TÀI LIỆU THAM KHẢO TRƯƠNG TẤN TÀI HƯỚNG DẪN HỌC MÔN KIỂM NGHIỆM LƯƠNG THỰC - THỰC PHẨM 2016 MỤC LỤC Chương Ngộ độc thực phẩm tiêu vi sinh thường kiểm soát thực phẩm I VI KHUẨN II NẤM MỐC III VIRUT THỰC PHẨM Chương Thành phần môi trường loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật I THÀNH PHẦN CỦA MÔI TRƯỜNG II PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG THEO THÀNH PHẦN 10 III PHÂN LOẠI THEO TRẠNG THÁI VẬT LÝ 10 IV PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG THEO CÔNG DỤNG 10 V PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG 11 VI BẢO QUẢN MÔI TRƯỜNG 13 VII KHỬ TRÙNG VẬT LIỆU SAU KHI NUÔI CẤY 14 Chương Phương pháp thu nhận, bảo quản chuẩn bị mẫu thực phẩm để phân tích vi sinh vật 14 Chương Phương pháp định lượng vi sinh vật 17 I PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP 17 II PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 17 Bài tập 19 Bài tập 21 Bài tập 21 III PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC ĐỂ ĐẾM VI SINH VẬT 21 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài IV PHƯƠNG PHÁP MPN 22 Bài tập 22 Bài tập 22 Chương Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng dùng kiểm tra định tính vi sinh vật 23 Chương Quy trình phân tích tiêu vi sinh vật 35 I COLIFORMS VÀ E.COLI 35 II STAPHYLOCOCCUS AUREUS 38 III FAECAL STREPPTOCOCCUS 39 IV SALMONELLA 40 V SHIGELLA 41 VI VIBRIO 41 VII LISTERIA MONOCYTOGENES 43 VIII CLOSTRIDIUM 44 IX NẤM MỐC VÀ NẤM MEN 44 Chương Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp đại 44 I PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG SINH HỌC ATP 44 II PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Assay) 45 III PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ 47 IV PHƯƠNG PHÁP PCR 47 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Chương Ngộ độc thực phẩm tiêu vi sinh thường kiểm soát thực phẩm KIẾN THỨC CHUNG: + Vi sinh vật gây độc ngoại độc tố nội độc tố - Ngoại độc tố chất tiết bên chất protein có tính sinh kháng cao, dễ bị phá hủy nhiệt độ 600C Tính độc mạnh (𝑓𝑜𝑟𝑚𝑜𝑙 𝑜𝑟 𝑇)/𝑎 𝑡𝑖𝑚𝑒 𝑁𝑔𝑜ạ𝑖 độ𝑐 𝑡ố → 𝑀ấ𝑡 độ𝑐 𝑡í𝑛ℎ 𝑛ℎư𝑛𝑔 𝑣ẫ𝑛 𝑐ò𝑛 𝑡í𝑛ℎ 𝑘ℎá𝑛𝑔 𝑠𝑖𝑛ℎ → Sản phẩm giải độc tố dùng làm vacxin phòng bệnh đặc hiệu - Nội độc tố độc tố LK chặc chẽ với vách tế bào VK Gram -, không khuếch tán môi trường bên ngoài, tính độc yếu ngoại độc tố Thành phần độc tố chủ yếu lipit A nhóm lipopolysaccharide vách tế bào Tính chất miễn dịch yếu, dùng formol ngoại độc tố + Nhiễm → tăng sinh nhanh → nhiễm độc + Giới hạn vsv thực phẩm Vi khuẩn Gram - Vi khuẩn Gram + Salmonella Clostridium pertrigens (bào tử +T) Commented [TST1]: milion cell/ 1g TP; tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn Campylobacter (-T,-acid) Clostridium botulinum (bào tử -T) Commented [TST2]: Gây đau thắt vùng bụng, tiêu chảy Vibrio Staphylococcus aureus Commented [TST3]: Viêm nhiễm đường ruột: đau nhức, tiêu chảy, sốt, đau đầu, khó chịu, chuột rút, lạnh cóng Coliforms Listeria monocytogenes Commented [TST4]: Sinh độc tố botulin Shigella Bacillus cereus Commented [TST5]: Tác nhân gây bệnh tả Commented [TST6]: Tiêu chảy, nôn mửa Nấm mốc: Aspergillus, độc tố aflatoxin cho phép ≥ 20ppb Commented [TST7]: Chỉ thị khả vệ sinh thực phẩm Virus: HAV, HEV Commented [TST8]: Tiêu chảy, sốt nhẹ, nhiễm trùng máu, tổn thương hệ thần kinh trung ương, tim, mắt Sẩy thai, đẻ non, nhiễm vào thai nhi I VI KHUẨN - Chỉ trừ Clostridium botulinum không bị tiêu chảy mà bị ói mửa buồn nôn → rối loạn hệ thần kinh Commented [TST10]: Gây tiêu chảy buồn nôn, - Campylobacter bị tiêu diệt hoàn toàn phương pháp Pasteur (60 – 700C) - Vibrio tác nhân gây bệnh