ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Nguyễn Hồng Nhung NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội-2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Nguyễn Hồng Nhung NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trịnh Hồng Thái TS Đỗ Minh Hà Hà Nội-2015 LỜI CẢM ƠN Lời em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn kính trọng sâu sắc thầy, PGS TS Trịnh Hồng Thái, người tận tình hướng dẫn em suốt trình học tập thực luận văn Thầy mở cho em vấn đề khoa học lý thú, hướng em vào nghiên cứu lĩnh vực thiết thực vô bổ ích, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Em học hỏi nhiều Thầy phong cách làm việc, phương pháp nghiên cứu khoa học Em xin trân trọng cảm ơn đến TS Đỗ Minh Hà thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy cô giáo môn Sinh lý Thực vật Hóa sinh học tận tình giảng dạy dìu dắt suốt thời gian học tập trường Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị tận tình giúp đỡ bảo suốt trình học tập thực luận văn Phòng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, bạn học viên cao học em sinh viên làm việc phòng, người làm tôi, bên lúc thất bại hay lúc thành công Trong trình thực đề tài, nhận giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi PTNTĐ Công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học KHTN, giúp đỡ cán nhân viên thuộc khoa Tế bào Giải phẫu bệnh, bệnh viện K, Hà Nội việc cung cấp mẫu nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Luận văn thực phạm vi nội dung kinh phí củađề tài cấp nhà nước (mã số KC.04.10/11-15) Tôi xin chân thành cảm ơn Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố, Mẹ người vất vả nuôi khôn lớn dạy học làm người đầu tiên, cảm ơn ông bà, cô chú…những người thân con, người dành tình cảm lời động viên Và cuối xin cảm ơn bạn bè tôi, người ủng hộ giúp đỡ Hà Nội, tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Hồng Nhung DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic APS Ammonium persulfate ARN Acid Ribonucleic ATP Adenosine Triphosphate AcN Acetonitrile Bp Base pair (cặp bazơ) cs cộng EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide HCC Ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma) HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High-performance liquid chromatography) MT/mt Mitochondria (ti thể) mtADN ADN ti thể (mitochondrial DNA) nADN ADN nhân (nuclear DNA) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction) Smac/DIABLO Chất hoạt hóa caspase thứ hai từ ti thể/ chất ức chế trực tiếp protein gắn trình apoptosis điều kiện pI thấp (Second mitochondria-derived activator of caspase/direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI) TEA Triethylamine TEAA Triethylammonium acetate tARN ARN vận chuyển (transfer RNA) rARN ARN ribosome (RNA ribosome) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Các hóa chất sử dụng cho nghiên cứu Bảng Thành phần hóa chất chạy HPLC Bảng Thành phần phản ứng PCR Bảng Thành phần phản ứng PCR thể tích 15 µl Bảng Công thức đổ gel polyacrylamide 10% 7cm Bảng Bảng Bảng Bảng Bảng 10 Bảng 11 Số liệu phân tích HPLC với mẫu có tỉ số hàm lượng ADN chuẩn 400bp/100bp khác Số liệu phân tích HPLC với mẫu có tỉ số lượng mt/ACTB khác Biến đổi tỉ số mt/ACTB loại mẫu bệnh nhân ung thư vú bệnh nhân u xơ vú Biến đổi tỉ số mt/ACTB đặc điểm bệnh học bệnh nhân ung thư vú Biến đổi tỉ số mt/ACTB loại mẫu bệnh nhân ung thư vú bệnh nhân u xơ vú phương pháp ImageJ Biến đổi tỉ số mt/ACTB đặc điểm bệnh học bệnh nhân ung thư vú phân tích phương pháp ImageJ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Phân bố gen ADN ti thể Hình Sơ đồ quy trình thí nghiệm Hình Chương trình chạy HPLC Hình Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mt ACTB Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô vú bệnh nhân Hình ung thư vú (điện di gel agarose 0,8% nhuộm ethidium bromide) Hình Hình Hình Hình Hình 10 Kết phân tích HPLC với ADN chuẩn 100_200bp 200_400bp Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn mt ACTB gel agarose 1,7% Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi chu kì khác gel polyacrylamide 10%, nhuộm bạc Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB 28 chu kì mẫu khác Hình ảnh khuẩn lạc sau plasmid biến nạp vào tế bào E.coli DH5α Hình 11 Hình ảnh điện di sau tách plasmid Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid mt ACTB Hình 13 Kết giải trình tự plasmid có chứa đoạn mt Hình 14 Kết giải trình tự plasmid có chứa đoạn ACTB Hình 15 Hình ảnh phân tích HPLC Biểu đồ đường chuẩn tỉ số hàm lượng ADN chuẩn 400bp/100bp Hình 16 Hình ảnh phân tích HPLC biểu đồ đường chuẩn tỉ số mt/ACTB Hình 17 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB loại mẫu Hình 18 Hình 19 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo nhóm tuổi bệnh nhân ung thư vú Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo kích thước khối u bệnh nhân ung thư vú Hình 20 Hình 21 Hình ảnh gel phân tích phầm mềm ImageJ Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo loại mẫu phân tích phương pháp ImageJ MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ TI THỂ 1.1.1 Cấu trúc chức ti thể 1.1.2 Những biến đổi ti thể bệnh ung thư 1.2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ 11 1.2.1 Phân loại ung thư vú 11 1.2.2 Các giai đoạn ung thư vú 12 1.2.3 Các yếu tố nguy 14 1.3 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ 15 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN TI THỂ 16 Chương - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Hóa chất 19 2.1.3 Dụng cụ 20 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số 19 21 21 2.2.2 Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích định lượng: 22 2.2.3 Định lượng ADN HPLC phần mềm ImageJ 2.2.4 Tính toán thống kê Chương – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔ 26 28 29 29 3.2 THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER CHO PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI 30 3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG SỐ BẢN SAO ADN TI THỂ KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 52 PHỤ LỤC 58 35 MỞ ĐẦU Ti thể bào quan quan trọng tế bào nhân chuẩn có vai trò tạo lượng thông qua hô hấp hiếu khí, nơi hình thành đích đến gốc oxy tự (ROS) tác nhân gây ung thư Mỗi tế bào có nhiều ti thể, tới hàng trăm sao, nhiên số lượng ADN ti thể (mtADN) tương đối ổn định tế bào điều kiện sinh lý Những thay đổi mtADN cấu trúc, hay số lượng mtADN đóng vai trò trực tiếp tác nhân gây ung thư Nhiều nghiên cứu chứng minh thay đổi số lượng mtADN có liên quan đến hình thành tiến triển nhiều loại ung thư ung thư hạch bạch huyết (Non-Hodgkin lymphoma), ung thư phổi, ung thư dày, ung thư thận, ung thư tuyến tụy, ung thư đại trực tràng ung thư vú, Ung thư vú bệnh ung thư phổ biến phụ nữ toàn giới, tỷ lệ mắc ung thư vú tăng lên nhanh chóng, đặc biệt nước Châu Á Việt Nam Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán, tầm soát ung thư giúp phát sớm chụp nhũ ảnh nhiều phương pháp điều trị đại giúp giảm đáng kể tỉ lệ mắc bệnh tử vong ung thư vú, nhiên, ung thư vú loại ung thư gây tử vong hàng đầu nữ giới Phương pháp HPLC phương pháp định lượng kinh điển phân tích hóa sinh học Phương pháp có độ nhạy cao, có khả ứng dụng rộng rãi, cho phép phân tích với lượng mẫu nhỏ Với pháp triển khoa học đại, nhiều phần mềm đời phục vụ mục đích bán định lượng dựa phân tích hình ảnh băng điện di phần mềm ImageJ – NIH US, phương pháp đơn giản, tốn kém, tiện dụng, cho kết nhanh áp dụng rộng rãi Trên sở đó, ứng dụng phương pháp HPLC phân tích hình ảnh phần mềm ImageJ để thực đề tài “Nghiên cứu biến đổi số lượng ADN ti thể bệnh nhân ung thư vú” Đề tài thực phòng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Kinh phí thực từ đề tài cấp nhà 21) Ở bệnh nhân u xơ vú, số lượng mtADN mẫu mô u có xu hướng giảm so với máu, nhiên sai khác ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Giữa mẫu mô u ung thư mẫu mô u xơ, số lượng mtADN sai khác rõ rệt với giá trị trung bình tỉ số mt/ACTB tương đương (p > 0,05) Ở bệnh nhân ung thư vú, mẫu mô u có xu hướng số lượng mtADN giảm so với mẫu lân cận u, nhiên, sai khác ý nghĩa thống kê với p[...]