TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA – VŨNG TÀU KHOA HÓA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  ĐỀ TÀI KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CAO ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH Ủ PHÂN HỮU CƠ TỪ VỎ TRÁI CA CAO Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Tới GVHD: ThS Trần Thị Duyên ThS Phạm Thị Hữu Hạnh BÀ RỊA – VŨNG TÀU, 7/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU KHOA HÓA HỌC VÀ CNTP Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Tới GVHD: ThS Trần Thị Duyên ThS Phạm Thị Hữu Hạnh Xác nhận chỉnh sửa theo ý kiến hội đồng Cán phản biện Cán phản biện BÀ RỊA-VŨNG TÀU - 7/2013 Chủ tịch Hội đồng Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài nghiên cứu xin chân thành cảm ơn: - Ban giám hiệu nhà trường, Trịnh Văn Thành Giám đốc Cty TNHH Ca Cao Thành Đạt, PGS TS Nguyễn Văn Thông Trưởng Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm, quan tâm tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành đề tài - ThS Trần Thị Duyên, ThS Phạm Thị Hữu Hạnh nhiệt tình hướng dẫn, định hướng cho tơi suốt q trình thực hồn thành đề tài - Thầy Đỗ Xuân Tâm, cán phịng thí nghiệm, tạo điều kiện tốt trang thiết bị suốt trình thực đề tài Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè tơi ln ủng hộ tinh thần, động viên, giúp vượt qua khó khăn suốt q trình thực đề tài Bà Rịa - Vũng Tàu, ngày 12 tháng năm 2013 Sinh Viên Nguyễn Văn Tới Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 i Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan tất kết nghiên cứu nêu đề tài thực hiện, ý tưởng tham khảo kết trích dẫn từ cơng trình khác nêu rõ đề tài Bà Rịa - Vũng Tàu, ngày 12 tháng năm 2013 Sinh Viên Nguyễn Văn Tới Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 ii Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii TỪ VIẾT TẮT viii CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu ca cao 2.1.1 Nguồn gốc ca cao [11] 2.1.2 Đặc điểm ca cao [11] 2.2 Thành phần hóa học vỏ trái ca cao [11, 27] 2.3 Một số loại nấm bệnh ký sinh vỏ ca cao [11, 24] 2.4 Tổng quan phân hữu [18] 2.4.1 Khái niệm phân hữu [18] 2.4.2 Ưu nhược điểm phân hữu [18] 2.4.3 Tình hình ứng dụng vi sinh vật xử lí rác thải [14] 2.4.4 Một số mơ hình ủ phân hữu Việt Nam 11 2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình ủ phân 12 2.5 Các tiêu xác định chất lượng phân thành phẩm 20 2.6 Chế phẩm sinh học [19] 21 2.6.1 Chế phẩm GEM 21 2.6.2 Chế phẩm Trichoderma 22 2.7 Hai chủng nấm mốc tuyển chọn ứng dụng thực nghiệm 23 2.7.1 Trichoderma viride [3] 23 2.7.2 Aspergillus niger [3] 24 CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Phương tiện nghiên cứu 25 Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 iii Khoa Hóa học Công nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT 3.1.1 Thời gian địa điểm 25 3.1.2 Nguyên vật liệu 25 3.1.3 Hóa chất 25 3.1.4 Môi trường nghiên cứu phân lập 25 3.1.5 Dụng cụ thí nghiệm 26 3.1.6 Thiết bị sử dụng 27 3.2 Bố trí thí nghiệm 27 3.2.1 Thí nghiệm 1: phân lập, tuyển chọn số chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp cellulase cao 27 3.2.2 Thí nghiệm 2: Phương pháp xác định ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase 29 3.2.4 Thí nghiệm 4: Xác định thời gian thu nhận bào tử nấm mốc thích hợp 32 3.2.5 Thí nghiệm 5: khảo sát biến đổi nhân tố q trình ủ phân hữu từ vỏ trái ca cao 33 3.3 Phương pháp thống kê xử lí số liệu 38 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1 Kết phân lập tuyển chọn số chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp cellulase cao [3, 4] 39 4.1.1 Đặc điểm hình thái M1 39 4.1.2 Đặc điểm hình thái chủng M2 [4, 26] 40 4.1.3 Đặc điểm hình thái chủng M3 [4, 26] 41 4.1.4 Kết xác định sơ khả phân giải M1, M2,M3 42 4.1.5 Kết định danh chủng giống nấm mốc phân lập 44 4.1.6 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 44 4.1.7 Kết hoạt độ enzyme cellulase T.viride A.niger phương pháp đo đường khử 46 4.1.8 Kết xác định mơi trường thích hợp cho khả sinh tổng enzyme cellulase hai chủng nấm mốc 48 4.1.9 Kết khảo sát khả phát triển bào tử hai chủng nấm mốc môi trường bán rắn 49 4.2 Kết thực nghiệm trình ủ phân 50 4.2.1 Kết phân tích số thành phần nguyên liệu vỏ ca cao 50 4.2.2 Biến thiên nhiệt độ theo thời gian 52 4.2.3 Biến thiên độ ẩm thời gian ủ 54 Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 iv Khoa Hóa học Công nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT 4.2.4 Biến thiên pH đống ủ 55 4.2.5 Biến thiên hàm lượng cellulose đống ủ 57 4.2.6 Biến thiên hàm lượng carbon đống ủ 58 4.2.7 Biến thiên hàm lượng nitơ trình ủ 60 4.2.8 Biến thiên tỷ lệ C:N trình ủ 62 CHƯƠNG V.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 5.1 Kết luận 64 5.2 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 v Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần vỏ ca cao – Lớp vỏ cứng Bảng 2.2 Hàm lượng N tỷ lệ C:N có số phế phẩm 13 Bảng 2.3 Chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào 14 Bảng 2.4 Các tiêu phân hữu 21 Bảng 3.1 Dụng cụ cần sử dụng 27 Bảng 3.2 Thành phần nguyên liệu cần chuẩn bị 35 Bảng 4.1 Đường kính vịng phân giải theo thời gian M1, M2, M3 43 Bảng 4.2 Đường kính vịng phân giải trung bình theo thời gian M1, M2, M3 43 Bảng 4.3 Kết định danh chủng nấm mốc 44 Bảng 4.4 Đường kính vòng phân giải theo thời gian giá trị pH khác 45 Bảng 4.5 Đường kính vịng phân giải theo thời gian T.viride A.niger 45 Bảng 4.6 Hoạt tính enzyme cellulase T viride A.niger 47 Bảng 4.7 Hoạt tính enzyme cellulase T viride A.niger 47 Bảng 4.8 Ảnh hưởng nguồn cellulose đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase 48 Bảng 4.9 Số lượng bào tử đếm theo thời gian 50 Bảng 4.10 Các tiêu đầu vào vỏ ca cao 51 Bảng 4.11 Các thông số nguyên liệu 51 Bảng 4.12 Biến thiên nhiệt độ (0C) theo thời gian 52 Bảng 4.13 Biến thiên độ ẩm trình ủ phân 54 Bảng 4.14 Biến thiên giá trị pH theo thời gian ủ 56 Bảng 4.15 Biến thiên hàm lượng cellulose đống ủ 57 Bảng 4.16 Biến thiên hàm lượng carbon trình ủ phân 59 Bảng 4.17 Biến thiên hàm lượng nitơ trình ủ phân 60 Bảng 4.18 Biến thiên tỷ lệ C:N trình ủ 62 Bảng 4.19 Đặc tính sản phẩm 63 Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 vi Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây ca cao Hình 2.2 Cấu tạo ca cao Hình 3.1 Sơ đồ khối bố trí thí nghiệm 28 Hình 3.2 Sơ đồ khối bố trí thí nghiệm 30 Hình 3.3 Sơ đồ khối bố trí thí nghiệm 31 Hình 3.4 Sơ đồ khối bố trí thí nghiệm 32 Hình 3.5 Mơ hình thí nghiệm 33 Hình 3.6 Sơ đồ khối bố trí q trình ủ phân hữu từ vỏ trái ca cao 34 Hình 3.7: Mơ hình đống ủ 37 Hình 4.2 Sợi chủng M1 39 Hình 4.1 Khuẩn lạc M1 39 Hình 4.3 Bào tử chủng M1 40 Hình 4.4 Cuống sinh bào tử chủng M1 40 Hình 4.5 Khuẩn lạc M2 40 Hình 4.6 Cuống sinh bào tử hệ sợi chủng M2 41 Hình 4.7 Bào tử chủng M2 41 Hình 4.8 Mặt trước sau khuẩn lạc M3 42 Hình 4.9 Hệ sợi - bào tử - cuống sinh bào tử M3 42 Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn tương quan đường kính vịng phân giải thời gian M1, M2, M3 43 Hình 4.11 Đường kính vịng phân giải mơi trường thạch 44 Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme cellulase T.viride 45 Hình 4.