tả Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Commented [TST9]: Tiêu chảy nhẹ, cao tiêu máu, có mảnh niêm mạc ruột, nước, sốt cao, bị co rút thành bụng - Nhiễm trùng máu: V vulnificus Listeria monocytogenes Nhóm độc tố tiết từ vi khuẩn: Clostridium botulinum Sinh độc tố botulin Staphylococcus aureus Sinh độc tố enterotoxin bền nhiệt 1000C 30min + V.cholerae sinh cholarae – toxin(hoạt Vibrio tính mạnh gây tiêu chảy) + Độc tố hemolysine tetrodotoxin cá Bacillus cereus Diarrhoealtoxin gây tiêu chảy, Emetictoxin gây nôn mửa Nhóm vi khuẩn công trực tiếp vào tế bào: Salmonella, Campylobacter, Clostridium pertrigens, Coliforms, Shigella, Listeria monocytogenes Nhóm thực phẩm dễ bị nhiễm loại vi khuẩn: Salmonella Campylobacter Clostridium pertrigens Thịt gia cầm, trứng,… Thịt gia cầm, trứng, sữa,… Thịt gia cầm đông lạnh sâu, mắm tôm,… [đất, phân người] Thịt, rau quả, thực phẩm nhiễm đất, phân Clostridium botulinum động vật chế biến chưa đủ nhiệt trước dùng, sản phẩm đóng hộp không qui cách Staphylococcus aureus Vibrio jambon, kem tổng hợp, nước sup, loại thủy sản, thực phẩm đóng hộp Sữa, loại thủy sản, nước uống trái Coliforms Listeria monocytogenes Sữa, rau quả,… Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Shigella Bacillus cereus đất, bụi, loại thực phẩm( Thịt, sữa, rau quả, gia vị, sản phẩm khô) II NẤM MỐC + Các loại ngũ cốc, nông sản mà không phơi sấy kĩ dễ bị lên nấm mốc + Sau – ngày nấm mốc tiết độc tố vào thể III VIRUT THỰC PHẨM Con đường lây nhiễm - Sống đường ruột người, thải phân nhiễm vào thực phẩm, từ lây nhiễm vào miệng người khác Kỹ thuật xét nghiệm - Bằng kỹ thuật sinh học phân tử PCR lai phân tử,… Nhóm virus Gây rối loạn tiêu hóa + loại Rotavirus Norovirus + Rotavirus: tồn tháng Gây viêm gan + HAV ( Virus hepatitis A) - nhiệt dộ 40C hay điều kiện pH acid – Tồn nước từ đến 10 tháng 3,5 - + Norovirus: thuộc họ Caliciviridae  Chiếu xạ loại RNA  T = 560C / 30 - Sống đk khắc nghiệt đông Hủy diệt virus: Commented [TST12]: Triệu chứng: nhức đầu, nôn mửa, đau bụng, tiêu chảy, đau nhức bắp, sốt nhẹ nóng lạnh + Bệnh thường khỏi sau hai ba ngày + Khả lây nhiễm cao + Hiện diễn phân nước ói mửa  850C / lạnh, nhiệt độ nóng 600C 30 + HEV (Virus hepatitis E) môi trường chlore Rất giống virus viêm gan A 6,25mg/lít Kết luận đặc điểm virus thực phẩm - Các virus đường ruột thường lây nhiễm vào người qua sản phẩm thủy sản - Tất virus đường ruột kháng với acid, enzyme thủy giải, hay muối mật có đường tiêu hóa - Kháng nhiệt Hepatits type A Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Commented [TST11]: Triệu chứng: sốt, nhức đầu, nôn mửa, đau bụng, tiêu chảy biểu lộ cách tạm thời dấu hiệu bất dung nạp đường lactose sữa - Kháng chất tẩy uế phenolic, ethanol,… → Ozon Chlorine bất hoạt vài virus đường ruột Phòng virus thực phẩm - Thức ăn nấu chín - Khử virus trước tiêu thụ - Các loại nhuyễn thể ăn lọc phải khai thác vùng nước không nhiễm virus hay nuôi vùng nước trước tiêu thụ Chương Thành phần môi trường loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật I THÀNH PHẦN CỦA MÔI TRƯỜNG + Nước cất, khử ion có pH = Nước + pH = 6,5 → môi trường trao đổi chất môi trường phản ứng sinh hóa + Tạo môi trường rắn Agar + Rất nhiều vsv không dùng agar làm chất dinh dưỡng 𝐻𝐶𝐿 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 + 𝑛𝐻2 𝑂 ⟶ 𝑃𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛 … 𝑃𝑒𝑝𝑠𝑖𝑛 𝑝𝑎𝑛𝑐𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛 + 𝐶𝑎𝑠𝑒𝑖𝑛 → Pepton 𝑃𝑒𝑝𝑡𝑜𝑛𝑡𝑟𝑦𝑝𝑡𝑖𝑐𝑎𝑠𝑒 + Bột đậu nành phân giải thành Phytone pepton papainic) + Pepton thịt: sản phẩm phân giải thịt nhờ pepsin + Thịt không bao gồm gân mỡ xử Cao thịt