Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến cô giáo ThS Lưu Thúy Hòa, Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng Ban lãnh đạo Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng nhiệt tình bảo, giúp đỡ em nhiều tạo điều kiện thuận lợi trình thực tập Đồng thời em xin trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo cộng tác viên công tác Bộ môn thực vật, Bộ môn Hóa phân tích Trường đại học Dược Hà Nội Bộ môn Kỹ thuật di truyền Viện Di truyền nông nghiệp (thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) tạo điều kiện thuận lợi cho em thực công việc liên quan trình thực tập Cuối cùng, cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đặc biệt ba mẹ bên động viên, khích lệ suốt trình thực tập Hải Phòng, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Hùng Cường Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều dài phân đoạn nhân bản) cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotit triphotphat Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid Kb Kilobase PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa hình nhân ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Phân tích chiều dải phân đoạn ADN cắt hạn chế) SDS Sodium Dodecyl Sulphat SSR Simple Sequence Repeats STS Sequense Tagged Site TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tris Trioxymetylaminometan CTAB Cetyl trimethylammonium bromide EtBr Ethidium bromide ISSRs Inter Simple Sequence Repeats rDNA Ribosomal DNA HPLC High Performance Liquid Chromatography Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Berberin alcaloid có nhân isoquilolin (Khosla, 1992; Rastogi cộng sự, 1993) Đó hoạt chất ứng dụng từ lâu đời y học truyền thống giới để chữa bệnh nước nghèo đặc tính kháng khuẩn, nấm, đơn bào (Đỗ Huy Bích, 2006), berberin sử dụng để chống lại Staphylococcus aureus kháng kháng sinh Methicillin (Yu HH cs, 2005),… ngày có tiềm lớn điều trị bệnh phát triển hạ đường huyết (Wang Y cs 2010, Gu Y cs 2010 ), ung thư (Tang J cs 2009, Kim JB cs 2009, Pinto-Garcia L cs 2010) Trên giới xác định khoảng 150 loài thực vật bậc cao có berberin, thuộc 23 chi họ, bao gồm: Na (Annonaceae), Hoàng liên (Berberidaceae), Cải cần (Fumariaceae), Tiết dê (Menispermaceae), Thuốc phiện (Papaveraceae), Mao lương (Ranunculaceae), Cam (Rutaceae), họ chủ yếu Berberidaceae, Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae Rutaceae (Nguyễn Kim Cẩn, 2002) Họ Berberidaceae họ thực vật có hoa, bao gồm 15-17 chi thực vật có hoa Họ thuộc mao lương (Ranunculales) Họ phân bố vùng ôn đới phía bắc bán cầu (Judd cộng sự, 1999) Họ Berberidaceae chứa khoảng 570-700 loài, phần lớn (khoảng 450-600 loài) thuộc chi Berberis Các loài họ thân gỗ, bụi thân thảo có nguồn gốc từ vùng ôn đới cận nhiệt đới châu Âu, châu Á, châu Phi, Bắc Nam Mỹ (Ahrendt 1961) Ở Việt Nam, xác định có 26 loài thực vật thuộc họ khác chứa berberin Berberidaceae, Menispermaceae, Ranunculaceae, Rutaceae Papaveraceae ( Nguyễn Kim Cẩn, 2002) Trong đó, thuộc họ Berberidaceae bị khai thác triệt để để làm thuốc buôn bán thị trường Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 nước để làm thuốc (Hoàng liên, Hoàng liên ô rô,…) xuất qua Trung Quốc Điều dẫn dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên loài cho berberin Việt Nam trở thành thuốc quý ghi sách đỏ (Nguyễn Tiến Bân, 2007) Việc phân loại loài chi Berberis, Mahonia, Podophyllum