ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM VÕ VĂN NGỌC ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LÖA CHỌN LỌC THẾ HỆ R3, R4 CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - VÕ VĂN NGỌC ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LÖA CHỌN LỌC THỂ HỆ R3, R4 CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC Chuyên ngành : Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Tâm Thái Nguyên – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố Tác giả Võ Văn Ngọc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành công trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn KTV Đào Thu Thủy (phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào), CN Nguyễn Ích Chiến, Ths Phạm Thị Thanh Nhàn (phòng thí nghiệm Di truyền học Công nghệ gen, Khoa Sinh-KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên) giúp đỡ trình hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm thầy cô giáo, cán khoa Sinh - KTNN, Ban giám hiệu trƣờng THPT Thạch Thành - Tỉnh Thanh Hoá tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn động viên, khích lệ gia đình, bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian làm luận văn Tác giả luận văn Võ Văn Ngọc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 Giới thiệu lúa 11 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 11 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học lúa 11 1.1.3 Giá trị kinh tế………………………………………………………………… 12 1.1.4 Tình hình sản xuất lúa giới Việt Nam………………………… 13 1.2 Hạn chế chịu hạn 13 1.2.1 Khái niệm về hạn…………………………………………………………… 13 1.2.2 Tác hại hạn lúa……………………………………………… 14 1.2.3 Cơ sở sinh lý, sinh hoá phân tử tính chịu hạn lúa……………… 14 1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật chọn dòng tế bào 19 1.3.1 Cơ sở khoa học chọn dòng tế bào thực vật……………………………… 19 1.3.2 Hệ thống nuôi cấy sử dụng chọn dòng tế bào soma…………………… 19 1.3.3 Các phƣơng pháp chọn dòng tế bào………………………………………… 20 1.3.4 Thành tựu nuôi cấy mô tế bào chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi…… 21 1.3.5 Đánh giá tiêu sinh lý, hóa sinh sinh học phân tử dòng đƣợc hình thành qua nuôi cấy mô tế bào………………………………………………… 22 1.4 Một số nghiên cứu gen ức chế sinh tổng hợp giberellin lúa …… 23 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 Vật liệu, thiết bị, hóa chất địa điểm nghiên cứu 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phƣơng pháp trồng theo dõi đồng ruộng…………………… 28 2.2.2 Phƣơng pháp hóa sinh……………………………………………………… 28 2.2.3 Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ……………………………………… 30 2.2.4 Đánh giá nhanh khả chịu hạn giai đoạn mạ …………………… 32 2.2.4 Phƣơng pháp sinh học phân tử……………………………………………… 33 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5 Phƣơng pháp xử lý kết tính toán số liệu 37 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………………… 38 3.1 Đặc điểm nông học dòng lúa chọn lọc hệ R3, R4 giống gốc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu nƣớc 39 3.2 Phân tích hóa sinh dòng chọn lọc 45 3.2.1 Hàm lƣợng protein, lipit đƣờng tan hạt dòng chọn lọc ……… 45 3.2.2 Đánh giá phổ điện di protein dự trữ hạt …………………………………… 46 3.2.3 Hàm lƣợng axit amin liên kết hạt……………………………………… 47 3.3 Đánh giá khả chịu hạn dòng chọn lọc hệ R4 51 3.4 Phân lập giải trình tự gen GA2ox1 ức chế sinh tổng hợp gibberellin 60 3.4.1 Kết tách chiết ADN tổng số dòng chọn lọc R4.05………………… 60 3.4.2 Nhân gen GA2ox1 kỹ thuật PCR……………………………………… 61 3.4.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chọn dòng plasmit tái tổ hợp mang gen GA2ox1…………………………………………………………… 62 3.4.4 Tách chiết plasmit tái tổ hợp………………………………………………… 63 3.4.5 Kết đọc trình tự nucleotit đoạn gen GA2ox1…………………………… 66 3.4.6 So sánh trình tự nucleotit gen GA2ox1 dòng R4.05 với giống công bố………………………………………………………………………… 66 3.4.7 So sánh trình tự axit amin dòng R4.05 với giống công bố …… 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ …………………………………………………… 72 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN………………… 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 75 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Hạt dòng chọn lọc hệ R2 giống gốc …………………… 26 Bảng 3.1 Đặc điểm nông học mức độ biến dị dòng lúa hệ R3 43 Bảng 3.2 Đặc điểm nông học dòng R4.04, R4.05 giống KD……… 44 Bảng 3.3 Hàm lƣợng protein, lipit đƣờng tan hạt dòng chọn lọc giống gốc………………………………………………… Bảng 3.4 Hàm lƣợng axit amin liên kết hạt số dòng chọn lọc hệ R4 giống gốc………………………………………… Bảng 3.5 Hàm lƣợng axit amin liên kết protein hạt dòng chọn lọc hệ R4 giống gốc…………………… …………… Bảng 3.6 Thăm dò khả tạo mô sẹ o và tái sinh của các dòng chọn lọc giống gốc……………………………………………………… 45 48 49 52 Bảng 3.7 Tỷ lệ thiệt hại giai đoạn mạ điều kiện gây hạn nhân tạo 56 Bảng 3.8 Chỉ số chịu hạn dòng chọn lọc hệ R4 58 Bảng 3.9 Thống kê nucleotit sai khác dòng R4.05 với giống công bố