lý enzyme sau ly trích cô đặc cao thịt Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài → Thành phần dinh dưỡng cực tốt + Dung dịch trích ly từ nấm men qua trình tự phân thực đông khô cao Cao nấm men nấm → Giàu vit, đk tốt vsv(thường bổ sung 3g/L) + Bột gan: cung cấp dinh dưỡng, hệ thống oxy hóa khử tự nhiên + Cung cấp S để thay thể O: Sodium thioglycolater, solium formaldehyde sulfoxylate cysteine Một số tác nhân tạo môi trường kị khí Nếu môi trường khô chọn muối hemin – muối chloride heme ion protoporphyrin có thành phần nhiều enzyme oxy hóa khử cytochrome hemoglobin,… + Cung cấp chất kích thích phát triển vi sinh vật kỵ khí + Ứng dụng: ứng dụng phân lập chọn lọc hệ vi sinh vật đường ruột ức chế vk Gram + + Chức năng: giảm sức căng bề mặt Chế phẩm từ mật bò vùng tiếp xúc màng môi trường, kích thích men autolysin nội bào dẫn đến phân giải màng tế bào + Mật bò: mật bò tươi làm đông khô 1g mật bò khô = 10 – 12g mật tươi Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Cmt = 10 – 20g/L mật bò + Hỗn hợp muối từ mật bò: hỗn hợp muối Na acid có mật bò(cholic, taurocholic, desoxycholic,…) mật bò hoạt tính cao dùng với C thấp Commented [TST13]: hợp chất có khả phân giải màng mạnh + Sodium desoxycholate: dùng nhiều để phân lập vk đường ruột Gram - Các chất ức chế chọn lọc + Azide sufite ức chế trực khuẩn Gram – môi trường chọn lọc Streptococii + Lauryl sulphate ức chế phần lớn vk tạp nhiễm môi trường canh lauryl sulfate dùng tăng sinh chọn chuẩn đoán sơ Coliforms Các chất để thử phản ứng sinh hóa + Vsv tạo enzyme phân giải biến đổi chất môi trường thành chất + Cơ chất thường dùng đường(-ose) rượu(-ol): nồng độ cho phép 0,5 – 1% + Chỉ thị pH thường dùng: Bromothymol Blue (BB), Bromocresol, Neutral red đặc biệt phenol red → Phenol red đổi từ màu đỏ sang vàng vsv chuyển từ đường sang acid làm pH giảm + Sự thay đổi oxi môi trường đánh giá chất thị rH Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Commented [TST14]: Được nhận diện thuốc thử chất thị màu thích hợp Khi oxy tăng = lượng oxy môi trường tăng: sodium resazurin chuyển từ vàng sang đỏ, methylene blue chuyển từ không màu sang màu xanh lam II PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG THEO THÀNH PHẦN Có thành phần sản phẩm tự nhiên dịch nước chiết Môi trường tự nhiên thịt, nước chiết khoai tây, máu động vật, Thành phần hóa học loại môi trường không xác định xác không ổn định sản phẩm tự nhiên Chứa chất hóa học mà thành phần chúng xác định định lượng cách cụ thể xác Môi trường tổng hợp Czapeck, Hansen, EMB, Nhiều vi khuẩn hoá dưỡng dị dưỡng sinh trưởng môi trường chứa glucose nguồn cacbon muối amôn nguồn nitơ Môi trường bán tổng hợp Chứa chất hóa học lẫn sản phẩm tự nhiên Potato glucose agar (PGA), III PHÂN LOẠI THEO TRẠNG THÁI VẬT LÝ - Môi trường rắn: chứa agar gelatin - Môi trường lỏng - Môi trường bán rắn IV PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG THEO CÔNG DỤNG  Môi trường tiền tăng sinh (preenrichment media): môi trường lỏng dùng để tăng sinh tính chọn lọc, làm giàu mật độ vi sinh vật diện mẫu Loại môi trường giàu dinh dưỡng, không chứa chất ức chế tăng trưởng đặc hiệu, có tác dụng phục hồi giúp tăng trưởng đồng thời nhiều loài VSV  Môi trường tăng sinh (enrichment media): môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc đối tượng VSV cần kiểm nghiệm, ức chế tăng trưởng VSV khác có chứa chất ức chế tăng trưởng đặc hiệu Ví dụ MT tetrathionate MT tăng sinh chọn lọc cho Salmonella 10 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Thử nghiệm sinh hóa: canh trypton, MR-VP, Simmon Citrate, để thử nghiệm IMVic Kết quả: Indol +, MR +, VP -, Citratase – Ecoli II STAPHYLOCOCCUS AUREUS + Thuộc họ Staphylococcaceae + Còn gọi tụ cầu vàng + Sống hiếu khí tùy nghi  Phản ứng đặc trưng: catalase, coagulase dương tính  Phản ứng oxidase âm tính  Hầu hết có khả tan huyết (95%)  Lên men tạo acid từ mannitol (đỏ → vàng)  Phát triển môi trường chứa 15% NaCl  Trên môi trường không chọn lọc tạo sắc tố vàng  Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt + Sự phân bố tự nhiên:  Thường tìm thấy động vật máu nóng  Nhiễm vào thực phẩm chủ yếu qua việc chế biến sản xuất không hợp vệ sinh  Nhiệt độ 10 – 450C, pH 4,6 – 9,3 , tối ưu 370C pH + Khả gây ngộ độc thực phẩm: Sinh độc tố ruột: Enterotoxin A, B, C, D, E bền nhiệt - Viêm dày ruột: ăn thức ăn bị nhiễm độc tố - Viêm ruột non – đại trạng: ăn thức ăn bị nhiễm tụ cầu với số lượng lớn(>105 vk/1g thức ăn) Sinh độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc Định lượng S Aureus + Môi trường BPA chapman Agar + Khuẩn lạc: đường kính 0,5 – 1mm, lồi, đen bóng có vòng trắng đục hẹp, vòng sáng rộng 38 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định: S Aureus có phản ứng coagulase dương tính Quy trình định lượng S Aureus Cấy mẫu lên môi trường BPA que cấy trang → Ủ → Nt số khuẩn lạc đặc trưng Na số khuẩn lạc không đặc trưng → chuyển kl đặc trưng kl không đặc trưng sang mt TSA → Ủ → Cấy chuyền vào ống có chứa huyết tương → Rt dương tính ( dạng lỏng) Ra âm tính khuẩn lạc không đặc trưng S Rt = 𝑆ố ố𝑛𝑔 𝑑ươ𝑛𝑔 𝑡í𝑛ℎ 𝑙ỏ𝑛𝑔 𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố ố𝑛𝑔 𝑘𝑙 đặ𝑐 𝑡𝑟ư𝑛𝑔 ( N t Rt  N a Ra ) nVf Ra = 𝑆ố ố𝑛𝑔 â𝑚 𝑡í𝑛ℎ đặ𝑐 𝑡ổ𝑛𝑔 𝑠ố ố𝑛𝑔 𝑘𝑙 𝑘ℎô𝑛𝑔 đặ𝑐 𝑡𝑟ư𝑛𝑔 + Thử nghiệm coagulase: mức độ đông tụ huyết tương + Định tính S Aureus:  Tăng sinh môi trường chọn lọc: môi trường MSB, ống dương tính chuyển từ màu đỏ sang màu vàng  Mẫu biểu dương tính phân lập môi trường chọn lọc: - Môi trường BPA, TGA, Chapman agar - Kl đen nhánh, sáng tròn, lồi, đường kính 0,5 – 1mm, có vầng sáng chung quanh - Khẳng định khuẩn lạc nghi ngờ (5 đặc trưng + không đặc trưng) Phản ứng coagulase làm ngưng kết huyết tương III FAECAL STREPPTOCOCCUS + Các liên cầu khuẩn có nguồn gốc từ phân + Hình cầu hay hình oval kéo dài, G+ + Không di động, không sinh bào tử, số dòng có tạo vỏ nhày + Hầu hết sống hiếu khí tùy ý phát triển tốt điều kiện kỵ khí + Tiết bacteriocin trình tăng trưởng + Môi trường Enterococcus Agar + Cấy khuẩn lạc đặc trưng vào TSA dương tính chịu muối 6,5%, chịu pH 9,6, Catalase -, Oxydase - Nếu theo phương pháp MPN: 39 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Canh Azide Glucose: (+) màu mt: tím → có cặn Thử nghiệm catalase: AG +, BE +, Catalase – IV SALMONELLA + Thuộc họ Enterobacteriaceae, có hình que G-, không sinh bào tử, sống hiếu khí tùy nghi phát triển tốt điều kiện hiếu khí + Hầu hết có khả di động tiêm mao + Hầu hết có khả sinh khí H2S trừ S Typhi + Có khả sinh acid từ glucose, mannitol, không lên men lactose, sucrose + Không tạo indol + Có khả tạo enzyme lysine decarboxylase + Các kháng nguyên: Kháng nguyên O: kháng nguyên màng tế bào, bền nhiệt nội độc tố Kháng nguyên H: kháng nguyên tiêm mao không mang độc tố Kháng nguyên V: kháng nguyên vỏ không mang độc tố + Bệnh Salmonella:  Bệnh sốt thương hàn S Typhi S Paratyphi Đường ruột: triệu chứng ngộ độc thực phẩm: tiêu chảy, nôn mữa, buồn nôn, đau thắt vùng bụng, sốt Nhiễm trùng máu Tg ủ bệnh từ ngày đến tuần  Định tính Salmonella + Tiền tăng sinh: môi trường không chọn lọc Buffer Pepton Water + Tăng sinh chọn lọc: thực môi trường chọn lọc cho Salmonella: RV, TTB, Selenite Cystine Broth, - Không có môi trường chọn lọc cho tất kiểu huyết Salmonella - Nên chọn lọc môi