họ Berberidaceae phức tạp với đặc điểm hình thái giống loài chi Sự phân biệt loài khó khăn phần trăm đa bội cao lai tạo (Cadic Decourtye 1987) Điều dẫn đến nhầm lẫn việc xác định loài thu hái, sử dụng Trên giới có nghiên cứu phân biệt loài chi mức độ phân tử số loài B asiatica Roxb, B aristata DC., B lycium Royle (Subramani Paranthaman Balasubramani cs, 2011; Vivek Tripathi cs, 2013, ), loài Podophyllum hexandrum (Md Afroz cs, 2009, Pradeep Kumar Naik cs, 2010; Akshay Nag cs, 2013) so sánh loài họ Berberidaceae (C Roß W Durka, 2006, Mehdi Rezaei cs, 2011) Việt Nam chưa có công trình nước nghiên cứu đánh giá, tư liệu hoá mức độ phân tử đa dạng di truyền tập đoàn cách sâu rộng có hệ thống Từ lý trên, việc nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền giống/loài cho berberin họ Hoàng liên mức phân tử cần thiết cấp bách để định hướng cho công tác thu thập, bảo tồn khai thác sử dụng nguồn gen địa quý cách có hiệu 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích Xây dựng phương pháp nghiên cứu tối ưu nhằm phân tích đa dạng di truyền giống/loài Hoàng liên gai (berberidaceae) Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 1.2.2 Yêu cầu + Điṇh danh xác giống/loài Hoàng liên đăc c điểm hình thái + Xác định thị đặc trưng, alen nhận dạng xác giống/loài Hoàng liên gai ưu tú + Đánh giá khác biệt di truyền giống/loài Hoàng liên gai qua việc phân tích RAPD với primer ngẫu nhiên + Mô tả quan hệ di truyền phần mềm NTSYS Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 NGUỒN GỐC PHÂN LOẠI Họ Hoàng mộc, gọi họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), họ khoảng 14-15 chi thực vật có hoa Họ thuộc Mao lương (Ranunculales) Họ chứa khoảng 570-700 loài, phần lớn (khoảng 450600 loài) thuộc chi Berberis Các loài họ loại thân gỗ, bụi thân thảo chủ yếu thường xanh Phân loại khoa học họ Berberidaceae hệ thống phân loại thực vật sau (Lê Đình Bích Trần Văn Ơn, 2007): - Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae) Liên Hoàng liên (Ranunculanae) Bộ Hoàng liên (Ranunculales) Họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) Các chi: - Achlys Berberis - hoàng liên gai (hoàng mù), hoàng mộc, tiểu bá, nghêu hoa Bongardia Caulophyllum - hồng mao thất Diphylleia - sơn hà diệp Dysosma - bát giác liên Epimedium - dâm dương hoắc Gymnospermium Jeffersonia - tiên hoàng liên Leontice - mẫu đan (đơn) thảo, không nhầm với loài hoa mẫu đơn Mahonia - hoàng liên ô rô, thổ hoàng liên, thổ hoàng bá Nandina - nam thiên trúc Podophyllum - Podophyllum tonkinense bát giác liên Vancouveria 2.2 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ HỌ CỦA HOÀNG LIÊN GAI 2.2.1 Đặc điểm chung họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 Hoàng liên gai loại cỏ nhiều năm, bụi gỗ nhỏ, thừờng xanh rụng Thân có gai Lá đơn hay kép, mọc so le, đối mọc gốc Lá kèm có không Gân hình lông chim hình chân vịt Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 3, mọc thành cụm đơn độc Cụm hoa dạng chùm, bông, tán, xim, chùy Hoa có cuống không Lá bắc có không Đài 6-9, thường dạng cánh hoa, rời, xếp 2-3 vòng Tràng 6, rời Tuyến mật có không Nhị 6, đối diện tràng; bao phấn ô, mở van nứt dọc Bầu trên, nhìn bên có noãn; noãn nhiều, 1, đính noãn mép gốc; vòi nhụy có không, tồn Quả mọng, nang đại Hạt nhiều, nội nhũ phong phú 2.2.2 Đặc điểm thực vật chi Berberis Cây bụi thường xanh rụng Thân cành trơn nhẵn