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme cellulase A.niger 46 Hình 4.14 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme cellulase theo thời gian A.niger 47 Hình 4.15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme cellulase theo thời gian T.viride 48 Hình 4.16 Hoạt độ enzyme cellulase T.viride môi trường bán rắn 49 Hình 4.17 Hoạt độ enzyme cellulase A.niger mơi trường bán rắn 49 Hình 4.18 Đồ thị biễu diễn lượng bào tử tạo thành mơi trường ca cao 50 Hình 4.19 Biến thiên nhiệt độ (0C) theo thời gian 53 Hình 4.20 Biến thiên độ ẩm trình ủ phân 55 Hình 4.21 Biến thiên giá pH trình ủ phân 56 Hình 4.22 Biến thiên hàm lượng cellulose đống ủ 57 Hình 4.23 Biến thiên hàm lượng carbon trình ủ phân 58 Hình 4.24 Biến thiên hàm lượng nitơ trình ủ phân 60 Hình 4.25 Biến thiên tỷ lệ C:N trình ủ 62 Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 vii Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Từ đồ thị 4.25 bảng 4.18 thấy giá trị tỷ lệ C:N dao động khoảng cho phép Kết thúc trình ủ tỷ lệ C:N khoảng 25:1 tỷ lệ thích hợp cho phát triển cho VSV Điều chứng tỏ cơng thức phối trộn chúng tơi q trình ủ phù hợp 4.2.9 Đặc tính sản phẩm Sau 45 ngày ủ tạo phân hữu thành phẩm với kết thể bảng 4.19: Bảng 4.19 Đặc tính sản phẩm Đặc tính Đặc tính TCVN Thời gian ủ, ngày 45 Nhiệt độ, 0C 39 pH 6,5 6-8,5 47,24 Mùi thơm đất Đen 2,2 % 2,5 % 35,94 % >25 % 1,1 % Kali 4510 mg/kg P 2O5 176,5 mg/kg Độ ẩm, % Mùi Màu sắc sản phẩm Acid humic Hàm lượng hữu Acid fuvic Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 63 Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1.1 Kết luận - Phân lập hai chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase cao T.viride A.niger - pH thích hợp cho khả sinh tổng hợp enzyme cellulase:  T.viride: pH =  A.niger: pH = - Mơi trường bắn rắn thích hợp cho q trình ni cấy thu bào tử môi trường vỏ ca cao - Thời gian thích hợp để thu bào tử:  T.viride: ngày  A.niger: ngày - Ứng dụng hiệu hai chủng T.viride A.niger trình ủ phân hữu từ vỏ trái ca cao - Rút ngắn thời gian ủ từ 3,5-4 tháng xuống 45 ngày với hàm lượng mùn acid humic cao đạt 2,2 % - Mơ hình ủ phân tương đối đơn giản, dễ dàng chuyển giao cho nông dân địa phương ứng dụng thực tiễn - Ứng dụng T.viride A.niger hiệu cao so với sử dụng chế phẩm Trichoderma thương mại 1.2 Kiến nghị - Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Trichoderma thương hiệu Đại học Bà Rịa Vũng Tàu - Nghiên cứu ứng dụng T.viride để ức chế phát triển nấm Furasium Phytophara - Tiếp tục nghiên cứu thành phần bổ sung để đạt tiêu chuẩn phân bón hữu Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 64 Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Khươu Vương Yến Anh (2007) Nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase số chủng nấm sợi rừng ngập mặn Cần Giờ Đại học Sư Phạm TP.HCM [2] Lê Thị Nguyệt Anh (2009) Nghiên cứu sản xuất enzyme cellulase từ nấm mốc Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP.HCM [3] Nguyễn Văn Bá (2000) Đại Cương Về Nấm Mốc Thư Viện Học Liệu Mở Việt Nam module: m10067, 2000 [4] Kiều Ngọc Bích (2012) Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm hình thái số chủng nấm mốc có khả sinh cellulase cao Đại học Sư phạm Hà Nội II [5] Ngô Kim Chi, Nguyễn Thị Minh Tâm, Đặng Ngọc Phượng (2009) Phân tích chất lượng phân mùn hữu compost kiến nghị tiêu chuẩn kỹ thuật TT Hóa học ứng dụng [6] Ngơ Thị Hịa (2011) Ủ phân hữu