ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ XUÂN ĐẠT NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VŨ XUÂN ĐẠT NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS QUYỀN ĐÌNH THI Hà Nội - 2011 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU MỞ ĐẦU Rệp (Aphidoidae) nhóm côn trùng chích hút nhựa phổ biến giới, kí sinh 11000 loài thuộc 243 họ khác nhau, có nhiều trồng quan trọng bông, cải, cải dầu, loại đậu, cà chua, khoai tây, ngũ cốc Hàng năm, rệp với côn trùng khác gây thiệt hại 15% sản lượng trồng toàn giới Do tính chất nguy hại rệp, việc sử dụng biện pháp phòng trừ rệp cần thiết Biện pháp phòng trừ rệp phổ biến sử dụng thuốc diệt côn trùng hóa học Mặc dù có ưu điểm phổ tác dụng rộng hiệu tác dụng nhanh, thuốc hóa học ngày bộc lộ rõ nhược điểm nhanh bị kháng côn trùng sau thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Với ưu điểm vượt trội độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái sức khỏe người, thuốc diệt côn trùng sinh học coi lựa chọn có tiềm lớn xu hướng phát triển nông nghiệp bền vững Lecanicillium chi nấm có khả kí sinh tự nhiên rệp nhiều loài côn trùng khác Từ năm 1960, giới có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium để diệt rệp bảo vệ trồng, nhiều sản phẩm sản xuất thương mại hóa Tuy nhiên, kết đạt nghiên cứu sử dụng thuốc diệt côn trùng sinh học hạn chế Từ lí trên, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt rệp từ nấm Lecanicillium cần thiết Do vậy, thực đề tài: "Nghiên cứu sử dụng nấm Lecanicillium kí sinh côn trùng để kiểm soát rệp hại rau" TỔNG QUAN TÀI LIỆU Rệp hại trồng Rệp nhóm côn trùng chích hút nhựa phổ biến giới, phân bố tập trung vùng ôn đới, rệp phân bố phổ biến vùng nhiệt đới cận nhiệt với độ đa dạng thấp Khoảng 3700 loài rệp biết đến giới, có 250 loài rệp côn trùng phá hoại nguy hiểm nông, lâm nghiệp cần kiểm soát Tuy nhiên, đứng quan điểm động vật học, rệp nhóm động vật thích nghi tốt với môi trường nhờ khả sinh sản vô tính Rệp tác nhân gây hại nhiều loại trồng quan trọng bông, đậu tương, hướng dương, củ cải đường, khoai tây, ngô, ngũ cốc rau cải Nhiều loài rệp có khả kí sinh nhiều loại khác Aphis gossypii, Myzus persicae Aphis craccivora Với nguy làm giảm suất trồng rệp, yêu cầu phải có biện pháp kiểm soát rệp để bảo vệ mùa màng cấp thiết Biện pháp kiểm soát rệp loại côn trùng khác áp dụng chủ yếu nhiều thập kỷ qua sử dụng hóa chất diệt côn trùng tổng hợp Thuốc diệt côn trùng hóa học Thuốc diệt côn trùng (thuốc trừ sâu) chiếm tỉ lệ lớn thuốc bảo vệ thực vật Chúng có nguồn gốc tự nhiên tổng hợp hoàn toàn nhà máy hóa chất, sử dụng nông nghiệp để bảo vệ trồng, phi nông nghiệp để tiêu diệt vectơ truyền bệnh cho người vật nuôi ruồi, muỗi Ưu điểm thuốc diệt côn trùng hóa học dễ sản xuất quy mô lớn với giá thành rẻ, phổ tác dụng rộng với độc lực mạnh hiệu tác dụng nhanh Tuy nhiên, chúng ngày bộc lộ rõ nhược điểm nhanh bị kháng côn trùng, gây ô nhiễm đất, nguồn nước không khí, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Vì nhược điểm thuốc diệt côn trùng hóa học, xu hướng chung giới không sử dụng thuốc diệt côn trùng sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học để thay dần nhằm phát triển nông nghiệp bền vững Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học Mặc dù có số nhược điểm giá thành sản xuất cao, hoạt lực không mạnh hóa chất tổng hợp, hiệu lực tác dụng chậm, hiệu bị ảnh hưởng nhiều điều kiện ngoại cảnh, với ưu điểm vượt trội so với hóa chất tổng hợp độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái sức khỏe người, chế phẩm sinh học ngày nhận nhiều quan tâm nghiên cứu sản xuất để sử dụng nông nghiệp Lecanicillium chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota, lớp Sordariomycetes, Hypocreales, họ Clavicipitaceae Lecanicillium có khả kí sinh tự nhiên giết chết nhiều loại côn trùng rệp, ruồi trắng, cánh đều, cánh cứng, cánh thẳng, bướm Cơ chế diệt côn trùng Lecanicillium dựa tiếp xúc trực tiếp bào tử với côn trùng Sau bám vỏ côn trùng (chitin), bào tử nảy mầm tiết enzyme (chitinase, proteinase) phân hủy lớp biểu bì, kết hợp với áp lực nảy mầm bào tử nấm giúp sợi nấm đâm sâu vào khoang thể Tại đây, sợi nấm tiết enzyme (proteinase, lipase, chitinase) thủy phân mô, tiết độc tố nấm gây độc thần kinh cho côn trùng Kết côn trùng bị tổn thương, bị đa nhiễm Lecanicillium vi sinh vật gây bệnh khác Sau côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển sinh bào tử bên thể côn trùng lây truyền bệnh cho côn trùng khác Mặc dù tiềm kiểm soát côn trùng gây hại trồng nấm Lecanicillium lớn, việc nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium để bảo vệ trồng kết đạt hạn chế, Việt Nam Hiệu diệt côn trùng chế phẩm Lecanicillium chế phẩm sinh học khác kém, khối lượng chế phẩm diệt côn trùng sinh học sử dụng chiếm tỉ trọng thấp tổng khối lượng loại thuốc diệt côn trùng Do vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium cần thiết Sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng Để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng trước tiên phải có bào tử nấm kí sinh côn trùng Việc lựa chọn phương pháp lên men tối ưu điều kiện lên men cần thiết để sản xuất nhiều bào tử với hiệu kinh tế cao Hiện có hai phương pháp lên men phổ biến lên men lỏng lên men rắn Phương pháp lên men rắn có số nhược điểm khó khăn trộn môi trường lên men, môi trường lên men có độ đồng không cao, khó tiếp giống phải tiếp giống theo đợt, việc kiểm soát pH phức tạp, độ ẩm chất liên tục thay đổi trình lên men, khả truyền nhiệt chất Nhưng có nhiều ưu điểm quan trọng yêu cầu thiết bị vận hành đơn giản, tận dụng nguồn chất không tan nước sản phẩm phụ nông nghiệp với chi phí thấp (tinh bột, cellulose, lignin, pectin), bề mặt lên men rộng nên dễ trao đổi nhiệt không khí, không đòi hỏi kiểm soát nghiêm ngặt thông số trình lên men, tiêu thụ nước lượng, nước thải, dễ dàng kiểm soát tạp nhiễm, chi phí đầu tư thiết bị vận hành rẻ Sự sinh bào tử nấm chịu ảnh hưởng chủ yếu yếu tố nguồn carbon, nguồn nitơ, nguồn khoáng, độ ẩm, nhiệt độ, độ thoáng khí số yếu tố khác VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu, hóa chất thiết bị Bảy chủng nấm Lecanicillium L18, L43, L85, 85k, 485, 8514 L1185 Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH CN Việt Nam cung cấp Rệp hại rau lấy rau cải đồng ruộng sau nuôi cải thảo phòng thí nghiệm Các hóa chất sử dụng có độ tinh khiết cao, cung cấp hãng có uy tín Invitrogen, Fermentas… Các thiết bị sử dụng thuộc phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, cung cấp hãng có uy ín thiết bị sinh học Eppendorf, Pharmacia… Phương pháp nghiên cứu Phương pháp sàng lọc sử dụng để lựa chọn chủng nấm có độc lực diệt rệp cải cao Phương pháp sinh học phân tử, xác định so sánh trình tự gen 28S rRNA để xác định tên nấm Phương pháp tối ưu sử dụng để lựa chọn môi trường phù hợp để lên men nấm thu bào tử cao KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao Sau ngày phun, chủng 485 có khả diệt rệp cải cao với 67 ± 7% rệp bị diệt Chủng L18 không diệt rệp, chủng có độc lực yếu 80 70 Đối chứng Tỉ lệ rệp chết (%) 60 L18 50 L43 40 L85 85k 30 485 20 8514 10 41185 L1185 0 Thời gian sau phun (ngày) Độc lực diệt rệp chủng Lecanicillium spp Định tên chủng nấm 485 Chủng 485 định tên phương pháp đọc so sánh trình tự gene 28S rRNA với