trường chọn lọc mẫu - Môi trường RV TTB không chọn lọc cho S Typhi + Phân lập: thực môi trường chọn lọc phân biệt cho Salmonella XLD, HE, BS, BPLS, SS 40 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài + Khẳng định: thử nghiệm sinh hóa KIA, lên men, LDC, urea, indol, Thử nghiệm huyết đa giá đơn giá Biểu hiện: KIA/TSI: đỏ/vàng, H2S + , Gas +, Urea -, indol -, matanol +, LDC +, VP - Ngưng kết với kháng huyết O đa giá V SHIGELLA + Vsv gây bệnh lỵ trực tràng + Chỉ gây bệnh cho người linh trưởng + Không phép diện 25g thực phẩm + Thuộc họ Enterobacteriacea + Sinh độc tố enterotoxin Shiga toxin  Nguyên tắc định tính: + Tăng sinh môi trường không chọn lọc: canh TSB: canh tryptone Soya + Tăng sinh môi trường chọn lọc: canh GN (G-) + Chọn lọc phân lập: sử dụng môi trường chọn lọc sau: T7A, MAC, XLD, Deoxycholate Citrate Agar, HE + Khẳng định thử nghiệm sinh hóa: Thử nghiệm sàng lọc: KIA/TSI, tính di động Commented [TST15]: Đỏ sang vàng Commented [TST16]: Không Các thử nghiệm khác Kết quả: H2S -, Oxydase – VI VIBRIO + Vsv địa nước biển + Không phát hiện/ 25g thực phẩm + Cần Na+ để tăng trưởng phát triển trừ V Cholerae + Có loài có khả gây bệnh cho người: V alginolyticus V cholerae V paraheamolyticus V vulnificus V paraheamolyticus 41 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài - vsv ưa mặn bắt buộc - Phát triển tốt môi trường có – 8% NaCl - Thường xuyên tìm thấy vùng ven bờ - Động vật ăn đáy nguồn mang V.para - Một số dòng có mang kháng nguyên Kanagawa Thời gian ủ bệnh – 96h Biểu hiện: đau thắt vùng bụng, tiêu chảy nhẹ Những bệnh nhân có lượng acid dày thấp thường nhạy cảm với bệnh V cholerae + Gây bệnh dịch tả + Có thể sinh trưởng nước mặn nước Di động nhanh nước nên phát dịch nhanh Được chia thành nhóm cấu trúc kháng nguyên: O1: có kháng nguyên O non – O1: kháng nguyên O + Vi khuẩn G-, hình que hai đầu không nhau, di động nhanh nước + Oxidase +, Sucrose +, Nitratase +, ONPG+ Commented [TST18]: Chỉ gây bệnh người có hệ miễn dịch yếu + Phân hủy lysine không phân hủy arginine + Có thể phát triển môi trường có – 3% NaCl, bị ức chế nồng độ 6, 8, 10% Tính gây bệnh: Khi xâm nhập vào thể chúng sản sinh độc tố: choleratoxin độc tố khác hemolysine Khả lây truyền từ thực phẩm, nước từ người sang người Các loại nước uống thực phẩm thủy hải sản có khả nhiễm V Cholerae cao Thực định tính: Tăng sinh chọn lọc: môi trường pepton kiềm có pH 8,6 Phân lập: môi trường chọn lọc phân biệt TCBS Thử nghiệm sinh hóa: KIA, tính di động, thạch mềm, oxydase, LDC, ADH, mannitol, tính chịu mặn, Kết quả: KIA: đỏ/vàng, H2S -, gas - 42 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Commented [TST17]: Kiểu huyết thanh: Inaba Ogawa Hikojima: mang kháng nguyên Inaba Ogawa Kiểu huyết Eltor gọi V cholera 0139 phát gần Di động thạch mềm + Oxidase + KOH thử Gram - 3% +, 6% -, 8% -, 10% - VII LISTERIA MONOCYTOGENES + Gây viêm màng não trẻ em, sẩy thai, sinh non phụ nữ, viêm hệ thần kinh trung ương, viêm màng tim, mắt + Có thể tồn lâu thể mà không bị đào thải + Không phát thấy độc tố  Vi sinh vật chịu lạnh  Phát triển từ – 40C  Cạnh tranh với vi sinh vật khác  Có thể nhiễm vào công đoạn chế biến  Không phát triện 25g thực phẩm qua gia nhiệt, 100CFU/g thực phẩm phải qua gia nhiệt Quy trình phát hiện: Tăng sinh: + Tăng sinh giai đoạn canh EB 300C 48h + Tăng sinh giai đoạn: LB I 300C/24h LBII 300C/24h Phân lập: sử dụng môi trường chọc lọc cho Listeria – Môi trường Oxford Agar: 370C, 24 – 48h Khẳng định: + CAMP: + với R Equi + với S Aureus + Khả tan huyết: yếu thạch máu + Khả di động: + giọt treo thạch mềm + Khả lên men đường: rhamnose +, xylose - + Catalase +, oxidase - + Nhuộm G+ 43 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài VIII CLOSTRIDIUM + G+, kị khí, sinh bào tử, thủy giải protein chuyển hóa aa tạo mùi khó chịu, đa số ưa acid Khả gây bệnh C botulinum sinh độc tố thực phầm botuline C perfringens: sinh độc tố thực phẩm gây bệnh hoại tử vết thương C tetani: gây bệnh uốn ván Các loài khác có khả hoại tử mô gây biến chứng vết thương Phương pháp định lượng Clostridium: + Sử dụng môi trường có chứa sắt sulphite + Kl mọc môi trường có màu đen có phản ứng S2- Fe2+ + Môi trường ISA IX NẤM MỐC VÀ NẤM MEN + Thuộc nhóm vsv dị dưỡng, có nhân thật, đa dạng + Nhiệt độ thích hợp 20 – 280C Thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, số thuộc nhóm vi hiếu khí Khi phát triển thực phẩm làm thay đổi màu tạo mùi lạ, làm hư hỏng, thay đổi cấu trúc thực phẩm, số loài sinh độc tố ĐỊNH TÍNH Đồng mẫu SDB → cấy canh trường có mốc mọc lên đĩa SDA, MEA hay PDA ủ → có hay không nấm mốc PHÂN TÍCH TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ NẤM MỐC Pha loãng lần → Trải lên đĩa DRBC DG18 lên đĩa MEA PDA Đếm số khuẩn lạc nấm mốc, nấm men, tính mật độ CFU/g Chương Quy trình phân tích vi sinh vật theo phương pháp đại I PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG SINH HỌC ATP + Phương pháp dựa nguyên tắc phát quang sinh học đom đóm xúc tác enzym luciferase 44 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài + Phân tử ATP diện tất tế bào sinh vật sống, đó, phát ATP dấu hiệu để nhận biết vật chất sống tồn ATP phát cách nhanh chóng lượng ánh sáng phát thông qua kết hợp với enzym luciferase nhờ máy đo sáng Kỹ thuật phát 1pg ATP (10-12g) tương đương với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10-15g ATP/tế bào) Thông thường phân tích, ATP tế bào vi sinh vật tách chiết khỏi tế bào (thường dùng trichloacetic acid 5%) định lượng dựa vào cường độ ánh sáng phát Sự phân tích thực nhanh chóng diễn vài phút Cơ chế phản ứng phát quang phương pháp xảy sau: Luciferase + Luciferin + ATP  Luciferase-Luciferin AMP + PPi Luciferase-Luciferin AMP + O2  Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv (phát quang) → Phương pháp phát quang sinh học ATP ứng dụng lĩnh vực: giám sát vệ sinh, kiểm tra loại chất lỏng nước rửa làm hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh thực phẩm II PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Assay) + Phương pháp ELISA (Phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme) dựa nguyên tắc phản ứng kết hợp tế bào (kháng nguyên) với kháng thể đặc hiệu Tín hiệu phản ứng miễn dịch nhận biết thông qua ngưng tủa hay kết dính kháng nguyên-kháng thể kháng thể đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzym) + Xét nghiệm ELISA tiến hành với số phương pháp ELISA “trực tiếp“, “gián tiếp“, “sandwich“ “cạnh tranh“ + Nguyên tắc phương pháp ELISA kháng nguyên hoà tan dung dịch đệm thích hợp phủ lên bề mặt plastic (như polystyrene) Quá trình trực tiếp thông qua kháng thể Khi huyết thêm vào, kháng thể kết hợp với kháng nguyên pha đặc (solid phase) + Các kháng thể sử dụng phương pháp ELISA gắn với enzyme liên kết đồng hoá trị Kháng nguyên gắn với giếng plastic kháng thể liên kết với enzyme gắn với kháng nguyên Kháng thể không gắn kháng nguyên bị rửa trôi Enzyme giữ lại lượng kháng thể gắn enzyme phát cách 45 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài cho thêm vào chất làm thay đổi màu hoạt tính enzyme Ðộ màu tạo thành tỉ lệ với lượng enzyme bám giếng plastic, từ suy lượng kháng thể, sau tiếp tục suy lượng kháng nguyên Tính nhạy ELISA khuyếch đại hoạt tính enzyme Mỗi phân tử enzyme bám vào kháng thể tạo hàng