có lông măng, có rãnh không, có gai không, gai đơn chia làm 3-5 nhánh Lá đơn, mọc so le, mép có gai, nguyên hay Hoa đơn độc hay mọc thành cụm, dạng chùm, tán chùy Hoa màu vàng bóng, da cam, vàng đo đỏ, hay vàng nhạt, có vàng lục Hoa mẫu 3; bắc thường 3, sớm rụng, dạng vảy Đài 6, 9, màu vàng Tràng 6, màu vàng, móng có mật Nhị đối diện tràng; bao phấn mở van Bầu nhụy đối xứng dạng chùy; noãn 1-12, 15; vòi nhụy ngắn Quả mọng, thường màu đỏ, đỏ sẫm đen; hình cầu, hình elip, thuôn dài, hình trứng trứng ngƣợc; kích thước 6-20mm; vòi nhụy tồn không Hạt 1-10, màu nâu đến nâu đỏ đen, áo hạt (Võ Văn Chi, 2003; Ying Tsunshen, 2011) Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 Hình 2.1: Chi Berberis Ở nước ta loài Berberis phân bố chủ yếu Sapa, núi Phan-xi-păng vùng Bắc Hà thuộc tỉnh Lào Cai Cây mọc rừng kín thường xanh mưa mùa ẩm, rừng núi đá, độ cao khoảng 1000-1600m Mùa hoa tháng 5-6, mùa tháng 6-10 (Võ Văn Chi, 2003) 2.2.3 Đặc điểm thực vật chi Mahonia Cây bụi gỗ nhỏ, thường xanh, cao 0,3 – m Không gai Lá kép hình lông chim lẻ, mọc so le, không cuống có cuống; chét -4; chét bên thường không cuống, chét tận có cuống không cuống; mép nguyên hay có khía thô hay đẹp Cụm hoa mọc tận cùng, (1-) – 18 chùm đơn hay phân nhánh, dài – 35 cm, mọc đối diện với bắc Cuống hoa dài 1,5 – 24 mm, đối diện với bắc, bắc ngắn hay dài cuống hoa Hoa màu vàng, đài xếp ba vòng, cánh hoa xếp vòng, gốc cánh hoa có hay tuyến Trung đới không kéo dài, nhọn đột ngột hay kéo dài rõ ràng Bầu hình gần cầu, noãn – 7, vòi nhụy dài tới mm, 10 Đồ án tốt nghiệp Tổng Tên Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 số băng mồi/locus khuyếch đại Tổng Số số loại băng băng đa hình Số Tỉ lệ băng băng Hệ đơn đa hình PIC băng hình (%) số Kích thước OPA1 45 87,50 0,75 400-1500 OPA3 120 4 50,00 0,87 500-1700 OPA4 63 10 10 100,00 0,83 300-3500 BiO24 120 10 80,00 0,88 260-2100 OPC4 57 10 10 100,00 0,83 250-1300 OPC15 112 77,78 0,87 250-1300 OPO2 97 14 14 100,00 0,88 250-2500 OPO5 74 12 12 100,00 1,87 250-1700 OPO6 55 87,50 0,80 250-2400 OPO12 100 10 10 100,00 0,87 270-1675 OPO15 114 12 75,00 0,87 250-4000 OPO16 79 6 100,00 0,83 270-1400 OPE15 132 11 63,64 0,89 250-1500 OPE18 74 71,43 0,80 250-1300 OPH17 90 71,43 0,84 250-1500 OPN4 66 88,89 0,82 270-2100 OPN5 100 87,50 0,86 270-2500 OPN6 122 11 10 90,91 0,89 250-1500 OPN9 49 8 100,00 0,77 250-1500 OPN15 62 80,00 0,77 300-1250 OPN17 66 5 100,00 0,79 550-1500 OPN20 151 15 10 66,67 0,91 300-3000 OPK19 144 13 12 92,31 0,90 250-2500 S216 96 71,43 0,83 500-1500 S239 175 12 66,67 0,91 325-2100 S279 121 14 13 92,86 0,90 250-2500 S285 40 10 10 100,00 0,86 300-2000 S300 172 15 13 86,67 0,92 250-3000 UBC702 55 88,89 0,76 250-1000 29 2751 283 242 46 52 0,88 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 4.2.1 Kết phân tích với mồi S201 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi S201 thu tổng số 143 băng gồm loại băng có băng đa hình băng đơn hình Trên tổng số 16 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất băng ADN từ khoảng 450bp đến 1400bp Số băng ADN thu mẫu dao động từ băng đến băng Hình 4.15: Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi S201 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb Bảng 4.6:Số băng ADN thu 16 mẫu giống nghiên cứu với mồi S201 Primer S201 Band BE1BE2 BE3 MH1 MH2 MH3 MH4 MH5 MH6 MH7 MH8 MH9 MH10 MH11 PO1 PO2 1400 1 1 1 1 1 1 1 1 1200 1 1 