ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI HỌC TỰ học NHIÊN CơngTRƯỜNG trình ĐẠI hồnHỌC thànhKHOA Đại học Khoa Tự nhiên Người hướng dẫn khoa học: TS PHAN THỊ TUYẾT MAI NGUYỄN THỊ ÁNH TUYẾT TS BÙI XUÂN THÀNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHỔ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH KẾT HƠP VỚI Phản biện 1: PGS.TS NGUYỄN TRUNG THUẬT TOÁN HỒI QUY ĐAXUÂN BIẾN ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG MỘTDUY SỐ HOẠT Phản biện THỜI 2: TS ĐÀO TIÊN CHẤT CÓ TRONG THUỐC KHÁNG SINH THUỘC HỌ β –LACTAM Luận văn Chuyên bảo vệ trước :Hội ngành Hốđồng Phânchấm Tíchluận văn thạc sĩ họp tại: Phịng mơn Hóa phân tích Mã số : 60440118 Vào hồi 13 30 ngày 30 tháng 09 năm 2015 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2015 MỞ ĐẦU Hiện hoạt động sản xuất bn bán kháng sinh nói riêng tân dược nói chung đem đến nguồn lợi nhuận khổng lồ khiến số tổ chức, cá nhân tung thị trường hàng triệu viên thuốc giả ngày Thuốc giả khơng đánh lừa người tiêu dùng, cịn vơ hiệu hóa liệu pháp điều trị để cứu sống bệnh nhân nhiều trường hợp thuốc giả gây tác hại to lớn gây phản ứng dị ứng, nhiễm độc kim loại nặng làm bệnh nhân dễ kháng thuốc Đại diện tổ chức Y Tế Thế giới cảnh báo thuốc giả chiếm 7-15% tổng số thuốc nước phát triển, 25% nước phát triển, nước khu vực Châu Á chiếm 50% Các mẫu thuốc giả thường phát chủ yếu loại kháng sinh Ampicillin, Penicillin…Điều khiến nhiều người quan tâm tỉ lệ thuốc giả Việt Nam ngày gia tăng diễn biến trở nên phức tạp dẫn đến cơng tác kiểm tra khó khăn Vì vậy, vấn đề kiểm định thuốc hoạt chất, hàm lượng hoạt chất thuốc vấn đề cấp thiết Hiện có nhiều phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh hiệu cao phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ( HPLC), huỳnh quang tia X, phương pháp quang học hay phương pháp điện hóa để phân tích kháng sinh qui định dược điển Xuất phát từ thực tế này, lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phổ hồng ngoại gần trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng đồng thời số hoạt chất có thuốc kháng sinh thuộc họ β-Lactam” Với mục tiêu nghiên cứu quy trình phân tích nhóm β-Lactam phương pháp phổ hồng ngoại gần với kĩ thuật hồi qui đa biến để kiểm định nhanh chất lượng lượng thuốc thị trường CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nhóm kháng sinh β-lactam 1.1.1.Khái niệm phân loạinhóm β-lactam Nhóm β-lactam họ kháng sinh lớn, bao gồm kháng sinh có cấu trúc hóa học chứa vòng β-lactam Cáckháng sinh β-lactam chia thành nhóm, có hai nhóm sử dụng phổ biến nhóm penicillin cephalosporin 1.1.1.1 Nhóm penicillin Kháng sinh thuộc họ penicillin có cấu trúc mạch vòng beta- lactam (amin nội vòng) gắn với mạch ngang R-CO-NH, gọi amin 6-Amino penicillanie (A.6.A.P) có cơng thức chung R – C9H11N2O4S 1.1.1.2.Nhóm cephalosporin Cấu trúc hóa học kháng sinh nhóm cephalosporin dẫn xuất Axit 7-aminocephalosporanic (viết tắt A7AC) Cấu trúc chung gồm vòng β- lactam cạnh gắn với dị vòng cạnh Khi thay đổi gốc R 1, R2 cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn dược động học khác 1.1.1.3.Các kháng sinh β-lactam khác Gồm nhóm Carbapenem nhóm Monobactam 1.1.2 Tính chất vật lý hóa học kháng sinh nhóm βLactam 1.2 Các phương pháp phân tích định lượng nhóm kháng sinh β-lactam 1.2.1 Phương pháp đo quang 1.2.2 Các phương pháp sắc ký 1.2.3 Phương pháp phổ hồng ngoại 1.2.3.1.Nguyên tắc phương pháp phổ hồng ngoại FTIR Vùng hồng ngoại gần (NIR) Vùng hồng ngoại trung : Vùng hồng ngoại xa 1.2.3.2 Cách chuẩn bị mẫu đo hồng ngoại • Mẫu thể rắn • Mẫu dạng màng lỏng • Mẫu dung dịch • Mẫu thể 1.2.3.2 Ứng dụng phương pháp phổ dao động * Định tính chất • Xác định độ tinh khiết sản phẩm • Phân tích định lượng 1.3.Ứng dụng phương pháp phổ hồng ngoại để xác định nhóm kháng sinh β- Lactam 1.3.1 Kỹ thuật đo hồng ngoại định lượng hoạt chất thuốc 1.3.2 Các ứng dụng phổ hồng ngoại kết hợp với Chemometric để định lượng thuốc kháng sinh β – lactam CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM • • 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Chất phân tích Penicillin V (phenoxymethyl penicillin) Công thức phân tử: C6H18N2O5S; Tên quốc tế, tên khoa học: axit (2S, 5R, R) 3,3 dimethyl – 7- oxo – ( phenoxyacetamido] 4-thia – 1- azabicyclo [3,2,0] heptan – carboxylic Cephalexin Công thức phân tử: C16H17N3O4S.H2O; Tên quốc tế, tên khoa học: axit (α amino αphenylacetamido) methylcephem – 4- carboxylic monohyrat 2.1.2 Mẫu phân tích Mẫu 1: Hoạt chất Penicillin V: Tên thuốc: PEN-VEE-K; VEETIDS… Dạng dùng: Viên nén 125mg, 250mg, 500mg… Dung dịch uống: 125mg/5ml, 250mg/5ml Thành phần hoạt chất: Phenoxymethylpenicilin Kali Tá dược thường dung: Amidon, bột talc, magnesistearat, tinh bột Mẫu 2: Hoạt chất Cephalexin: Tên thuốc: Cephalexin Dạng dùng : Nang viên nén 250 mg, 500 mg; viên nén g Nhũ dịch 125 mg, 250 mg/5 ml (sau pha thêm nước cho chế phẩm) Siro 250 mg, 500 mg/5 ml (sau pha thêm nước cho chế phẩm) Thuốc giọt dùng cho trẻ em 125 mg/1,25 ml (sau pha thêm nước cho chế phẩm) • - - - - Thành phần: Cephalexin monohydrate Tá dược: Tinh bột mì,lactoza,Magie stearate 2.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 2.2.1 Hóa chất Tên chất chuẩn Chất chuẩn Penicillin V Kali C 6H18N2O5S có hàm lượng nguyên trạng 98,6% Chất chuẩn Cephalexin monohydrat C 16H17N3O4S có hàm lượng nguyên trạng 94,33% KBr dùng cho hồng ngoại (Merck) Tinh bột sắn (Nhà máy sản xuất tinh bột mì Quảng Ngãi), đạt tiêu chuẩn kiểm tra theo DĐVN Magie stearat : Mã sản phẩm: dp004; quy cách: 20kg/bao Nước sản xuất: PETER GREVEN – MALAI, hàm lượng: 6.8 8.3% Bột