quy mơ hộ gia đình từ rác thải nhà bếp khu dụ trữ sinh cù lao chàm- Hội An [7].Nguyễn Công Huế (2011) Ủ phân hữu từ thân ngô, Trung tâm Khuyến nông Đồng Nai [8] Đinh Thị Kim, Nguyễn Thị Kim Tuyến, Hồ Thiên Hoàn (2008), Thu nhận enzym cellulase từ Trichoderma sp Đại học Công Nghiệp TP.HCM [9] Bằng Hồng Lâm (2005) Thí nghiệm vi sinh vật học Đại học Nơng Lâm, TPHCM [10] Dương Minh, Tô Huỳnh Như, Trần Thị Cẩm Nhụy, Nguyễn Hoàng Phúc (2011) Khảo sát khả tiết cellulase chủng nấm Trichoderma thu thập đồng sơng Cửu long Tạp chí Khoa học 2011:17a 282-285, Đại học Cần Thơ [11] Trịnh Xuân Ngọ (2009) Cây Ca cao kĩ thuật chế biến NXB Giáo dục [12] Nguyễn Thị Ngọc Phương (2009) Báo cáo chương trình nghiệm sản xuất phân hữu từ rác thải nhà bếp Phịng tài ngun mơi trường thành phố Hội An [13] Lê Xuân Phương (2009) Thí Nghiệm Vi sinh vật học Đại học Lạc Hồng [14] Đào Xuân Thu (2006) Sản xuất phân hữu từ rác thải hữu sinh hoạt phế thải nông nghiệp để dung làm phân bón cho rau vùng ngoại vi thành phố Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT [15] Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng (2009) Nghiên cứu enzyme cellulase pectinase từ chủng Trichoderma viride Aspergillus niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP.HCM [16] Trần Thanh Thủy (1998) Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học NXB Giáo dục [17] Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy (2010) Khảo sát điều kiện nuôi cấy phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn bacillus subtilis Đại học Bách khoa Đà Nẵng [18] Ứng dụng vi sinh vật sản xuất phân bón Đại học Nơng Lâm, TPHCM, 2009 [19] Kĩ Thuật Chế Biến Vỏ Cà Phê Thành Phân Bón Hữu Cơ Sinh Học Dự án phát triển nông thôn DakLak, 2007 [20] California Integrated Waste Management Board Comprehensive Compost Odor Response Project 2007 San Diego State University Contractor’s Report to the Board [21] Hans Jurgen Kutzner, Microbiology of the composting process [22] Jonas Mva Mva( 2012) Cocoa fertilizer in west-Africa [23] Wiscosni Madison (2002) The Art and Science of Composting Center for intergrated [24].http://www.vuonsinhthaitrungviet.com/home/detail.asp?iData=798 [25] http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1839 [26] http://fungi.myspecies.info/non-lichenized-ascomycota/aspergillus-tamarii [27] http://tpmt.dntu.edu.vn/index.php/vi/download/CONG-NGHE-THUCPHAM/TONG-QUAN-VE-CAY-CA-CAO/ [28] http://www.slideshare.net/pjgeon1990/trichodermar-v-ng-dng-trong-ptsh [29].http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi-vn/72/45/45/59130/Trichoderma-Tacnhan-han-che-nam-benh-rat-hieu-qua.aspx [30] Dương Hoa Xơ (2009) Vai trị nấm đối kháng Trichoderma kiểm sốt sinh vật [intenet] 09/09/2005 [trích dẫn ngày 9/9/2005] Lấy từ URL: http://www.sonongnghiep.hochiminhcity.gov.vn/tintuc/Lists/Posts/Post.aspx?List =f73cebc3-9669-400e-b5fd-9e63a89949f0&ID=1594 Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm PHỤ LỤC Phụ lục 1: môi trường nghiên cứu phân lập Môi trường phân lập nấm mốc thạch - khoai tây PGA [13] - Khoai tây 200g; - Agar 20g; - Glucose 20g; - Nước cất đủ lít Cách chiết dịch khoai tây: khoai tây gọt vỏ, rửa Cân 200 g, cắt lát, thêm nước cất, đun sôi 120 phút Lọc lấy dịch Môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase phương pháp đục lỗ thạch % agar, % CMC [10, 13] - Agar 20g; - CMC 10g; - Nước cất vừa đủ 1000ml Môi trường phân lập Trichoderma sp đất M1 [9] Hóa chất Hàm lượng Hóa chất Hàm lượng (NH4)2SO4 1,4 g/l ZnSO4 1,4 mg/l KH2PO4 g/l CoCl2 