Genbank…………………………………………… Bảng 3.10 So sánh mức độ tƣơng đồng gen GA2ox1 dòng R4.05 với giống công bố Genbank…………………………………… Bảng 3.11 So sánh sai khác axit amin số vị tri dòng R4.05 với giống công bố Genbank……………………… … Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 66 67 69 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 27 Hình 3.1 Các dòng chọn lọc giống gốc hệ R3 (vụ mùa 2008)…………… 38 Hình 3.2 Các dòng R3.04, R3.05 Khang dân gốc (vụ mùa 2008)…………… 39 Hình 3.3 Hình ảnh điện di protein dự trữ hạt dòng chọn lọc giống gốc Hình 3.4 Biểu đồ so sánh hàm lƣợng loại axit amin không thay hạt dòng chọn lọc, giống gốc FAO………… Hình 3.5 Khả tạo mô sẹo tái sinh dòng chọn lọc giống gốc…………………………………………………………………… Hình 3.6 Tốc độ nƣớc mô sẹo dòng chọn lọc giống gốc sau xử lý thổi khô…………………………………………………………… Hình 3.7 Khả sống sót của mô sẹo sau xử lý thổi khô………………… 47 50 52 53 54 Hình 3.8 Khả tái sinh từ mô sẹo sau xử lý thổi khô……………… 55 Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thiệt hại hạn gây sau 3, 5, ngày hạn… 57 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn khả chịu hạn dòng chọn lọc hệ R4 59 Hình 3.11 Kết điện di kiểm tra ADN tổng số dòng R4.05……………… 61 Hình 3.12 Kết PCR nhân gen GA2ox1 với cặp mồi EX2-3-F EX2-3-R… 62 Hình 3.13 Sơ đồ vector pBT đƣợc cải biến từ vector pUC18…………………… 62 Hình 3.14 Kết biến nạp vector tái tổ hợp tế bào khả biến E.coli 63 DH5α Hình 3.15 Kết điện di sản phẩm colony-PCR……………………………… 64 Hình 3.16 Kết điện di plasmit tinh chứa đoạn gen GA2ox1………… 65 Hình 3.17 Điện di sản phẩm cắt plasmit tái tổ hợp enzym BamHI……… 65 Hình 3.18 Trình tự nucleotit đoạn gen GA2ox1 tách dòng đƣợc dòng R3.05 so với giống công bố Genbank………………………… Hình 3.20 Trình tự nucleotit đoạn gen GA2ox1 trình tự axit amin tƣơng ứng dòng R4.05 so với giống công bố Genbank………… Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 68 70 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D Axit 2,4 – Dichlorphenoxyacetic ABA Axit Abscisic ATPase Adenosin triphosphatase (Enzym phân giải ATP giải phóng lƣợng) ADN Axit Deoxyribose Nucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism bp base pair = cặp bazơ nitơ Sn Chỉ số chịu hạn tƣơng đối EDTA Axit Ethylene Diamin Tetraaxetic FAO Food Agriculture Orgnization (Tổ chức nông lƣơng giới) GA Axit Gibberellic HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) IPTG Isopropyl-  -D-thiogalactopyranoside IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế) Kb Kilobase LEA Late Embryogenesis Abundant protein MS Murashige and Skoog (Môi trƣờng theo Murashige Skoog) NST Nhiễm sắc thể OsGA2ox1 Gen mã hoá cho enzym GA oxidase-1 đăng ký Genbank PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) ARNase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphat SDS-PAGE Phƣơng pháp điện di gel polyacrylamid có chứa SDS TAE Tris - Acetate – EDTA SSR Simple Sequence Repeats (trình tự lặp lại đơn giản) TE Tris – EDTA TELT Tris – EDTA – LiCl – Triton X100 X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-  -D-galactosidase Tris Trioxymetylaminometan Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây lúa (Oryza sativa L.) lƣơng thực ngắn ngày thuộc họ hoà thảo có giá trị kinh tế, giá trị dinh dƣỡng cao giữ vai trò quan trọng cấu trồng nƣớc ta Thống kê năm 1998 cho thấy, nƣớc có 7362400 đất trồng lúa sản lƣợng thóc đạt 29,14 triệu tấn, bình quân suất đạt 35,58 tạ/ha [18] Tuy nhiên, lúa chịu ảnh hƣởng lớn chế độ nƣớc, điều kiện nhiệt độ nhiều yếu tố bất lợi khác môi trƣờng (mặn, phèn…) Trong yếu tố bất lợi, hạn hán đƣợc xem nhân tố làm giảm suất lúa Ở Việt Nam hàng năm diện tích lúa nƣớc bị khô hạn lên tới 0,4 triệu [17] Trong 130 triệu đất trồng lúa giới có tới 26 triệu đất bị hạn nặng gây ảnh hƣởng đến suất [3] Để nâng cao ổn định sản lƣợng lúa điều kiện khô hạn nhằm làm giảm thiểu thiệt hại hạn hán gây việc xác định chọn tạo giống lúa có khả chịu hạn trở thành vấn đề cấp thiết Để tạo đƣợc giống lúa có suất cao, phẩm chất tốt thích nghi với vùng sinh thái nông nghiệp khác đa dạng nguồn gen, nhiều nghiên cứu đƣợc thực để cải thiện giống thông qua phƣơng pháp chọn dòng biến dị soma Chọn dòng tế bào thực vật hƣớng cho cải tạo giống trồng, khắc phục hạn chế phƣơng pháp truyền thống Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tạo biến đổi kiểu gen kiểu hình, chọn lọc đƣợc dòng tế bào khác đặc điểm sinh lý, sinh hóa… theo định hƣớng ngƣời thực nghiệm Phƣơng pháp cho phép thu đƣợc dòng giống có khả chống chịu cao với điều kiện bất lợi môi trƣờng [3]; [7]; [14]; [18]; [20] Sự đời phát triển kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR, RT-PCR, RFLP, SSR, kỹ thuật tách dòng đọc trình tự gen đƣợc ứng dụng phân tích genom thực vật Các kỹ thuật sinh học phân tử đại giúp nhà nghiên cứu chọn giống phân tích đánh giá gen thực vật cách Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn