) Các nhân tố phiên mã bám vào trình tự ADN đặc hiệu vùng khởi động gen gen chức tham gia vào tính chịu hạn hoạt hóa biểu gen này, kết tăng cường tính chịu hạn thực vật Các nghiên cứu gen chứng minh vùng khởi động gen nhiều gen chức chứa nhiều trình tự ADN đặc hiệu điểm bám nhân tố phiên mã Điều chứng tỏ nhân tố phiên mã hoạt hóa biểu nhiều gen chức Các nghiên cứu biểu gen chứng minh nhiều nhân tố phiên mã biểu mạnh điều kiện hạn chứng tỏ nhóm protein đóng vai trò quan trọng chế điều hòa biểu gen tăng cường tính kháng hạn thực vât [60, 74] Page Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung Điều kiện hạn hán Nhóm gen nhận, truyền tín hiệu (G protein, Kinase…) Các gen điều khiển biểu Các nhân tố khởi đầu phiên mã Các gen chức (DREB, NAC, ZFHD, AREB, MYB, MYC, …) biểu Các gen chức (late embryogenesis abundant (LEA), chaperones, proteases, transporters, sugars, proline, mannitol, sorbitol ) Thực vật tăng cường tính chịu hạn Hình Cơ chế phân tử trình tăng cường tính chịu hạn thực vật 1.3.1 CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN CÁC QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA Sự thay đổi chuyển hóa sơ cấp thể cách đáp ứng thông thường với điều kiện stress thực vật Ví dụ, cADN mã hoá cho enzym glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase phân lập từ C plantagineum (bảng 1) tăng cường biểu bị xử lý điều kiện hạn xử lý ABA [68] Tuy nhiên mức độ tăng cường hoạt động enzym có liên quan với yếu tố stress môi trường thực vật, phản ánh gia tăng nhu cầu lượng Các protease đặc điểm quan trọng trình chuyển hoá điều kiện stress Chúng góp phần làm ngừng việc sử dụng protein thừa phân hủy chuỗi peptit túi chứa, qua giải phóng axit amin tự Page 10 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 1,3 kb Hình 21 Điện di sản phẩm nhân gen mã hoá nhân tố phiên mã OsNAC6 dòng lúa Pusa Basmati chuyển gen M: Thang ADN chuẩn 1kb; 1: Đối chứng dương; 2: Đối chứng âm; - 14: Các dòng lúa chuyển gen Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết trình nghiên cứu trình bày trên, rút số kết luận sau: 4.1.1 Đã phân lập gen OsNAC6 từ thư viện cDNA giống lúa Japonica Gen OsNAC6 có trình tự nucleotit tương đồng 100% so với trình tự nucleotit gen OsNAC6 giống lúa Japonica ngân hàng GenBank(mã số: AB028185.1), 93% với nhân tố phiên mã NAC ngô (mã số: EU956242.1) 91% với nhân tố phiên mã NAC bạc hà đắng (mã số: AM500854.1) 4.1.2 Đã thiết kế vector chuyển gen mang gen OsNAC6 theo thống gateway Vector pBCKH-OsNAC6 có khung vector pBI101 promoter Ubiquitine điều khiển liên tục biểu gen, thích hợp cho việc chuyển gen lúa nói riêng thực vật nói chung Page 64 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 4.1.3 Bước đầu xây dựng thành công qui trình chuyển gen OsNAC6 thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào giống lúa Pusa Basmati Đã tối ưu phương pháp khử trùng hạt đạt hiệu 98%, đồng thời tối ưu môi trường tạo callus đạt hiệu 95% môi trường tái sinh đạt hiệu 80% cho giống lúa Pusa Basmati Từ 100 hạt đưa vào môi trường tạo callus thu 12 dòng chuyển gen sinh trưởng tốt môi trường tái sinh chọn lọc có bổ sung hygromycin Kết kiểm tra có mặt gen OsNAC6 dòng lúa chuyển gen việc sử dụng phản ứng PCR đặc hiệu cho thấy, số 12 dòng lúa chuyển gen có 11 dòng mang gen OsNAC6, chứng tỏ hiệu suất chuyển gen OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati 11% 4.2 KIẾN NGHỊ 4.2.1 Tiếp tục nghiên cứu biểu gen OsNAC6 dòng lúa chuyển gen thông qua thí nghiệm Northern blot, Real-time PCR… 4.2.2 Nghiên cứu đánh giá đặc điểm sinh trưởng, khả chịu hạn nói chung stress nói riêng dòng lúa chuyển gen OsNAC6 so với giống đối chứng 4.2.3 Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen hoàn thiện quy trình chuyển gen OsNAC6 vào giống lúa Việt Nam, đặc biệt giống lúa Indica 4.2.4 Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen OsNAC6 vào đối tượng trồng nông nghiệp khác ngô, bông, đậu tương… để nghiên cứu biểu gen tìm kiếm khả áp dụng Page 65 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo, NXB Khoa học Công nghệ Nguyễn Ánh Hồng (2000) Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gen thực