Talc (Công ty cổ phần hóa dược Việt Nam), đạt tiêu chuẩn kiểm tra theo DĐVN Hóa chất tinh khiết phân tích: Axit Acetic, NaOH, Acetonitril, triethylamin, Metanol (Merck) 2.2.2 Dụng cụ trang thiết bị đo Cân phân tích Sartorious độ xác ± 0,0001g Máy quang phổ hồng ngoại Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR spectrometer, dải bước sóng đo vùng 75002800 cm-1 Bộ dụng cụ ép viên: Agilent Technologies standard sampling kit (part no: Pike- 162- 1000) - Cối chày mã não: Được dùng để chuẩn bị viên KBr cho phương pháp khuếch tán phản xạ Cối sứ có kích thước D106xH74 mm Thư viện phổ chuẩn: ST- Japan spectral libraries (part no: K8159-1000) Phần mềm Matlab 12: Chương trình hồi qui đa biến tuyến tính PLS, CLS, ILS PCR để phân tích đồng thời chất hỗn hợp 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.4 Phương pháp định lượng phổ hồng ngoại gần 2.4.1 Nguyên tắc phương pháp phân tích 2.4.2 Nội dung phương pháp 2.4.3 Quy trình phân tích 2.5 Phương pháp phân tích đối chứng Penicillin Cephalexin 2.6 Chương trình máy tínhcủa phương pháp phổ hồng ngoại gần kết hợp với thuật tốn hồi qui cấu tử ( PCR) CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THỰC NGHIỆM 3.1 Khảo sát điều kiện đo phổ hồng ngoại xác định đồng thời Penicillin Cephalexin hỗn hợp 3.1.1 Khảo sát phổ hấp thụ hoạt chất penicillin cephalexin 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng tá dược 3.1.3 Khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr Bảng 3.4.Kết ảnh hưởng tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr đến độ hấp thụ quang số sóng đặc trưng Tỷ lệ mẫu/KB r (w/w) ν (cm-1) 1/99 2/98 3/97 4/96 6/94 8/92 2979 0,816 0,982 1,131 1,875 2,117 2,226 2989 0,816 0,983 1,136 1,880 2,123 2,532 2998 0,817 0,901 1,155 1,900 2,154 2,453 3008 0,818 0,923 1,175 1,932 2,185 2,765 0,819 0,933 1,185 1,952 2,198 3.1.4 Khảo sát độ lặp lại trình ép viên 2,448 3018 Tiến hành đo phổ hồng ngoại mẫu viên Cephalexin với tỷ lệ 3/97 vùng phổ 4000 – 2800cm-1 ν (cm-1) 2856 2425 3062 3370 3449 Giá trị TB(Stb) 0,527 1,945 0,362 14,28 0,445 % RSD 2,95 5,43 7,00 5,03 9,10 2979 2998 3001 3018 3027 0,870 0,825 0,807 0,800 6,14 7,32 6,89 6,49 Diện tích píc ν (cm-1) Độ hấp thụ Giá trị TB(Atb) 0,894 %RSD 6,08 3.2 Xây dựng mơ hình hồi qui đa biến tuyến tính phân tích hoạt chất Penicillin 3.2.1 Mơ hình đường chuẩn đa biến xác định hoạt chất Penicillin có chứa tá dược Tiến hành mơ hình hồi quy đa biến để xác định hỗn hợp gồm Peniciilin tá dược thực dựa ma trận chuẩn (23x2) ma trận kiểm tra (12x2), mẫu chuẩn có 10 0,0265 0,0250 0,0068 0,0425 0,0493 0,0269 0,0269 0,0065 0,0400 0,0465 0,0277 0,0258 0,0065 0,0400 0,0465 10 0,0281 0,0266 0,0063 0,0390 0,0453 11 0,0294 0,0275 0,0060 0,0370 0,0430 12 0,0310 0,0287 0,0056 0,035 0,0406 13 0,0322 0,0316 0,0051 