ngàn phân tử màu hoạt tính enzyme Trước kháng thể gắn enzyme sử dụng rộng rãi, kháng thể phóng xạ sử dụng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (radio immuno assays-RIA) Trong phương pháp này, kháng thể đơn dòng phủ bên đĩa giếng Nếu có diện kháng nguyên mục tiêu mẫu, kháng nguyên giữ lại bề mặt giếng Các kháng nguyên phát cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzym horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase Khi bổ sung chất đặc hiệu enzym vào giếng, enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân 46 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Thông qua việc theo dõi đổi màu, phát diện định lượng kháng nguyên ELISA sử dụng rộng rãi dạng hoá chất (kit) thương mại Hiện nay, có kit dùng cho Salmonella, E coli gây bệnh, Listeria, Staphylococcus Độ nhạy kit khoảng 104 CFU/ml, cần thực tăng sinh tăng sinh chọn lọc thực phương pháp Ngoài có sản phẩm khác TECRA (Australia) dựa nguyên tắc để định danh độc tố Staphylococci thịt III PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ Phương pháp lai phân tử gọi phương pháp mẫu dò, probes Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát vi sinh vật thực phẩm dựa phát đoạn gen đặc trưng vi sinh vật Cơ sở việc sử dụng mẫu dò trình lai phân tử Quá trình bao gồm tách rời hai mạch đôi chuỗi xoắn kép DNA nhiệt độ vượt nhiệt độ nóng chảy (Tm ) phân tử DNA tái bắt cặp đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung nhiệt độ trở lại bình thường Một hai mạch DNA bổ sung (gọi DNA mục tiêu DNA tế bào vi sinh vật) cố định giá thể rắn nằm tế bào hay mô Sự lai phân tử xảy đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với vùng trình tự DNA mục tiêu gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ Sự lai phân tử xảy DNA RNA Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố: nồng độ DNA môi trường, nhiệt độ thời gian phản ứng, kích thước trình tự lai lực ion môi trường IV PHƯƠNG PHÁP PCR Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa khuôn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzym polymerase cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA Phương pháp PCR cho phép tổng hợp nhanh xác đoạn DNA riêng biệt Ðây thực phương pháp đại thuận tiện cho việc xác định có mặt gen tế bào với độ xác cao 47 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Phương pháp dựa khám phá hoạt tính sinh học nhiệt độ cao DNA polymerase tìm thấy sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống suối nước nóng) Phần lớn DNA polymerase làm việc nhiệt độ thấp Nhưng nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt DNA polymerase nhiều khả làm biến tính phần lớn phần phân tử Nhưng polymerase chịu nhiệt hoạt động nhiệt độ cao, lên đến 100oC Ở nhiệt độ DNA (dạng thẳng) bị biến tính  Các thành phần chủ yếu phản ứng PCR a DNA mẫu (DNA template) Ðây mẫu DNA sinh học mà muốn khuyếch đại Phản ứng PCR tối ưu xảy DNA thật tinh phản ứng PCR cho kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng mẫu DNA sử dụng có khuynh hướng giảm sử dụng enzyme DNA polymerase cho hiệu cao ([...]... 