vật, Giáo trình cho Cao học Nông nghiệp NXB Nông nghiệp Hà Nội Trần Thị Phương Liên (1998), “Chuyên đề 3: Cơ chế phân tử tính chịu hạn thực vật” Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết ứng dụng công nghệ gen chọn tạo giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Page 66 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di tryền chọn giống thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH Abe H., Urao T., Ito T., Seki M., Shinozaki K and Yamaguchi-Shinozaki K (2003), “Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and At MYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisis acid signaling”, Plant Cell, 15, pp 63-78 Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M (1997) Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant Plant Cell 9: 841-857 Alamillo JM, Bartels D (2006), “Light and stage of development influence the expression of desiccation-induced genes in the resurrection plant Craterostigma plantagineum”, Plant Cell Environ, 19,pp 98-105 Baker, S S (1994), “The 5’-region of Arabidopsis thailiana cor15a has cisacting element that confer cold, drought and ABA regulated gene expression”, Plant Mol Biol 24, pp 701-713 10 Bartels D., Sunkars R (2005), “Drought and salt tolerance in plant”, Critical review in plant science, 24, pp 23-58 11 Bohnert H.L., Jesen R.G (1996), “Strategies of engineering water stress tolerance in plants” Tibtech, 14, pp 89-97 12 Bohnert HJ, Nelson DE, Jensen RG (2005), “Adaptations to environmental stresses”, Plant Cell 7, pp.1099–111 13 Celebi-Toprak F., Behnam B., Serrano G., Kasuga M., Yamaguchi-Shinozaki K., Naka H., Watanabe JA., Yamanaka S and Watanabe KN (2005), “Tolerance to salt stress of the transgenic Tetrasomic Tetraploid Potato, Solanum tuberosum cv Desiree appears to be induced by the DREB1A gene Page 67 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung and rd29A promoter of Arabidopsis thaliana” Breeding Sciences, 55, pp 311-319 14 Collinge, M Boller, T (2001) Differential induction of two potato genes, Stprx2 and StNAC1, in response to infection by Phytophthora infestans and to wounding Plant Mol Biol 46: 521-529 15 Choi H., Hong JH., Ha J., Kang JY., Kim SY., (2000), “ABFs, a family of ABA responsive element binding factors”, Journal of Biological Chemistry, 275, pp 1723-1730 16 Daniels MJ, Mirkov TE, Chrispeels MJ (2004), “The plasma membrane of Arabidopsis thaliana contains a mercury-insensitive aquaporin that is a homolog of the tonoplast water channel protein TIP”, Plant Physiol, 106, pp.1325–33 17 DeClercq J., Zambre M., Van M M., Dillen W and Angenon G (2002), “An optimized Agrobacterium - mediated transformation procedure for Phageolus acutifolius A.Gray”, Plant Cell Rep, (21), pp 333 – 340 18 Ding Z S., Zhao M., Jing Y X., Li L B and Kuang T Y (2006), “Efficient Agrobacterium – Mediated transformation of Rice by Phosphomannose Isomerase/Mannose selection”, Plant Molecular Biology Reporter, (24), pp.295-303 19 Ditt R F., Nester E W and Comai L (2005) “The plant cell defense and Agrobacterium tumefaciens”, FEMS Microbiology letters, 247, pp 207-213 20 Dubouzet JG., Sakuma Y., Ito Y., Kasuga M., Dubouzet EG., Miura S., Seki M., Shinozaki K and Yamaguchi-Shinozaki K (2003), “OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought, high salt and cold responsive gene expression”, Plant Journal, 33, pp 751763 21 Espartero J, Pintor-Toro JA, Pardo JM (2004), “Differential accumulation of Page 68 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung S-adenosylmethionine synthetase transcripts in response to salt stress”, Plant Mol Biol, 25, pp.217–27 22 Gao JP, Chao DY, Lin HX (2008) Toward Understanding Molecular Mechanisms of Abiotic Stress Responses in Rice Rice 1: 36-51 23 Gelvin S B (2003), “Agrobacterium - mediated plant transformation the biology behind the “Gene - jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67 (1), pp.16-37 24 Guerrero FD, Jones JT, Mullet JE (2000), “Turgor-responsive gene transcription and RNA levels increase rapidly when pea shoots are wilted: sequence and expression of three inducible genes”, Plant Mol Biol , 15, pp 11–26 25 Guiltiman M J (1990), “A plant leucine zipper protein that recognizes an Abscisic acid response element” Science, 250, pp 267-271 26 Gilmour SJ., Fowler SG., Thomashow MF (2004), “Arabidopsis transcriptional activators CBF1, CBF2 and CBF3 have matching functional activities”, Plant Mol Biol, 54, pp 767-781 27 Haake V., Cook D., Riechmann JL., Pineda O., Thomashow MF., Zhang JZ (2002), “Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in arabidopsis” Plant physiology, 130, pp 639-648 28 Hsieh T H., Lee J T., Yang P T., Chiu L H., Chargn Y Y., Wang Y C and Chan M T (2002), “Tomato plants ectopically expressing Arabidopsis CBF1 show enhanced resistence to water deficit stress”, Plant Physiol, 129, pp 1086-1094 29 Hu H, Dai M, Yao J, Xiao B, Li X, Qi Z, Xiong L (2006) Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice Pro Natl Acad Sci 103: 12987-12992 Page 69 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 30 Ito Y., Katsura K., Maruyama K., Taji T., Kobayashi M., Seki M., Shinozaki K., and Yamaguchi-Shinozaki (2006), “Functional analysis of rice DREB/CBF-type transcription factors involved in cold responsive gene expression in transgenic rice”, Plant Cell Physiol 47(1), pp 141-153 31 Iuchi S, Kobayshi M, Taji T, Naramoto M, Seki M, Kato T, Tabata S, Kakubari Y, Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki K (2001), “Regulation of drought tolerance by gene manipulation of 9- cis-epoxycarotenoid, alkey enzyme in abscisis acid biosynthesis in Arabidopsis”, Plant Journal, 27, pp 325-333 32 Kang J Y., Choi HI., Im MY., and Kim SY (2002), “Arabidopsis basic leucine zipper proteins that mediate stress-responsive abscisic acid signaling”, Plant cell, 14, pp 343-357 33 Kasuga M., Liu Q., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K., and Shinozaki K (1999), “Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single-inducible transcription factor”, Nat Biotchnol, 17, pp 287-291 34 Kim S., Kang JY., Cho DI., Park JH., Kim SY (2004), “ABF2, an ABREbinding bZIP factor, is an essential component of glucose signaling and its overexpression affects multiple stress tolerance”, Plant Journal, 40, pp 7587 35 Kiyosue T, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2003), “Characterization of cDNA for a dehydration-inducible gene that encodes a CLP A, B”, Plant Mol , 196(3), pp.1214–20 36 KoizumiM,Yamaguchi-ShinozakiK,Tsuji H, Shinozaki K (2003), “Structure and expression of two genes that encode distinct drought-inducible cysteine proteinases in Arabidopsis thailiana”, Gene , 129, pp.175–82 Page 70 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 37 Kushiro T., Okamoto M., Nakabayashi K., Yamagishi K., Kitamura S., Asami T., Hirai N., Koshiba T., Kamiya Y., Nambara E (2004), “The Arabidopsis cytochrome p450 CYP707A encodes ABA 8’- hydroxylases: key enzymes in ABA catabolism”, EMBO Journal, 23, pp 1647-1656 38 Liu Q., Kasuga M., Sakuma Y., Abe H., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K and Shinozaki K (1998), “Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signaling transduction pathways in drought - and low -temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis”, Plant Cell, 10, pp 1391-1406 39 Mittler R, Zilinskas BA (2004), “Regulation dehydration of tolerance of pea cytosolic ascorbate peroxidase and other antioxidant enzymes during the progression of drought stress and following recovery from drought”, Plant J, 5(3), pp 397–405 40 Mundy J (1990), “Nuclear protein binding conserved elements in the abscisic acid responsive promoter of a rice rab gene” Proc Natl Acad Sci U S A 87, pp 1406-1410 41 Musttili AC, Merlot S, Vavasseur A, Fenzi F, Giraudat J (2002), “Arabidopsis OST1 protein kinase mediates the regulation of stomatal aperture by abscisis acid and acts upstream of reactive oxygen species production”, The Plant Cell, 14, pp 3089-3099 42 Nakashima K., Tran LS., Van Nguyen D., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., Ito Y., Hayashi N., Shinozaki K and Yamaguchi-Shinozaki (2007), “Function analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice”, Plant