0,0310 0,0361 14 0,0331 0,0305 0,0051 0,0313 0,0364 15 0,0312 0,0322 0,0005 0,0306 0,0356 16 0,0328 0,0323 0,0049 0,0300 0,0349 17 0,0337 0,0326 0,0047 0,0289 0,0336 18 0,0345 0,0336 0,0045 0,0279 0,0324 19 0,0352 0,0338 0,0043 0,0267 0,0310 20 0,0358 0,0343 0,0042 0,0260 0,0302 21 0,0367 0,0355 0,0039 0,0240 0,0279 22 0,0372 0,0352 0,0038 0,0240 0,0278 23 0,0385 0,0365 0,0035 0,0215 0,0250 24 0,0381 0,0375 0,0034 0,0201 0,0235 25 0,0377 0,0387 0,0033 0,0202 0,0235 3.4.2 Đánh giá tính phù hợp mơ hình hồi qui PCR xác định đồng thời hoạt chất Penicillin Cephalexin có chứa tá dược Bảng 3.13 Ma trận kiểm tra hàm lượng cấu tử PEN,CEP tá dược để đánh giá tính phù hợp mơ hình hồi qui Tá dược Mẫu Penicillin Cephalexin Tinh Magie Ʃ Tá (g) (g) bột (g) stearat dược (g) (g) 0,0243 0,0252 0,0071 0,0431 0,0502 0,0177 0,0192 0,0072 0,0425 0,0497 18 0,0217 0,0222 0,0058 0,0346 0,0405 0,0245 0,0250 0,0057 0,0356 0,0413 0,0247 0,0244 0,0048 0,0306 0,0354 0,0298 0,0269 0,0060 0,0372 0,0433 0,0282 0,0285 0,0060 0,0372 0,0432 0,0299 0,0307 0,0055 0,0338 0,0393 0,0304 0,0327 0,0052 0,0320 0,0371 10 0,0287 0,0286 0,0039 0,0242 0,0281 11 0,0350 0,0348 0,0048 0,0250 0,0298 12 0,0284 0,0273 0,0034 0,0210 0,0244 13 0,0295 0,0299 0,0031 0,0192 0,0223 14 0,0302 0,0309 0,0035 0,0221 0,0256 15 0,0393 0,0379 0,0032 0,0196 0,0228 Bảng 3.14.Hàm lượng (% )sai số tương đối xđ đồng thời CEP,PEN tá dược phương pháp PCR Mẫ u Hàm lượng tìm thấy(g) Penicilli Cephalexi Ʃ Tá n n dược 0.052 0.0265 0.0275 0.051 -9,1 -9,2 -4,9 0.0189 0.0201 0.042 -7,2 -4,9 -3,6 0.0225 0.0233 0.042 -4,0 -5,0 -5,4 0.0249 0.0252 0.0257 0.0258 0.036 -1,9 -2,2 -2,9 -6,1 -2,4 -2,8 Sai số tương đối (%) Penicilli Cephalexi Ʃ Tá n n dược 19 0.040 0.0274 0.0278 0.041 7,9 -3,6 6,5 0.0296 0.0297 0.035 -5,2 -4,3 4,5 0.0290 0.0291 0.033 2,9 5,2 10,6 0.0293 0.0294 0.029 3,5 10,0 11,1 0.0301 0.0295 0.030 -5,2 -3,3 -4,3 0.0339 0.0323 0.024 3,1 6,9 -2,5 0.0298 0.0289 0.023 -5,2 -6,1 -1,9 0.0313 0.0307 0.026 -6,2 -2,8 -3,5 0.0323 0.0307 0.022 -7,2 0,3 -1,4 0.0392 0.0370 0,2 2,2 3,2 10 11 12 13 14 15 20 3.4.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng phép đo (LOQ) xác định đồng thời Penicillin, cephalexin tá dược phương pháp PCR Bảng 3.15.Giá trị LOD, LOQ xác định đồng thời cấu tử PEN, CEP tá dược phương pháp PCR Chất phân tích LOD (mg/viên) LOQ (mg/viên) Penicillin 0,42 1,30 Cephalexin 0,13 0,44 Tá dược 0,19 0,62 3.4.4.