2016 by Trương Tấn Tài  Trên tạo khối đông → đông huyết tương - phiến kính: Coagulase có bản chất protein Pứ(+): đông tụ nên nhanh chóng bị bất hoạt và Nếu không đông tụ, thủy phân bởi protease - thử lại Bền nhiệt: to = 60 C/30p vẫn trong ống nghiệm  Trong không giảm hoạt tính - nghiệm o Bước cuối cùng trong đinh danh ống nghiệm: Pứ(+): đông tụ Pứ(-): không đông tụ, hỗn hợp đồng nhất 9 Urease - Phát... không quá chuyển và bảo quản ở nhiệt độ 24h thường + Không đông mẫu nước - Mẫu đông lạnh chứa trong * Chuẩn bị mẫu: dụng cụ cách nhiệt và nhiệt độ Trong một số trường hợp bảo quản 0 - 40C không cần phải xử lý nước + Bảo quản mẫu ở trong trước khi phân tích các chỉ tiêu phòng thí nghiệm: vi sinh - Ưu tiên đến phòng thí * Pha loãng mẫu: nghiệm nên phân tích ngay 100 trích 1 mL + 9mL nước cất - Mẫu đông... nước Nước + Môi trường thạch không được giữ dưới vào môi trường làm môi trường sẽ bị vón 00C vì cấu trúc gel bị phá hủy cục và thay đổi pH VII KHỬ TRÙNG VẬT LIỆU SAU KHI NUÔI CẤY + Thủy tinh khử trùng 30 min ở nhiệt độ 30min Chương 3 Phương pháp thu nhận, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm để phân tích vi sinh vật Nước Thực phẩm + Mật độ vsv thấp + + Vsv phân bố không đều (Na2S2O3): Sodium thiosulfate... nghiệm dùng để xác định khả năng chuyển hoá các sản phẩm trung gian của quá trình oxy hoá thành indol Sản phẩm indol tạo thành được xác định nhờ phản ứng với thuốc thử p-dimethylaminobenzaldehide tạo phức hợp dạng qiunon có màu đỏ 12 Thử nghiệm KIA, TSI Thử nghiệm KIA hay TSI là thử nghiệm được thực hiện đồng thời trên môi trường KIA, TSI dùng để kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau... dương 15 Thử nghiệm ONPG Thử nghiệm dùng để xác định hoạt tính enzym -galactosidase tham gia vào quá trình lên men lactose ở vi sinh vật Môi trường thử nghiệm là ONPG broth chứa onitrophenyl-D-galactopyranoside Sản phẩm tạo thành là o-nitrophenol có màu vàng 16 Thử nghiệm MR (Methyl Red) Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo và duy trì các sản phẩm có tính... của môi trường 9 Thử nghiệm gelatinase Thử nghiệm dùng để đánh giá khả năng tiết enzym gelatinase phân giải gelatine thành polypeptid và acid amin của các đối tượng vi sinh vật 10 Thử nghiệm khả năng sinh H2S Thử nghiệm dùng để xác định khả năng phân giải các acid amin chứa lưu huỳnh (cystein, cystin, methionin) sinh H2S nhờ enzym desulfuahydrase 11 Thử nghiệm khả năng sinh idol Thử nghiệm dùng để xác... cụ lấy mẫu như thí - Nước giếng đào nghiệm vi sinh - Nước sông, suối: cho bình + Lấy mẫu ít nhất 100g cho chìm vào dòng nước và để mỗi mẫu, không được lấy mẫu hướng ngược bình lại để lấy đầy bình chứa nước + Kiểm soát điều kiện lấy - Nước hồ tĩnh: đẩy bình nước mẫu về trước để tạo dòng chảy nhân + Mẫu phải có số nhận diện rõ tạo ràng và không sử dụng các - Nước sông hồ: lấy ở giữa loại viết mực có... H2S của vi sinh vật 13 Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) Thử nghiệm dùng để kiểm tra đặc tính sử dụng enzym nitratase để khử nitrat thành nitrite và các sản phẩm khác Nitrite tạo thành sẽ được nhận biết nhờ phản ứng với sulphanilamide và N-napthylethylenediamide hydrochloride ở pH acid cho phức chất màu hồng 14 Thử nghiệm oxidase 34 Copyright © 2016 by Trương Tấn Tài Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện... Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng citrat làm nguồn carbonhydrat duy nhất của vi sinh vật Ở những chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muối amoniu Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường Simmon citrate có nguồn carbon duy nhất là citrae với sự hiện diện của chất chỉ thị màu bromothymol blue 4 Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate Thử nghiệm. .. phức đỏ 18 Thử nghiệm CAMP Phản ứng nhằm phân biệt các nhóm Streptococcus Phản ứng CAMP là thực hiện giữa nhân tố CAMP do Streptococcus nhóm B tiết ra và -hemolysin được tiết ra bởi Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính của -hemolysin gây phá vỡ hồng cầu (tan huyết) 19 Thử nghiệm tính di động Là thử nghiệm dùng để xác định đặc tính di động nhờ tiêm mao của vi sinh vật Thử nghiệm được thực hiện trên