1 1 1 1 1 1000 1 1 1 1 1 1 1 900 0 0 0 0 0 0 800 0 0 1 0 0 700 1 0 1 1 1 1 600 1 1 1 1 1 1 1 1 500 0 1 0 1 1 1 450 0 0 0 0 0 0 0 4.2.2 Kết phân tích với mồi OPO12 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPO12 thu tổng số 100 băng gồm 10 loại băng có 10 băng đa hình băng đơn hình Trên tổng số 53 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 16 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất băng ADN từ khoảng 450bp đến 1300bp Ở mẫu xuất băng cá biệt vị trí có kích thước khoảng 1000bp Số băng ADN thu mẫu dao động từ băng đến băng Sử dụng mồi OPO12 nhận biết mẫu MH5 Mahonia sp Hình 4.16: Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPO12 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb Bảng 4.7: Số băng ADN thu 16 mẫu giống nghiên cứu với mồi OPO12 Primer Band BE1BE2 BE3 MH1 MH2 MH3 MH4 MH5 MH6 MH7 MH8 MH9 MH10 MH11 PO1 PO2 OPO12 1300 1 1 1 1 1 1 1 1200 1 1 1 1 1 1 1 1000 0 0 0 0 0 0 0 900 1 1 1 1 1 1 1 800 1 1 1 1 1 1 1 700 1 1 1 0 1 0 600 1 1 1 1 1 1 1 500 1 1 0 0 0 0 0 450 1 1 1 1 1 1 1 54 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 4.2.3 Kết phân tích với mồi BiO16 Qua kết phân tích RAPD, ghi nhận 10 sản phẩm khuếch đại, với mồi BiO16 không cho sản phẩm khuếch đại giống BE1, BE2 , MH3 MH5 Hình 4.17: Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi BiO16 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb Bảng 4.8: Số băng ADN thu 16 mẫu giống nghiên cứu với mồi BiO16 Primer BiO16 Band BE1BE2 BE3 MH1 MH2 MH3 MH4 MH5 MH6 MH7 MH8 MH9 MH10 MH11 PO1 PO2 900 0 0 0 0 0 1 800 0 0 0 0 0 0 700 0 0 0 0 0 0 600 0 1 0 0 0 0 0 500 0 1 0 1 0 0 450 0 0 0 1 0 0 400 0 0 0 0 0 0 300 0 0 0 1 0 0 200 0 0 0 0 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 55 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 4.2.4 Kết phân tích với mồi S285 Trong primer, nhận thấy Primer S285 có số băng khuếch đại thấp 16 mẫu berberidaceae ,tổng số băng khuếch đại 40,số băng đa hình 10, có xuất băng đồng hình kích thước 250 Hình 4.18: Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi S285 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb 4.2.5 Kết phân tích với mồi S300 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi S300 thu tổng số 172 có tổng số loại băng cao với 15 băng có 13 băng đa hình băng đơn hình Trên tổng số 16 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất băng ADN từ khoảng 250bp đến 3000bp Hình 4.19: Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi S300 56 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb 4.2.6 Kết phân tích với mồi OPO2 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPO2 thu tổng số 97 băng gồm 14 loại băng có 14 băng đa hình băng đơn hình Trên tổng số 16 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất băng ADN từ khoảng 250bp đến 2500bp Ở mẫu xuất băng cá biệt vị trí có kích thước khoảng 500bp Số băng ADN thu mẫu dao động từ băng đến 11 băng Sử dụng mồi OPO2 nhận biết mẫu MH10 Mahonia sp Hình 4.20: Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPO2 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb 4.2.7 Kết phân tích với mồi OPO1 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPO1 thu tổng số 47 băng gồm loại băng có băng đa hình băng đơn hình Trên tổng số 16 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất băng ADN từ khoảng 450bp đến 1500bp Xuất băng đồng hình kích thước 