Định tính mẫu thực tế 3.4.5 Định lượng mẫu thực tế 3.4.5.1 Xử lý mẫu sơ Bảng 3.16 Thông tin mẫu thuốc thực tế Kí hiệu Tên thuốc C1 Cephalex in C2 C3 Cephalex in MKP Nhà sản xuất Hoạtchất – Hàm lượng Tu ổi thọ Số đăng ký Công ty cổ phần xuất nhập y tế DOMESC O Cơng ty cổ phần hóa dược Mekohar Cephalexin 500mg viên nang 24 thá ng VD7067 - 09 Cephalexin 500mg viên nang 36 thá ng VD – 2143 - 14 Công ty cổ Cephalexin 24 VD- 21 Ospexin phần Dược phẩm IMEXPHA RM VIỆT NAM 500mg viên nang thá ng 143806 P1 Ospen 1000 Sandoz GmbH 1000000UI Phenoxymeth ylpenicillin 48 thá ng VD – 2021 - 07 P2 Penicillin V Kali Công ty dược TƯ VIDIPHA Penicillin 1000000UI 36 thá ng VD – 2047 - 14 P3 Penicillin V Kali 1000000 UI Công ty CP Dược VTX Thanh Hóa 1000,000UI 24 thá ng 1248 6– 10 3.4.5.2 Phân tích mẫu Bảng 3.17.khối lượng mẫu bột thực tế cephalexin tá dược thêm vàohỗn hợp Khối STT Số lần đo mbột viên mTá dược (mg) lượng (mg) Tá dược trung HL mẫu thêm vào bình bột thực viên(mg tế ) 573,8 Lần Lần Lần 22 32,2 35,9 42,7 74,5 68,5 66,3 561,1 569,7 Lần Lần Lần Lần Lần Lần 45,6 49,1 50,3 55,4 48,7 57,1 63,7 62,8 67,4 62,1 65,8 60,1 Bảng 3.18 Khối lượng mẫu bột thực tế penicillin tá dược thêm vào hỗn hợp ST T Khối lượng trung bình viên(mg) 715,2 723,3 718,5 m bột viên (mg) HL mẫu bột thực tế mTá dược (mg) Tá dược thêm vào Lần 61,5 38,5 Lần 53,4 46,6 Lần 58,7 41,3 Lần 55,9 35,8 Lần 44,7 55,3 Lần 66,8 33,2 Lần 53,6 46,4 Lần 47,9 52,1 Lần 45,6 54,4 Số lần đo 23 Bảng 3.19 Hàm lượng hoạt chất CEP thực tế tìm thấy mẫu thực tế Mẫu C1 C2 C3 Hàm lượng CEP (mg / viên) PP hồng PP đối chứng HL bao ngoại 446, 3± 0,9 478,2 ± 2,1 459,4 ± 2,2 (HPLC) 477,5 ± 0,4 473,9 ± 0,2 468,5 ± 0,5 bì 500 500 500 Bảng 3.20 Hàm lượng hoạt chất PEN thực tế tìm thấy mẫu thực tế Hàm lượng PEN (mg / viên) PP hồng PP đối chứng HL bao Mẫu ngoại (HPLC) bì P1 576,4 ± 1,6 613,1 ± 0,9 625 P2 571,9 ± 1,1 610,0 ± 0,5 625 P3 596,3 ± 2,0 604,3 ± 0,4 625 24 CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN Đã lựa chọn điều kiện tối ưu xác định đồng thời Penicillin Cephalexin hỗn hợp: vùng số sóng khảo sát phổ 4000 – 2800 cm-1 Tỷ lệ khối lượng mẫu/ KBr = 3: 97 Đã xây dựng mơ hình hồi qui đa biến tuyến tính PCR xác định cho hoạt chất PEN,CEP dựa mơ hình chuẩn đánh giá tính phù hợp cho mơ hình Đã tiến hành xây dựng mơ hình hồi qui PCR xác định đồng thời hoạt chất PEN CEP hỗn hợp có mặt tá dược, kết sai số thu từ mơ hình phần lớn có sai số ≤ 10% (có sai số nằm giới hạn cho phép) Do dùng mơ hình để định lượng nhanh mẫu thuốc thực tế Giá trị LOD, LOQ cho xác định đồng thời hoạt chất PEN CEP nhỏ , giá trị LOD,LOQ thu đối PEN: 0,42 1,3 ; CEP: 0,13 0,44 Đã ứng dụng mơ hình hồi qui tuyến tính PCR kết hợp với phương pháp phổ hồng ngoại gần để xác định nhanh mẫu thuốc thực tế lưu hành thị trường Qua phân tích mẫu thực tế cho ta thấy.Từ kết bảng cho thấy độ chệnh phương pháp nghiên cứu hoạt chất Penicilli theo phương pháp phổ hồng ngoại gần so với kết đối chiếu bao bì lần lượt: 7,7%; 8,4%; 4,5% so với phương pháp đối chứng là: 5,9%;6,24%;1,3% , Độ chệch 25 Cephalexin so với phương pháp phổ hồng ngoại gần 10,7%;12,5%;8,7% so với phương pháp đối chứng là: 5,9%; 6,2%; 1,3% 26