mg/l CaCl2 0,3 g/l CMC 10 g/l MgSO4.7H2O 0,3 g/l Pepton g/l MnSO4.7H2O 4,56 mg/l Agar 20 g/l FeSO4 Nước 1lít mg/l Mơi trường Czapeck xác định nhanh hoạt tính enzyme cellulase trực tiếp khuẩn lạc [1],[2], [8] - NaNO3 g; - FeSO4 0,01 g; - K2HPO4 g; - Agar 20 g; - MgSO4.7H2O 0,5 g; - CMC 10 g; - KCl 0,5 g; - Nước cất 1000ml Dung dịch lugol: - I2 g; - KI g; - Nước cất 200ml Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Môi trường bổ sung mandel [1, 10] - (NH4)2SO4 0,140 %; - CaCl2 0,030 %; - KH2PO4 0,200 %; - MgSO4.7H2O 0,030 %; - Urea 0,030 %; - Pepton 0,075 % Dung dịch khoáng vi lượng - FeSO4 1,275 g/l; - ZnSO4 0,415 g/l; - MnSO4 0,465 g/l; - CoCl2 0,500 g/l Môi trường bán rắn nuôi cấy thu bào tử nấm mốc [1, 15] Môi trường với tỉ lệ sau: - Cám gạo: vỏ trấu = 6:4; - Cám gạo: vỏ lạc = 6:4; - Vỏ ca cao giã nhỏ 100% Độ ẩm ban đầu tất môi trường 55% Phụ lục 2: phương pháp phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc Cách lấy mẫu [9] - Mẫu đất: Cân 10 g đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước cất, lắc dung dịch 15 phút giữ yên - Mẫu vỏ ca cao: Giã nhỏ mẫu vỏ ca cao, cân 10g mẫu vỏ giã nhỏ cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước cất, lắc dung dịch 15 phút giữ yên Tiến hành pha loãng dung dịch ống nghiệm theo thang bậc 10 từ 10-1 đến 10-6 quy trình sau: Lấy 10g đất + 90ml nước cất  10-1 Lấy 10g ca cao+90ml nước cất10-1 >10-2 10 -310 -410-510-6 >10-210 -310 -410-510-6 Để thăm dò khả phân giải cellulose chủng vi sinh vật phân lập được, tiến hành thử nhanh đường kính vịng phân giải ba chủng nấm mốc mơi trường Czapeck 1% CMC, sau ứng với mốc thời gian tiến hành nhỏ dịch lugol đo sơ đường kính vịng phân giải, từ chọn lựa sơ chủng vi sinh vật có khả sinh enzyme ngoại bào cellulase để phân hủy cellulose vỏ ca cao Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Các chủng nấm mốc Môi trường Czapeck 1% CMC Nhỏ thuốc thử lugol Đo đường kính vịng phân giải Phân lập[9, 13] Đổ vào đĩa petri vô trùng lớp thạch chứa môi trường đặc hiệu PGA M1 dày khoảng 3mm Đợi thạch đông cứng Dùng pipetman vô trùng hút 0,1 ml dịch độ pha lỗng khác vào mơi trường thạch đĩa, dùng que trang trang nhẹ cho dung dịch phân bố Mỗi độ pha loãng cấy vào ba hộp petri Mỗi lần thay đổi độ pha lỗng phải thay đầu típ vơ trùng Ghi vào nắp hộp petri có mơi trường thạch thông tin mẫu, ngày cấy Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo đánh dấu đem ủ mẫu nhiệt độ phịng Sau 48 ni cấy khuẩn lạc mọc rõ, lấy quan sát khuẩn lạc chủng nấm Ghi nhận kết sơ từ hình thái cảm quan khuẩn lạc: màu sắc, có khuẩn lạc khác mọc đĩa chứa môi trường đặc hiệu Tiến hành cấy truyền riêng lẻ chủng nấm mốc sang đĩa thạch nhiều lần khiết khơng cịn tạp Sau tiến hành cấy truyền giữ giống ống thạch nghiêng - môi trường PGA Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Tất thao tác thực bên lửa đèn cồn tủ cấy vô trùng Cách quan sát kính hiển vi [13] - Chuẩn bị miếng lame lamell; - Ngâm cồn, dùng lau miếng lame lamell; - Nhỏ giọt nước cất lên lame dùng que cấy lấy nấm sợi phân lập cho vào giọt nước cất lame đậy miếng lamell tránh tạo bọt khí; - Quan sát mẫu Cách quan sát cuống sinh bào tử [13] Dùng lame kính, hấp khử trùng 121 0C 20 phút, nhỏ dịch môi trường PGA vào lame kính, tràn mỏng lớp thạch vị trí lame kính, tiến hành cấy chủng nấm mốc phân lập vào lớp thạch Sau 72h tiến hành quan sát trực tiếp hình thái chủng nấm mốc kính hiển vi Phương pháp lên men môi trường bán rắn sinh enzyme cellulase [15] - Nguyên tắc: Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn mơi trường để sinh trưởng tạo thành lượng lớn enzyme ngoại bào lẫn môi trường, ta thu sinh khối nấm sợi lẫn enzym thô Cách tiến hành: Nấm mốc cấy ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường PGA ủ tủ ấm thời gian 4-5 ngày Sau đếm số bào tử buồng đếm hồng cầu cho đạt số bào tử 106 bào tử/ml Rửa bào tử từ bề mặt thạch nghiêng với nước cất vô trùng thu huyền phù bào tử chủng Cho vào hộp nhựa chứa lượng thành phần môi trường theo tỉ lệ định sẵn có bổ sung dung dịch dinh dưỡng mandel khoáng vi lượng, làm ẩm hấp khử trùng atm 120 phút Ni ủ nhiệt độ phịng, sau tiến hành chiết dịch enzyme cellulase theo thời gian Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Phương pháp thử trực tiếp đường kính vịng phân giải khuẩn lạc [2] Chuẩn bị môi trường cảm ứng Czapeck 1% CMC cho 20 đĩa petri: Hóa chất Hàm lượng Hóa chất Hàm lượng NaNO3 0,8 g FeSO4 0,004 g K2HPO4 0,4 g Agar 8g MgSO4.7H2O 0,2 g CMC 4g KCl 0,2 g Nước cất 1000ml Hấp khử trùng 1210C, 20 phút, pH = 5,0-5,5 Cho vào ống nghiệm 20ml môi trường, hấp khử trùng 1210C 20 phút Sử dụng đĩa petri vơ trùng, kích thước Cho 20 ml môi trường từ ống nghiệm vào Cấy chấm chủng nấm mốc vào đĩa petri Ủ nhiệt độ phịng Sau cho thuốc thử lugol đo đường kính vịng trịn phân giải với thời gian tương ứng Phương pháp xác định ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase phương pháp đục lỗ thạch [1] CMC dẫn xuất cellulose, enzyme cellulase tổng hợp từ chủng vi sinh vật có tác dụng phân hủy CMC, sau thời gian nhỏ dịch enzyme cellulase thô lên môi trường chứa CMC, enzyme cellulase phân hủy CMC tạo thành vòng phân giải xung quanh lỗ nhỏ dịch enzyme cellulase, vòng phân giải suốt nhỏ dung dịch lugol vào Tùy thuộc vào lượng enzyme cellulase hoạt tính mà khả phân giải CMC khác Hàm lượng hoạt tính cao cho đường kính vịng trịn lớn Chủng vi sinh vật cấy môi trường lỏng với pH khác nhau, sau khoảng thời gian định tiến hành chiết dịch nhỏ vào môi trường thạch chứa 1% CMC, % agar Sau tiến hành đo đường kính phần thạch suốt tác dụng enzyme sinh Phương pháp xác định ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase phương pháp đo đường khử [1, 13] Phương pháp dựa thủy giải CMC enzyme cellulase pH = 400C Sau phản ứng thủy phân tạo lượng đường khử, đường khử phản ứng Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT với DNS, màu sau phản ứng xác định đo mật độ quang bước sóng 540 nm Tiến hành ni cấy chủng vi sinh vật môi trường lỏng Czapeck với pH khác nhau, sau xác định pH tối ưu tiến hành ni chủng vi sinh vật mơi trường bán rắn khác tìm mơi trường thích hợp Sau đó, tiến hành chiết dịch enzyme từ dung dịch lỏng, phần sử dụng để thử môi trường thạch % CMC, phần sử dụng máy quang phổ so màu bước sóng 540nm để xác định đối chứng lại xác hoạt tính enzyme cellulase vi sinh vật Dựng đường chuẩn theo bảng sau: Ống Nồng độ glucose, mg/ml ml dd glucose ml dd CMC 1% ml dd DNSLactose ml nước cất 0,1 0,2 0,3 04 0,5 0,6 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 1 1 1 2 2 2 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Lắc ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng chậu nước mát Đo độ hấp thụ ống bước sóng 540nm Xác định hoạt tính enzyme cellulase:  Ống nghiệm 1: phản ứng enzyme AT - Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm để 400C /5 phút Đồng thời, ta để chai chứa lượng dung dịch CMC % thích hợp 400C /5phút; - Thêm 1ml dung dịch CMC % vào ống nghiệm chứa enzyme lắc đều; - Để phản ứng 40 0C xác 10 phút; - Thêm 2ml dung dịch DNS-lactose, lắc để