700bp 57 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 Hình 4.21: Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPA1 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb Bảng 4.9: Bảng thống kê phân tích đa hình PCR-RAPD 16 mẫu giống Hoàng liên gai Tổng số mồi PCR 50 Tổng số mồi đa hình 29 Tổng số băng khuyếch đại 2751 Tổng số loại băng 283 Tổng số băng đa hình 242 Tổng số băng đơn hình 46 Tỉ lệ băng đa hình 85,5% Với 464 phản ứng PCR nhân lên tổng số 2751 băng ADN thuộc 283 loại băng khác (trung bình 9,8 băng/mồi), có 242 băng đa hình (85,5%) 46 băng đơn hình (14,5%) Các băng có kích thước khác dao động từ 250 bp đến 4000 bp Số băng nhân lên mồi khác Hai mồi OPN20, S300 nhân lên số băng nhiều 15 băng mồi OPN15, OPN17 nhân lên số băng băng (bảng 4.1) 58 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 Số băng đa hình cao việc thiêt lập mối quan hệ di truyền xác Một số mồi có tất băng tỷ lệ băng đa hình cao (100%), điều chứng tỏ khác vùng ADN genome loài họ Hoàng liên gai Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) coi thước đo tính đa dạng di truyền alen locus (Smith cs (1997)) Theo Weir (1996) cho rằng, giá trị PIC hiểu đa dạng di truyền locus gen nghiên cứu Qua kết thu bảng 4.1 cho thấy rằng, giá trị PIC 29 mồi RAPD dao động khoảng 0,75 - 0,91 Hệ số PIC trung bình 29 mồi 16 mẫu giống Hoàng liên gai nghiên cứu cao 0,88 cho thấy băng ADN nhân lên đa dạng 4.3 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 16 MẪU GIỐNG HOÀNG LIÊN GAI Bảng 4.10: Hệ số tương đồng di truyền 16 mẫu giống Hoàng liên gai BE BE MH MH BE MH MH MH MH MH1 MH MH MH MH1 PO 2 3 1 BE1 1,00 BE2 0,47 1,00 0,4 MH2 0,76 1,00 MH1 0,49 0,77 0,81 1,00 BE3 0,44 0,78 0,74 0,80 1,00 0,5 MH3 0,49 0,61 0,57 0,53 1,00 MH4 0,48 0,74 0,79 0,81 0,73 0,60 1,00 MH5 0,46 0,72 0,74 0,77 0,76 0,57 0,76 1,00 MH6 0,47 0,73 0,76 0,78 0,71 0,60 0,78 0,78 1,00 MH1 0,4 0,74 0,80 0,80 0,77 0,57 0,78 0,77 0,81 1,00 0,4 MH8 0,74 0,78 0,78 0,72 0,55 0,77 0,71 0,74 0,81 1,00 MH9 0,46 0,71 0,77 0,83 0,73 0,59 0,81 0,73 0,79 0,83 0,84 1,00 MH7 0,49 0,68 0,78 0,81 0,69 0,64 0,79 0,69 0,77 0,79 0,75 0,84 59 1,00 PO2 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 MH1 0,44 0,72 0,76 0,78 0,73 0,57 0,77 0,73 0,76 0,85 0,73 0,80 0,78 1,00 PO1 0,44 0,74 0,79 0,76 0,73 0,55 0,78 0,70 0,75 0,80 0,79 0,78 0,72 0,78 1,00 PO2 0,43 0,70 0,76 0,73 0,67 0,53 0,75 0,67 0,73 0,76 0,75 0,79 0,72 0,76 0,84 1,00 Kết RAPD thu gel điện di mã hóa thành dạng nhị phân phân tích phần mềm NTSYSpc để tính ma trận tương đồng cặp mẫu phân nhóm di truyền mẫu giống nghiên cứu Kết bảng 4.6 cho thấy, hệ số tương đồng di truyền 16 mẫu giống Hoàng liên gai dao động khoảng 0,43 đến 0,85 Mẫu giống BE1 (Berberis sp) PO2 (Podophyllum sp) có mức sai khác di truyền lớn (hệ số tương đồng di truyền nhỏ 0,43) Hai mẫu giống (MH10 – MH11) có hệ số tương đồng di truyền cao 0,85 Cả mẫu giống MH10, MH11 thuộc loài Hoàng liên (Mahonia sp), có chung nguồn gốc (Lâm Đồng) đứng gần phát sinh loài BE1 BE2 BE3 MH2 MH1 MH4 MH8 MH9 MH7 MH10 MH10MW MH11 PO1 PO2 MH5 MH6 MH3 0.46 0.56 0.65 Coefficient 0.75 Hình 4.22: Sơ đồ mối quan hệ di truyền mẫu giống nghiên cứu 60 0.85 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 Dựa sơ đồ hình mối quan hệ di truyền mẫu giống Hoàng liên gai cho thấy mức tương đồng khoảng 77% chia 16 mẫu giống nghiên cứu thành nhóm - Nhóm I: gồm mẫu BE1 (Berberis sp) có nguồn gốc thu thập Phan xi păng, Lào Cai Nhóm II: gồm mẫu BE2 (Berberis sp) BE3 (Berberis sp) có nguồn gốc thu thập Núi Sả séng, Lào Cai Hệ số tương đồng hai mẫu 0,78 Nhóm III: gồm mẫu MH1 (Mahonia sp), MH2 (Mahonia sp), MH4 (Mahonia sp), MH7 (Mahonia sp), MH8 (Mahonia sp), MH9 (Mahonia sp), MH10 (Mahonia sp) , MH11 (Mahonia sp) Nhóm có hệ số tương đồng dao động từ 0,75 (MH7 MH8) đến 0,85 (MH10 MH11) + Nhóm phụ 3.1: gồm mẫu MH1 (Mahonia sp), MH2 (Mahonia sp), MH4 (Mahonia sp), có nguồn gốc SaPa, Lào Cai Hệ số tương đồng nhóm dao động từ 0,79 đến 0,81 + Nhóm phụ 3.2: gồm mẫu MH7, MH8, MH9 Cả ba mẫu thuộc loài Mahonia sp có nguồn gốc thu thập Langbiang, Lâm Đồng Hệ số tương đồng nhóm dao động từ 0,75 đến 0,84 + Nhóm phụ 3.3: gồm mẫu MH10 (Mahonia sp), MH11 (Mahonia sp), có nguồn gốc thu thập Phó Bảng, Hà Giang hệ số tương đồng 0,85 Nhóm IV: gồm mẫu PO1 PO2 Hai mẫu thuộc loài Podophyllum sp thu thập Ba Vì, Hà Tây có hệ số tương đồng 0,84 Nhóm V: gồm mẫu MH5 (Mahonia sp), MH6 (Mahonia sp) hệ số tương đồng hai mẫu 0,78 Tuy nhiên, chúng có nguồn gốc thu thập khác nhau: Lào Cai (MH5) Lâm Đồng (MH6) Nhóm VI: gồm mẫu MH3 (Mahonia sp) có nguồn gốc thu thập Đèo Gió, Bắc Kạn Kết cho thấy, đa số loài chi mẫu có nguồn gốc thu thập phân nhóm có mối quan hệ di truyền gần Tuy nhiên, có mẫu MH5 (Mahonia sp), MH6 (Mahonia sp) thuộc Nhóm V có nguồn gốc thu thập khác có mối quan hệ di truyền gần 61 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 Khi so sánh loài chi, mối quan hệ di truyền loài BE1 (Berberis sp) với loài chi xa (hệ số tương đồng mẫu BE1 BE2 0,47; BE1 BE3 0,44) Mối quan hệ di truyền mẫu MH3 (Mahonia sp) với loài chi tương tự (hệ số tương đồng mẫu MH3 (Mahonia sp) với mẫu chi Mahonia dao động từ 0,550,64) Điều có ý nghĩa quan công tác lai tạo giống để chọn tạo giống bố mẹ có đặc tính ưu việt, có di truyền khác 4.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BERBERIN Kết nghiên cứu hàm lượng berberin 16 mẫu (Bảng 4.7) cho thấy hàm lượng berberin Berberis sp 1.61-3.10 % Mahonia sp 0.15 -3.98% Và riêng Podophylum sp định lượng hàm lượng berberine 0.0% Bảng 4.11: Kết hàm lượng berberin 62 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 4.5 MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC CHỈ THỊ TRỘI VÀ HÀM LƯỢNG BERBERINE Mẫu Nghiên Cứu Hàm lượng berberin(%) Mẫu Nghiên Cứu Hàm lượng berberin(%) BE1 2,32 MH5 0,46 BE2 1,61 MH6 0,40 BE3 3,10 MH7 0,151 MH1 0,91 MH8 0,24 MH2 0,52 MH9 0,7373 MH3 3,98 MH10 0,37 MH4 1,21 MH11 0,37 4.5.1 Phân tích với mồi OPN6 Với mồi OPN6 xuất băng cá biệt giếng 8(vị trí mẫu MH5) Mẫu MH5 có hàm lượng berberin 0,46 Hàm lượng mẫu hàm lượng cao (thấp so với mẫu nghiên cứu khác) hay thấp Hình 4.23: Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPN6 63 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 4.5.2 Phân tích với mồi OPE18 Với mồi OPE18 xuất băng cá biệt giếng 2(vị trí mẫu BE2) Mẫu BE2 có hàm lượng berberin 1,61 Hàm lượng mẫu hàm lượng cao (thấp so với mẫu nghiên cứu khác) hay thấp Hình 4.24: Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPE18 64 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Các mẫu nghiên cứu Việt Nam đa dạng, kết phân tích tính đa dạng di truyền 16 mẫu giống với 29 mồi RAPD thu tổng số 2751 băng ADN thuộc 283 loại băng khác (trung bình 9,8 băng/mồi), có 242 băng đa hình (85,5%) 46 băng đơn hình (914,5%) Các băng