trình tự chủng công bố GenBank Trình tự gene 28S rRNA chủng 485 có độ tương đồng 99,8% với chủng L lecanii GenBank Từ kết bước đầu kết luận chủng 485 thuộc loài Lecanicillium lecanii EF026004 Lecanicillium fusisporum HM057107 Verticillium sp AY312604 Verticillium sp EF026003 Lecanicillium lecanii EF026005 Lecanicillium lecanii Lecanicillium sp 485 82,7 80 70 60 50 40 30 20 10 Cây phân loại Chủng 485 chủng từ GenBank Ảnh hưởng điều kiện môi trường lên sinh bào tử L lecanii 485 Ảnh hưởng nguồn chất Trong tám môi trường khảo sát, môi trường bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) cho sinh bào tử cao với (5,02 ± 0,26)×109 bào tử/g chất Số lượng bào tử (x10 /g chất) G BG CG BN LG LN MG MN Các nguồn chất Ảnh hưởng nguồn chất lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 G: gạo, BG: bột gạo, CG: cám gạo, BN: bột ngô, LG: bột lõi ngô/bột gạo, LN: bột lõi ngô/bột ngô, MG: bột bã mía/bột gạo, MN: bột bã mía/bột ngô Ảnh hưởng tỉ lệ thành phần chất Môi trường gồm bột lõi ngô/bột ngô sau lựa chọn, ảnh hưởng tỉ lệ hai thành phần lên sinh bào tử chủng nấm L lecanii 485 khảo sát Tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô 1:1 (w/w) cho sinh bào tử cao với (5,37 ± 0,95)×109 bào tử/g chất Số lượng bào tử (x109/g chất) 8:2 7:3 6:4 5:5 4:6 3:7 Tỉ lệ lõi ngô/bột ngô Ảnh hưởng tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô môi trường lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 2:8 Ảnh hưởng độ dày chất Độ dày chất 27,5 mm thích hợp cho sinh bào tử chủng L lecanii 485 với số lượng bào tử đạt (1,032 ± 0,032)×1010 bào tử/g chất Số lượng bào tử (x109/g chất) 12 12 16 20 24 28 32 Độ dày chất (mm) Ảnh hưởng độ dày chất lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Ảnh hưởng độ ẩm chất Khi lượng nước bổ sung 70% chất (tương đương với độ ẩm môi trường chất 41%), chủng L lecanii 485 sinh bào tử cao nhất, đạt (5,43 ± 1,08)×109 bào tử/g chất Số lượng bào tử (x109/g chất) 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Lượng nước bổ sung so với chất khô (%) Ảnh hưởng độ ẩm chất lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Ảnh hưởng nhiệt độ Sự sinh bào tử chủng L lecanii 485 tốt 30°C, đạt (7,88 ± 0,64)×109 bào tử/g chất Số lượng bào tử (x109/g chất) 20 25 30 35 40 Nhiệt độ (oC) Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Ảnh hưởng số nguồn nitơ vô Sự sinh bào tử chủng L lecanii 485 cao với nguồn (NH4)2SO4, số lượng bào tử đạt (1,159 ± 0,050)×1010 Số lượng bào tử (x109/g chất) 14 12 10 KBS NaNO3 NaNO3 KNO3 KNO3 NH 4NO3 NH4NO3 (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 (NH 4)2HPO4 (NH4)2HPO4 Một số nguồn nitơ vô Ảnh hưởng số nguồn nitơ vô lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 KBS: không bổ sung nguồn nitơ vô Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 Sau xác định nguồn nitơ vô phù hợp, ảnh hưởng (NH4)2SO4 nồng độ khác lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 khảo sát Kết nồng độ (NH4)2SO4 tương đương 0,1 mol N/1000g chất cho sinh bào tử cao với (1,071 ± 0,028)×1010 bào tử/g chất Số lượng bào tử (x109/g chất) 12 10 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 Nồng độ (NH4)2SO4 (mol N/1000 g chất) Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Ảnh hưởng nồng độ MgSO4 Ảnh hưởng MgSO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 nồng độ khác khảo sát Kết cho thấy nồng độ MgSO4 tối ưu 0,035% với số lượng bào tử đạt (1,304 ± 0,018)×1010 bào tử/g chất Số lượng bào tử (x109/g chất) 14 13 12 11 10 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 Nồng độ MgSO4 (%) Ảnh hưởng nồng độ MgSO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Ảnh