Journal, 22 Page 71 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 43 Nakashima K, Ito Y, Yamaguchi-Shinozaki K (2009) Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and Grasses Plant Physiology 149: 88-95 44 Nonami H, Boyer JS (2000), “Wall extensibility and cell hydraulic conductivity decrease in enlarging stem tissues at low water potentials”, Plant Physiol, 93, pp.1610-19 45 Oh SJ., Song SI., Kim YS., Jang HJ., Kim SY., Kim M., Kim YK., Nahm BH., Kim JK (2005), “Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic rice increaseed tolerance to abiotic stress without stunting growth”, Plant Physiol, 138, pp 341-351 46 Ooka H, Satoh K, Doi K, Nagata T, Otoma Y, Murakami K, Matsubasa K, Osata N, Kawai J, Carninci P, et al (2003) Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Aravidopsis thaliana DNA Res 20: 239247 47 Peleman J, Boerjan W, Engler G, Seurinck J, Botterman J, et al (1999), “Strong cellular preference in the expression of a housekeeping gene of Arabidopsis thaliana encoding S-adenosylmethionine synthetase”, Plant Cell 1, pp 81–93 48 Pellegrineschi A., Reynolds M., Pacheco M., Brito RM., Ameraya R., Yamaguchi-Shinozaki K., and Hoisington D (2004), “Stress-induced expression in wheat of the Arabidopsis thailiana DREB1A gene delays water stress symptoms under greenhouse conditions”, Genome, 47, pp 493-500 49 Perl-Treves R, Galun E (2001), “The tomato Cu, Zn superoxide dismutase genes are developmentally regulated and respond to light and stress”, Plant Mol Biol , 17, pp.745–60 Page 72 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 50 Pham, X H and Tuteja, N (2002), “Potent inhibition of DNA unwinding and ATPase activities of pea DNA helicase 45 by DNA-binding agents”, Biochem Biophys Res Commun, 294, pp 334-339 51 Pham, X H., Reddy, M K., Ehtesham, N Z., Matta, B and Tuteja, N (2000), “A DNA helicase from Pisum sativum is homologous to initiation factor and stimulates topoisomerase I activities”, Plant Journal, 24(2), pp 219-229 52 Qin F, Kakimoto M, Sakuma Y, Maruyama K, Osakabe Y, Tran LS, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2007), “Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L” Plant Journal, 50(1), pp 54-69 53 Qin F., Sakuma Y., Li J., Liu Q., Li YQ., Shinozaki K and YamaguchiShinozaki K (2004), “Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in cold-responsive gene expression in zea mays L”, Plant Cell Physiol 45, pp 1042-1052 54 Rajendrakumar P, Sujatha K, Rao S, Natarajkumar P, Viraktamath B C, Balachandran S M, Biswal A K and Sundaram R M (2007), “A protocol for isolation of DNA suitable for rapid seed and grain purity assessments in rice”, National BioResource Project: Oryzabase, vol23: b25 55 Sakuma Y, Maruyama K., Okasabe Y., Qin F., Seki M., Shinozaki K and Yamaguchi-Shinozaki K (2006a), “Function analysis of an Arabidopsis transcription factor DREB2A involved in drought-responsive gene expression” The Plant Cell, 18, pp 1292-1309 56 Sakuma, Y., Maruyama, K., Qin, F., Osakabe, Y., Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K (2006b), “Dual function of an Arabidopsis transcription factor DREB2A in water-stress-responsive and heat-stressresponsive gene expression”, Proc Natl Acad Sci USA, 103, pp 18822 – 18827 Page 73 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 57 Sambrook, J., Fritsch, E F and Maniatis, T (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 58 Sgherri CLM, Pinzino C, Navari-Izzo F (2003), “Chemical changes and O2 production in thylakoid membranes under water stress”, Physiol Plant , 87, pp.211–16 59 Shinozaki K and Yamaguchi-Shinozaki K (2007), “Gene networks involved in drought stress response and tolerance” Journal of Experimental Botany, Vol.58, No.2, pp.221-227 60 Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K and Seki M (2003), “Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress reaponses” Curr Opin Plant Biol, 6, pp 410-417 61 Shinha K., Khanna-Chopra R., Aggarwal K., Chanturvedi G.S., Koundal K.R (1982), “Effects of drought on shoot growth Significance of metabolism to growth and yeild”, In