có kích thước khác dao động từ 250 bp đến 4000 bp - Sau sàng lọc ta có primer: OPO2, OPO5, OPK19, S279, S300 tiến hành phản ứng RAPD cho kết đa hình cao primer nghiên cứu - Phân tích tính đa dạng di truyền 16 giống Hoàng liên thu thâp c taị Lào Cai Lâm Đồng dựa phần mềm NTSYSpc Version 2.1, nhận thấy giống khảo sát có đa daṇg cao măṭ di truyền (mức tương đồng gen 0,43 đến 0,85), bước đầu cho thấy yếu tố vùng điạ lý không làm thay đổi nhiều măṭ di truyền môṭ giống - Sau phân tích ta thấy tính đa dạng di truyền RAPD ảnh hưởng đến xác định hàm lượng berberin mẫu 5.2 KHUYẾN NGHỊ - Kết RAPD bước đầu đánh giá sơ đa dạng di truyền mẫu nghiên cứu nên để có ngững kết luận sâu mức độ phân tử đa dạng di truyền chi: chi Mahonia; chi Berberis; chi podophylun họ Berberidaceae cần phải bố trí thí nghiệm với thị phân tử khác SSR, giải trình tự,… - Để đánh giá mối quan hệ tính đa dạng di truyền( quan hệ giống/loài cấp độ khác loài) cần phải có bố trí thí nghiệm sinh học khác liên quan tới đặc điểm sinh lý , sinh hóa, sinh thái 65 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Tiến Bân (2007), Sách đỏ Việt Nam, tập 2, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật công nghệ, tr 129-131 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1,2, NXB KHKT Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, Nhà xuất Y học, tr 224- 241 Nguyễn Kim Cẩn (2002), “Nghiên cứu chứa Berberin giới nước”, Tạp chí Dược liệu, Tập 7, số 1,2,3,4 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 1, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật, tr 440-441 Đinh Đoan Long, Nguyễn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn, Ngô Đức Phương (2009), “Sử dụng thị RAPD-PCR nghiên cứu đa hình di truyền nhằm góp phần giá trị bảo tồn hai loài thuốc ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith) ngũ gia bì gai (A.trifoliatus (L.) Merr) Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, tập 14 (1), tr 10-16 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Md Afroz Alam, Pradeep Kumar Naik, Gyan Prakash Mishra (2009) Congruence of RAPD and ISSR Markers for Evaluation of Genomic Relationship Among Populations of Podophyllum hexandrum Royle from Himachal Pradesh, India Turk J Bot, 33: 1-12 Nguyen Thi Lang (2002) Biotechnology Protocol Protocol for molecular Biotechnology Ed Nong nghiep Publisher, Ho chi minh City Vivek Tripathi and Sandhya Goswami (2013) Assessment of genetic diversity in Berberis lycium Royle complex using RAPD markers Journal of Cell Biology and Genetics, 3(1): 1-13 66 [...]... như sau: + Nhập các số liệu của bảng thống kê các band điện di sản phẩm RAPD vào bảng tính NTEDIT + Xử lý kết quả bằng NTSYS + Kết quả xử lý số liệu thể hiện ở bảng hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây 2.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.6.1 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới Trước đây, các nghiên cứu phân loại các loài trong họ Berberidaceae... đã được áp dụng để phân tích đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces.etde Not, Corynespora cassiicola Nhận di n chỉ thị phân tử: ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gen RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Nguyễn Thị Lang, 2002) Ngoài ra kỹ thuật RAPD còn được áp dụng xây dựng bản đồ gen (Nguyễn... TỔNG QUAN VỀ NHỮNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỔ BIẾN DÙNG ĐỂ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN 2.4.1 Phương pháp chỉ thị hình thái Gen - thể hiện bản chất di truyền, thường thể hiện một hay nhiều tính trạng có thể đo đếm được – gen đó xem như gen chỉ thị Chỉ thị hình thái là một trong những phương pháp sơ khai trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái hiện di n trong tự nhiên cũng rất... Ấn Độ Kết quả phần trăm các alen đa hình là 92,37 %, chứng tỏ 28 loài Podophyllum hexandrum đa dạng di truyền cao Đến năm 2010, Naik và cộng sự đã sử dụng 19 mồi ngẫu nhiên RAPD, 11 mồi ISSR và 13 cặp mồi AFLP để phân tích đa dạng di truyền của 28 loài Podophyllum hexandrum trên Kết quả cho thấy, phần trăm alen đa hình di truyền giữa các loài Podophyllum hexandrum khi sử dụng chỉ thị RAPD, ISSR, AFLP... cứu đa dạng di truyền ở Việt Nam Mặc dù việc nghiên cứu về tiềm năng di truyền thực vật ở Việt Nam được triển khai rất nhanh trong thời gian 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào các cây trồng nông nghiệp, cây hoa và một số cây lâm nghiệp Trên đối tượng cây thuốc chỉ có một số ít công trình nghiên cứu ở mức độ phân tử dựa trên chỉ thị RAPD để phân tích tính đa dạng di truyền. .. học + Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu + Phát hiện đột biến + Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử + Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm + Chọn giống vật nuôi, cây trồng + Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn + Đa dạng sinh học - Xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phương pháp di truyền phân tử - Y học - Khoa học hình sự + Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm... ra số lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kỹ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi Lượng ADN tổng số tiêu tốn cho kỹ thuật này lại rất ít Đây là một phương pháp có hiệu quả cả trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen Tuy nhiên AFLP là chỉ thị di truyền trội, do đó không thể phân biệt giữa thể đồng hợp tử và dị hợp tử, và giá thành cho nghiên cứu là tương đối cao... phân loại trước loài B Lycium (dựa vào đặc điểm hình thái) nhưng cho thấy sự đa dạng lớn trong loài B Lycium Đối với chi Podophyllum, tác giả Md Afroz Alam và cộng sự (2009) đã sử dụng chỉ thị RAPD để phân tích đa dạng di truyền của 28 loài Podophyllum hexandrum được thu thập ở độ cao khác nhau từ 1300-4300 m tại Tây Bắc khu vực Himalaya, Himachal Pradesh, Ấn Độ Kết quả phần trăm các alen đa hình là 92,37... thuật di truyền được sử dụng để nghiên cứu tính đa dạng của các loài trong họ Berberidaceae và đi tìm mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài 29 Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Hùng Cường - CNSHK13 Để xác định sự khác biệt giữa các loài xâm lấn và các loài bản địa trong chi Mahonia, tác giả C Roß and W Durka (2006) đã đưa ra 10 microsatellite cho loài Mahonia Nuttall xâm lấn và ứng dụng để khuếch đại họ hàng của. .. hiện nghiên cứu hình thái, nhiễm sắc thể và các nghiên cứu về phân tử 25 mẫu của bốn loài thuộc chi Berberis L thu thập ở tỉnh Khoanssan, Iran Kết quả cho thấy, về hình thái đã công nhận ba loài mới Berberis Bốn loài chưa biết đơn vị phân loại mới với các đặc điểm hình thái cũng đã được xác định nhưng lại để phân tích thêm vì tỷ lệ phần trăm cao đa bội và lai tạo trong chi này Sử dụng phương pháp khoảng