ngừng phản ứng enzyme; - Đem đun sôi cách thủy 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng chậu nước mát Đo độ hấp thụ bước sóng 540nm  Ống nghiệm 2: khơng có phản ứng enzyme AB - Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi từ đến 10 phút để bất hoạt enzyme; - Thêm 2ml dung dịch DNS-lactose lắc đều; - Thêm 1ml dung dịch CMC % chứa dung dịch enzyme lắc đều; - Đem đun sôi cách thủy 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng chậu nước mát Đo độ hấp thụ bước sóng 540 nm Thí nghiệm tiến hành khảo sát liên tục, chiết dịch enzyme từ dịch nuôi cấy, thu dịch enzyme theo thời gian 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h, 120h sau tiến hành xác định hoạt tính enzyme Giá trị glucose trung bình: F = (0,1/A0,1 + 0,2/A0,2 + 0,3/A0,3 + 0,4/A0,4 + 0,5/A0,5 +0,6/0,6 )/6 Hoạt độ enzyme: CMCase(UI/g) = (AT –AB)*F*(1000/180)*(1/10 phút)*(1/1ml)*(1/C) Trong đó: AT : độ hấp thụ dung dịch có phản ứng enzyme; AB : độ hấp thụ dung dịch khơng có phản ứng enzyme; F : yếu tố glucose, mg/ml; 1000 : chuyển mg thành, µg; 180 : phân tử lượng glucose; 10 : thời gian phản ứng; Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 Khoa Hóa học Công nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường : thể tích dung dịch enzyme, ml; C : nồng độ dung dịch mẫu, g/ml ĐHBRVT Đếm số bào tử sinh theo thời gian môi trường bán rắn [13] Tiến hành nuôi cấy chủng vi sinh vật phân lập nuôi cấy môi trường bán rắn, bắt đầu đếm số bào tử sinh từ ngày thứ Từ xác định thời gian sinh bào tử tốt để nhân sinh khối Phụ lục 3: phương pháp phân tích thực nghiệm trình ủ phân Sau phân lập, xác định chủng nấm mốc có khả phân hủy cellulose vỏ trái ca cao, đồng thời xác định yếu tố: thời gian, pH, môi trường rắn để lên men cho hoạt tính enzyme celllase phân hủy vỏ trái ca cao tối ưu, đồng thời xác định thời gian nhân sinh khối ưu nhất, tiến hành xử lí vỏ trái ca cao tiến hành ủ phân Vỏ ca cao chặt đôi để bóc tách phần hạt, sau bị thải bỏ vỏ ca cao gần cịn ngun vẹn hình thái to thơ khó phân hủy Chính tơi sử dụng máy cắt tự chế tiến hành cắt vỏ ca cao nhỏ ra, nhiên thiết bị không đại nên vỏ ca cao tương đối lớn 4-6 cm [9] Thiết bị tương đối đơn giản, chạy dầu, truyền động hệ trục quay gắn với búa đập, vỏ ca cao đổ vào phiễu nhập liệu, sau rơi xuống, bị búa đập nhỏ với kích thước điều điều chỉnh được lớp lưới đầu sản phẩm, khoảng cách búa đập lớp lưới 10mm, lớp vỏ ca cao chưa đủ kích thước để lọt qua lớp lưới bên tiếp tục bị búa quay dập kích thước đủ nhỏ để lọt ngồi Thiết bị ứng dụng việc xử lí kích thước ban đầu vỏ trái ca cao trước ủ phân Vỏ ca cao sau băm nhỏ phơi khơ ngồi tự nhiên đến độ ẩm cịn khoảng 35-40 % tiến hành ủ Trong trình ủ tiến hành đảo trộn bổ sung nước Theo thời gian tiến hành đo biến thiên nhiệt độ, pH, lấy mẫu xác định cellulose, hàm lượng nitơ carbon, theo dõi biến đổi màu sắc, mùi… Xác định hàm lượng Nitơ – TCVN 3705 - 90 Nguyên tắc chung: vơ hóa mẫu thử acid sunfuric đậm đặc, nitơ có mẫu thử chuyển thành amon sunfat Dùng kiềm đặc đẩy amoniac khỏi amon sunfat máy cất đạm, tạo thành amon hydroxyt, định lượng acid Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Dụng cụ hóa chất - Máy cất đạm; - Bình kjedalh; - Bình định mức dung tích 100ml; - Acid sunfuric đậm đặc dung dịch acid sunfuric 0,1 N; - Natri hydroxyt, dung dịch 30 % - Ống đong dung tích 10, 100ml; dung dịch natri hydroxyt - Buret 25ml; 0,1 N; - Pipet 10, 20, 50ml; - Hỗn hợp xúc tác: đồng sunfat + - Bình nón, dung tích 250ml; kali sunfat, tỷ lệ 1/10 theo khối - Chén cân; lượng; - Phễu thủy tinh; - Chỉ thị hỗn hợp: 200mg đỏ - Thìa nhựa; metyl 100mg xanh metylen - Bếp điện; hòa tan 200ml etanol - Giấy lọc không tro; 96 %; - Giấy đo pH; - Phenolphtalein; - Cân phân tích; - Metyl red Tiến hành: Cân xác lượng (g) vỏ ca cao cho vào bình kendan cho mẫu thử khơng dính vào cổ bình, cho tiếp g hỗn hợp xúc tác 10ml acid sunfuric đậm đặc Dùng phễu nhỏ đậy bình kjedalh, đặt bình nghiên 450 bếp điện tủ hút Đun 15-20 phút cho chất lỏng bình khơng sủi phồng, khơng bắn lên cổ bình Sau đặt bình thấp gần bếp dịch vơ hóa bình suốt xanh, khơng có màu vàng nhạt, mặt bình hồn tồn Ngừng đun, để nguội Lấy xác 25ml acid sunfuric 0,1 N giọt thị MR hỗn hợp vào bình nón dung tích 250ml, đặt bình vào ống sinh hàn máy cất đạm cho đầu ống sinh hàn ngập hẳn vào dung dịch Cho cẩn thận dịch vơ hóa vào bình cất, tráng bình kendan nhiều lần nước cất nước tráng hết phản ứng acid (thử giấy đo pH) Cho tiếp vào bình cất giọt phenolphtalein % dung dịch natrihydroxyt 30 % dung dịch bình chuyển thành màu hồng, cho tiếp vào dung dịch kiềm, tráng nước cất cho kiềm phễu khóa máy lại Cuối cho lớp nước cất cao 1,5-2 cm phễu để kiểm tra độ kín máy Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 Khoa Hóa học Công nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn bắt đầu chưng cất liên tục 40-50 phút kể từ dung dịch bình bắt đầu sơi Hạ bình hứng để ống sinh hàn lên khỏi mặt nước, dùng bình tia rửa đầu ống sinh hàn, tiếp tục chưng cất vài phút Sau hứng nước chưng chảy đầu ống sinh hàn, thử giấy đo pH thấy khơng có phản ứng kiềm Dùng natri hydroxyt 0,1N chuẩn độ lượng acid dư bình hứng dung dịch bình chuyển từ màu tím hồng sang xanh mạ Tính kết quả: Hàm lượng nitơ tổng số (X) tính phần trăm theo cơng thức: X= - V1: số ml H2SO4 0,1N cho vào bình hứng; - V2: số ml NaOH 0,1N chuẩn độ; - m vật liệu : số gam nguyên liệu; - Vxđ: thể tích dung dịch đem cất xác định Phương pháp xác định hàm lượng carbon [23] Phương Pháp “stop-gap- lấp đầy khoảng trống” thích hợp với sản xuất phân hữu quản lý chất thải rắn dùng để tính tốn hàm lượng carbon dựa cơng thức phát vào 1950 Công thức sau: %Cacbon  100%  CHC 1,8 - Cân khối lượng mẫu xử lý vào cốc nung; - Đốt 5500C giờ; - Hút ẩm đem cân Công thức định: %CHC  (m2  m0 )  100% m1 Trong đó: m1: khối xác lượng chất hữu đem đốt ban đầu; m0 : khối lượng cốc; m2 : khối lượng cốc chất hữu cân sau đốt Từ % CHC ta tính % C theo cơng thức sau: %Cacbon  Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 100%  CHC 1,8 Khoa Hóa học Cơng nghệ thực phẩm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Phương pháp xác định nhiệt độ Sử dụng nhiệt kế thủy ngân, cắm trực tiếp vào nơi cần đo đọc kết Phương pháp xác định pH [5] pH mẫu xác định cách pha mẫu với nước cất theo tỷ lệ 1:10, trộn đều, sau để lắng hết phần cặn sử dụng máy đo pH để xác định Dụng cụ: máy đo pH, máy lắc, bình tam giác 100ml Trình tự phân tích: Lắc 10 g mẫu giã nhỏ 30 phút với 100ml nước cất Sau để yên giờ, lắc thêm đến lần đo pH Hiệu chỉnh máy đo pH: máy trước đo phải hiệu chỉnh cách đo dung dịch đệm pH tiêu chuẩn Đo mẫu: giữ cho điện cực ngập nước cách mặt mẫu lắng xuống cm Chờ 30 giây đọc giá trị pH máy Phương pháp xác định độ ẩm [5] - Cân mẫu phân tích vào đĩa; - Sấy 100-105 0C 18-24 tiếng; - Hút ẩm 1h sau đem cân lại Công thức xác định độ ẩm: Độ ẩm Trong đó: m1: khối lượng chất hữu đem sấy ban đầu; m0 : khối lượng cốc; m2 : khối lượng cốc chất hữu cân sau sấy Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 Khoa Hóa học Công nghệ thực phẩm