Drought Resistance in Crops IRRI, Los Banos, Laguna Philippines 62 Souer E, von Houwelingen A, Kloos J, Mol J, Koes R (1996) The no apical meristem gene of petunica is requires for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries Cell 85: 159-170 63 Tuberosa R.M., Sanguineti C., Landi P (1994), “Abscisic acid concentration in left and xylem sap, left water potential and stomatal conductance in rice”, Crop Sci 34, pp 1557-1563 64 Thomashow MF (1999), “Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms”, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 50, pp 571-599 Page 74 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 65 Tran LS, Makashima K, Sakuma Y, Simpson SD, Fujita Y, Maruyama K, Fujita M, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-shinozaki, K (2004) Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehy-dration stress promoter Plant Cell 16: 2481-2498 66 Umezawa T, Fujita M, Fujita Y, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K (2006), “Engineering drought tolerance in plants: Discovering and tailoring genes unlock the future”, Current Opinion in Biotechnology, 17, pp 113122 67 Uno Y., Furihata T, Abe H., Yoshida R., Shinozaki K and YamaguchiShinozaki (2000), “Arabidopsis basic leucine zipper transcription factors involved in an abscisic acid dependent signal transduction pathway under drought and high salinity condition”, Proceeding of the national Academy of Sciences USA, 97, pp 11632-11637 68 Velasco R, Salamini F, Bartels D (2004), “Dehydration and ABA increase mRNAlevels and enzyme activity of cytosolic GAPDH in the resurrection plant Craterostigma plantagineum”, Plant Mol Biol, 26, pp 541–46 69 White DA, Zilinskas BA (2001), “Nucleotide sequence of a complementary DNA encoding pea cytosolic copper/zinc superoxide dismutase”, Plant Physiol , 96, pp.1391–92 70 Williams J, Bulman M, Huttly A, Phillips A, Neill S (2004), “Characterization of a cDNAfrom Arabidopsis thaliana encoding a potential thiol protease whose expression is induced independently by wilting and abscisic acid”, Plant Mol Biol , 25, pp 259–70 71 Xiong L and Yang Y (2003), “Disease resistance and abiotic stress tolerance in rice are inversely modulated by an abscisic acid-inducible mitogen-activated protein kinase” Plant cell, 15(3): 745-59 Page 75 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 72 Yamaguchi- Shinozaki K, Koizumi M, Urao S, Shinozaki K (2002), “Molecular cloning and characterization of cDNAs for genes that are responsive to desiccation in Arabidopsis thaliana: sequence analysis of one cDNA clone that encodes a putative transmembrane channel protein”, Plant Cell Physiol, 33(3), pp 217–24 73 Yamaguchi-Shinozaki K and Shinozaki K (1994), “A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low-temperature, or high-salt stress”, Plant Cell, Vol.6, 251-264 74 Yamaguchi-Shinozaki K and Shinozaki K (2005), “Organization of cisacting regulatory elements in osmotic - and cold - stress - responsive promoters Trends in Plant Sciences” Vol.10 No.2: 88-94 75 Yoshida R, Hobo T, Ichimura K, Mizoguchi T, Takahashi F, Alonso J, Ecker JR, Shinozaki K (2002), “ABA-activated SnRK2 protein kinase is required for dehydration stress signaling in Arabidopsis”, Plant cell physiology, 43, pp 1473-1483 76 Zhang JZ, Creelman RA, Zhu JK (2004), “From laboratory to field Using information from Arabidopsis to engineer salt, cold and drought tolerance in crops”, Plant physiology, 135, pp 615- 621 77 Zheng X, Chen B, Lu G, Han B (2009), “Overxpression of a NAC transcription factor enhance rice drought and salt tolerance“ Biochemical and Biophysical Research Communication, 379, pp 985-989 TRANG WEB 78 http://www.nea.gov.vn 79 http://www.undp.org 80 http://agriviet.com] Page 76 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 81 http://www.tin247.com 82 http://dantri.com.vn 83 http://www.clrri.org Page 77 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung Page 78 [...]