... đổi số lượng bản sao ADN ti thể, nhưng ở Việt Nam đây là một hướng nghiên cứu rất mới Cho đến nay, chúng tôi vẫn chưa tìm thấy một công bố chính thức về nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN đối với bệnh ung thư nói chung và ung thư vú nói riêng ở Việt Nam 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN TI THỂ Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN đang là một hướng nghiên cứu chỉ thị ung thư khả quan... có số lượng bản sao mtADN trong máu ngoại vi cao Không có mối liên quan giữa số lượng bản sao mtADN và nguy cơ ung thư vú ở phụ nữ đã cung cấp mẫu máu trên 3 năm trước khi chẩn đoán ung thư vú Nghiên cứu này cho thấy ti m năng giữa số lượng bản sao mtADN và nguy cơ ung thư vú phụ thuộc vào thời gian lấy máu và chẩn đoán ung thư vú [30] Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về biến đổi số lượng. .. sớm ung thư vú [35] Năm 2013, Thyagarajan và cs đã nghiên cứu mối liên quan giữa số lượng bản sao mtADN trong máu ngoại vi và nguy cơ ung thư vú ở 184 bệnh nhân ung thư vú và 529 mẫu đối chứng Số lượng bản sao mtADN được xác định bằng phương pháp PCR định lượng Các phân tích đã cho thấy rằng có mối liên hệ giữa số lượng bản sao mtADN và nguy cơ ung thư vú Nguy cơ cao đối với những bệnh nhân ung thư vú. .. chứa 2-10 bản sao mtADN, tuy nhiên số lượng bản sao mtADN tương đối ổn định trong diều kiện sinh lí Nhiều nghiên cứu ở bệnh nhân ung thư nguyên phát đã chỉ ra rằng thay đổi số lượng bản sao mtADN là một yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của ti thể và có liên 9 quan đến sự hình thành và phát triển ở nhiều loại ung thư Biến đổi số lượng bản sao mtADN liên quan đến bệnh ung thư đã được nghiên cứu rộng rãi... giảm hàm lượng mtADN phổ biến hơn ở các bệnh nhân ung thư dạ dày [33] Một số nghiên cứu khác cho thấy số lượng bản sao mtADN trong mô ung thư cao hơn so với các mô lân cận Năm 2006, Wang và cs cho thấy ở ung thư buồng trứng, số lượng bản sao mtADN thấp ở giai đoạn đầu và cao hơn nhiều giai đoạn sau, cho thấy mối tương quan giữa việc tăng số lượng bản sao mtADN tới ti n triển của bệnh nhân ung thư buồng... khác Số lượng bản sao mtADN giảm được tìm thấy trong nhóm bệnh nhân ung thư trong giai đoạn mãn kinh Không có sự khác biệt về số lượng bản sao mtADN liên quan đến tuổi, số hạch, ER, PR, Her-2 / neu Trong nghiên cứu này, số lượng bản sao mtADN giảm trong máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư vú được gắn liền với giai đoạn I Việc sử dụng mtADN có thể có giá trị chẩn đoán và nghiên cứu sâu hơn, có ti m năng... sinh học của ti thể bất thư ng ở bệnh nhân HCC Đáng chú ý là 22% bệnh nhân HCC mang một đột biến soma trong vùng D-loop của mtADN Vùng gan lành của bệnh nhân HCC có ti n sử uống rượu trong nhiều năm có số lượng bản sao mtADN giảm và mức độ mất đoạn 4977 bp cao hơn so với bệnh nhân không uống rượu Kết quả cho thấy số lượng bản sao mtADN giảm, suy giảm chức năng ti thể và đột biến soma trong mtADN là những... người đã từng ti p xúc với phóng xạ, hay từng trải qua xạ trị, người thừa cân hoặc béo phì, vận động ít, sử dụng rượu thư ng xuyên hay sử dụng nhiều chất béo…cũng góp phần làm tăng nguy cơ ung thư vú 1.3 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ Năm 2007, Yu và cs đã phân tích số lượng bản sao mtADN ở 59 mẫu mô u và mô lân cận u bằng phương pháp PCR định lượng Kết quả cho... bào ung thư, dẫn đến giảm sản xuất ROS nội sinh và giảm ROS gây tổn thư ng ADN để tế bào ung thư trở thành bất tử [15] 1.2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ Ung thư vú là loại ung thư phổ biến thứ hai trên thế giới và là bệnh ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ với ước tính 1,67 triệu trường hợp ung thư mới được chẩn đoán vào năm 2012 (25% của tất cả các trường hợp mắc bệnh ung thư) Nó là loại ung thư phổ biến. .. rãi bằng nhiều phương pháp ti p cận Năm 2004, Yin và cs đã nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN và ti thể ở bệnh nhân ung thư biểu mô gan (HCC) Ở bệnh nhân HCC số lượng bản sao mtADN giảm ở mô u so với mô lành tương ứng Biểu hiện thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator γ coactivator-1 bị ức chế mạnh ở bệnh nhân, trong khi các biểu hiện của các protein liên kết với mtADN sợi đơn lại tăng, cho