hưởng nồng độ KH2PO4 Sự sinh bào tử chủng L lecanii 485 cao bổ sung KH2PO4 nồng độ 0,1% 0,25%, với số lượng bào tử đạt (1,156 ± 0,043)×1010 (1,159 ± 0,008)×1010 bào tử/g chất Tuy nhiên, với nồng độ KH2PO4 khảo sát, khác biệt sinh bào tử chủng L lecanii 485 môi trường bổ sung không bổ sung KH2PO4 ý nghĩa thống kê 10 Số lượng bào tử (x109/g chất) 13 12 11 10 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 Nồng độ KH2PO4 (%) Ảnh hưởng nồng độ KH2PO4 lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng Trong ba chế độ chiếu sáng khảo sát, chủng L lecanii 485 sinh bào tử cao chế độ chiếu đáng thông thường (12 giờ/ngày) với số lượng bào tử đạt (1,326 ± 0,050)×1010 Số lượng bào tử (x109/g chất) 14 12 10 12 24 Thời gian chiếu sáng (giờ/ngày) Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Ảnh hưởng thời gian lên men Sau ngày lên men, số lượng bào tử nấm L lecanii 485 đạt tối đa với (1,353 ± 0,019)×1010 bào tử/g chất 11 Số lượng bào tử (x109/g chất) 15 14 13 12 11 10 10 12 14 Thời gian lên men (ngày) Ảnh hưởng thời gian lên men lên sinh bào tử chủng L lecanii 485 Như vậy, sau lên men chủng nấm L lecanii 485 với điều kiện tối ưu, cụ thể: ngày lên men 30°C, chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày với chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) có độ dày 27,5 mm (tương đương 22g chất/bình lên men 250 ml), bổ sung lượng nước bổ sung 70% chất (tương đương độ ẩm môi trường chất 41%), nồng độ (NH4)2SO4 tương đương 0,1 mol N/1000 g chất, MgSO4 0,035% chất, KH2PO4 0,1% chất, đạt số lượng (1,353 ± 0,019)×1010 bào tử/g chất KẾT LUẬN Chủng 485 có độc lực cao rệp cải số chủng nấm nghiên cứu Trong điều kiện 21-25°C độ ẩm không khí 75-80%, dung dịch bào tử chủng 485 có mật độ 3×108/ml Tween 80 nồng độ 0,05% sau ngày phun lên rệp cải diệt 67% rệp Chủng 485 thuộc loài Lecanicillium lecanii theo phân tích so sánh trình tự gene 28S rRNA Điều kiện cho sinh bào tử tối đa chủng L lecanii 485 môi trường rắn là: lên men ngày 30°C, chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày với chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) có độ dày 27,5 mm, độ ẩm môi trường chất 41%, nồng độ (NH4)2SO4 tương đương 0,1 mol N/1000 g chất, MgSO4 0,035% chất, KH2PO4 0,1% chất Chủng L lecanii 485 lên men điều kiện tối ưu, đạt số lượng bào tử (1,353 ± 0,019)×1010/g chất 12 [...]... 485 có độc lực cao nhất đối với rệp cải trong số 7 chủng nấm được nghiên cứu Trong điều kiện 21-25°C và độ ẩm không khí 75-80%, dung dịch bào tử của chủng 485 có mật độ 3×108/ml trong Tween 80 nồng độ 0,05% sau 7 ngày được phun lên rệp cải đã diệt được 67% rệp 2 Chủng 485 thuộc loài Lecanicillium lecanii theo phân tích và so sánh trình tự gene 28S rRNA 3 Điều kiện cho sự sinh bào tử tối đa của chủng L... của thời gian lên men Sau 8 ngày lên men, số lượng bào tử của nấm L lecanii 485 đạt được tối đa với (1,353 ± 0,019)×1010 bào tử/g cơ chất 11 Số lượng bào tử (x109/g cơ chất) 15 14 13 12 11 10 9 4 6 8 10 12 14 Thời gian lên men (ngày) Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sự sinh bào tử của chủng L lecanii 485 Như vậy, sau khi lên men chủng nấm L lecanii 485 với các điều kiện tối ưu, cụ thể: 8 ngày lên... lên sự sinh bào tử của chủng L lecanii 485 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng Trong ba chế độ chiếu sáng đã được khảo sát, chủng L lecanii 485 sinh bào tử cao nhất ở chế độ chiếu đáng thông thường (12 giờ/ngày) với số lượng bào tử đạt được lần lượt là (1,326 ± 0,050)×1010 Số lượng bào tử (x109/g cơ chất) 14 12 10 8 0 12 24 Thời gian chiếu sáng (giờ/ngày) Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sự sinh