... khai các thí nghiệm phân lập các gen mã hóa các nhân tố phiên mã điều khiển chịu hạn, thiết kế các vector chuyển gen và nghiên cứu biểu hiện của các yếu tố phiên mã trên cây mô hình lúa chuyển gen Tập đoàn giống lúa Việt nam gồm 59 giống đã được khảo sát khả năng hình thành callus, tái sinh và tiếp nhận gen lạ Các gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển chịu hạn: OsNAC1, OsNAC6, đã được phân lập và đang... CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ĐIỀU KHIỂN CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Dòng chảy di truyền từ ADN đến protein trải qua quá trình rất quan trọng là quá trình phiên mã Các nhân tố phiên mã bám vào trình tự ADN đặc hiệu trên vùng khởi động gen của các gen đích và điều hòa biểu hiện các gen này Page 16 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung Hình 3 Mô hình quá trình phiên mã Nhóm gen mã hóa các nhân tố phiên. .. trình phiên mã biểu hiện trong cây chuyển gen đã hoạt hoá sự biểu hiện của một số gen chức năng sinh ra trong điều kiện hạn [65] Từ nghiên cứu về khả năng điều khiển tính chịu hạn của nhóm gen NAC trên Arabidopsis, nhóm nghiên cứu của Lizhong Xiong ( Trung tâm Quốc gia Page 19 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung về nghiên cứu gen thực vật Trung Quốc) đã phân lập gen OsNAC1 và chuyển vào lúa Cây lúa. .. chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium được sử dụng rộng rãi và hiệu quả do: - Số bản sao của gen được chuyển vào tế bào thực vật thấp Do vây, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao - Tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm - Kỹ thuật đơn giản dễ thực hiện 1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHUYỂN CÁC NHÂN TỐ PHIÊN... phiên mã chiếm khoảng 8 - 10 % trong mỗi hệ gen và đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động của sự sống như quá trình sinh trưởng, phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường Ở lúa, hơn 2600 gen mã hóa nhân tố phiên mã đã được phân lập và phân chia thành các nhóm, họ và siêu họ dựa theo trình tự nucleotide và chức năng Rất nhiều gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn đã được nghiên cứu. .. nghiệm khả năng biểu hiện trên các giống lúa Việt Nam Page 32 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Page 33 Luân văn tốt nghiệp Nguyễn Thị Phương Dung 2.1.1 GIỐNG LÚA Hạt của giống lúa Pusa Basmati do trung tâm kỹ thuật gen và công nghệ sinh học quốc tế (ICGEB) Ấn Độ cung cấp Basmati là giống lúa dạng hạt dài được trồng phổ biến... PB3 và RH-10 Giống lúa Pusa Basmati- 1(PB1) đã được các nhà khoa học tại Viện Nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ, New Delhi đưa vào nghiên cứu và chứng minh khả năng nhận gen tốt và trở thành giống mô hình của Ấn độ trong lĩnh vực chuyển gen thực vật Đây cũng là giống lúa có đặc tính di truyền tốt (hạt gạo dài, thơm, chứa kiềm) và cây dạng hơi thấp lùn PB1 có năng suất cây trồng cao hơn so với các giống truyền... Ti-plasmid có khả năng chuyển một số gen chúng mang vào cây trồng được coi là hiện tượng chuyển gen tự nhiên Khi các nhà nghiên cứu thành công trong việc sử dụng đoạn T-ADN của Ti-plasmid để đưa gen thâm nhập vào hệ gen của tế bào thực vật thì việc chuyển gen thông qua Agrobacterium trở thành công cụ rất hữu hiệu trong công nghệ gen thực vật Sự khám phá này đã mở ra một hướng chuyển gen mới vào thực vật Agrobacterium... thuốc lá chuyển gen sinh trưởng, kết hạt và cho năng suất bình thường trong điều kiện mặn liên tục [51, 50] Gen pdh45 cũng đã được chuyển vào lúa và kết quả là các cây lúa chuyển gen có tính chịu mặn cao và hiện tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử thực vật - Trung tâm kỹ thuật gen và Công nghệ Sinh học Quốc tế đang thử tính chịu hạn với các cây lúa chuyển gen pdh45 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO THỰC... Sinh học cũng đã nghiên cứu phân lập gen và chọn dòng lúa chống chịu lạnh, nhân bản và phân tích các đoạn ADN pBC442 và pBC591 ở một số giống và dòng lúa có tính chịu lạnh khác nhau Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học - Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đang thiết kế vector chuyển gen nhằm loại bỏ gen kháng sinh trong cây chuyển gen và đang tiến hành chuyển gen DREB1D/CBF4, DREB2A và TPS1 vào đậu tương