Viện Công Nghệ Sinh Học - Công Nghệ Thực Phẩm Viện Đào Tạo Sau Đại Học - Đại Học Bách Khoa Hà Nội TIỂU LUẬN MÔN HỌC KỸ THUẬT PHÂN TÁCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC Đề Tài: Phương Pháp Thử Hoạt Tính Chống Ung Thư Giáo viên : PGS.TS : Học viên : Nguyễn Thu Hà Trần Thị Duyền Đinh Thị Mỹ Linh Lớp : CH2014B CNSH KH Hà Nội 2014 TỔNG QUAN NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ ỨNG DỤNG TÀI LIỆU THAM KHẢO TỔNG QUAN 1.1 Ung thư • Ung thư tên chung dùng để gọi nhóm bệnh 200 loại khác gây phân chia không kiểm soát tế bào • Ung thư khó phát phát bệnh • Ung thư lành tính việc khối u không lan rộng thể Ung thư ác tính lây lan (di căn) khắp thể dẫn tới việc chữa trị trở nên khó khăn 1.2 Cơ sở phân tử bệnh ung thư • Một gen mã hóa protein kích thích sinh sản bị đột biến và trở nên hoạt động bất thường, dẫn đến tế bào có thể sinh sản vô hạn (bất tử) Một gen mã hóa sản phẩm ức chế sinh sản bị đột biến bất hoạt, dẫn đến không còn sự kiểm soát sinh sản của tế bào khối u Các gốc tự ung thư: Các tác nhân gây ung thư rất đa dạng: các hợp chất amino, hydrocacbon đa vòng; thực phẩm biến chất, bức xạ… Tuy bản chất rất khác nhau, các tác nhân kể có bản chất chung là sinh gốc tự R* theo các chế khác Đám gốc tự R* tấn công chuỗi DNA tạo các chất hư hỏng của DNA, tạo NST sai lệch, ghép nhầm các base chép gây nên đột biến gen - Nhiều hợp chất thiên nhiên sử dụng cách hiệu việc điều trị, phòng ngừa ung thư cách làm tế bào ung thư phát triển kém, hay yểm trợ tối đa để mạng lưới tế bào phòng vệ ( loại thực bào) truy lùng huỷ diệt tế bào ung thư từ đầu - Các hợp chất có hoạt tính việc chống ung thư: Curcumin, Catechin, Allicin, Sulforaphane , Selen, β- Glucan… Lycopene chống ung thư tuyến tiền liệt Catechin chữa ung thư da, bao tử, lách, phổi Sulforaphane chống ung thư gan, dày Allicin chữa bệnh ung thư dày, ung thư tử cung PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ 2.1 khái niệm Khảo nghiệm sinh học ( Bioassay): thử nghiệm thiết kế để phân tích tác động Sinh học hợp chất cách sử dụng hệ thống sinh học phù hợp 2.2 Phương pháp: >> Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư (phương pháp sinh học phương pháp dược học) Tế bào ung thư in vitro được nuôi cấy theo phưon̛ g pháp của Skehan et al (1991) [1] Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư được xác định theo phưon̛ g pháp SRB Likhiwitayawuid et al [2] Thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất SRB là thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện với các phận tích điện dương của protein tế bào Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein của tổng số tế bào Nguyên tắc: Phần trăm kìm hãm phát triển tế bào tính toán dựa số liệu đo mật độ quang học OD máy quang phổ Kết so sánh với chất đối chứng có hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư thử nghiệm Giá trị IC50 < 20μg/ml coi đạt chuẩn với chất chưa tinh khiết, Giá trị IC50 < 4μg/ml coi đạt chuẩn với chất tinh khiết, - ODcontrol(-) giá trị thu giếng thử có môi trường nuôi cấy mà tế bào - ODcontrol(+) giá trị thu giếng thử có môi trường nuôi cấy chứa tế bào không xử lý với mẫu cặn dịch chiết Giá trị IC50 tính dựa kết số liệu phần trăm kìm hãm phát triển tế bào phần mềm máy tính table curve Vật liệu: - Phân đoạn dịch chiết chứa hoạt chất (mẫu thử) - Các dòng tế bào ung thư - Môi trường nuôi cấy tế bào Phương pháp: - Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu nuôi cấy môi trường nuôi cấy phù hợp thành phần cần thiết khác - Điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối) Tuỳ thuộc vào đặc tính dòng tế bào, thời gian nuôi cấy chuyển khác Tế bào phát triển pha log sử dụng để thử độc tính Tiến hành: - Các dòng tế bào cho vào đĩa 96 giếng (mỗi giếng chứa 2x103 tế bào) cho chất cần thử (ở chất chiết từ thực vật với nồng độ pha theo thang 10) hòa tan DMSO Sau đĩa nuôi tủ CO2 37 ºC ngày Tỷ lệ phần trăm sống sót tế bào thị màu SRB (sulforhodamine B) đọc máy đọc ELISA (ELISA reader) bước song 450 nm - Hoạt tính gây độc tế bào tính phần trăm ức chế so sánh mật độ quang học giếng xử lý với mẫu nghiên cứu với giếng không xử lý với mẫu thử Nồng độ ức chế 50% (IC50) suy từ đường cong phát triển tế bào nồng độ chất thử (phần trăm sống sót so với nồng độ chất thử) 3.Ứng dụng VÍ DỤ : THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ CÂY MẴNG CẦU XIÊM (ANNONA MURICA L.) HỌ ANNONACEAE Cây mãng cầu xiêm thuộc chi Na (Annona), Họ Na (Annonaceae) Ở nước ta Mãng cầu xiêm thường trồng để lấy quả, cây Mãng cầu xiêm đã đƣợc dùng để chữa bệnh ngoài da, giun, thấp khớp, Lá còn đƣợc sử dụng với một số công dụng nhƣ làm thuốc lợi tiểu mạnh bị phù chân (Amazonia) Thành phần hóa học: - Các hợp chất acetogenin:Acetogenin nhóm chất đƯợc tìm thấy họ Annonaceae, nhóm chất đặc trưng họ thực vật - Các hợp chất alkaloid Đến có 14 alcaloit phân lập từ Mãng cầu xiêm - Tinh dầu - Sterol - Carotenoit - Các nhóm chất khác Dịch chiết n-hexan Thử tác dụng gây độc tế bào Các dòng tế bào :Các dòng tế bào cung cấp ATCC gồm: tế bào ung thư biểu mô KB, tế bào ung thư phổi LU, tế bào ung thư vú MCF7 Tiến hành: • 200μl dung dịch tế bào pha log nồng độ 3x10^4 tế bào/ml vào giếng (đĩa 96 giếng) môi trường RPMI 1640 cho dòng tế bào MCF7, KB; môi trường DMEM cho LU-1 • Mẫu thử xử lí với tế bào nồng độ pha loãng khác cho đạt đến nồng độ cuối 128 /ml, 32 /ml, /ml, /ml, 0,5 /ml, 0,125 /ml, 0,03125 /ml, 0,0078 /ml Ủ 370C, 5% CO2 rong ngày • Giếng “điều khiển (-)” gồm môi trường tế bào, giếng “điều khiển (+) “200μl dung dịch tế bào 3x10^4 tế bào/ml không xử lý với diachj chiết nhecxan, 37oC 4h, đọc kết bước sóng 540 nm máy Nhận xét: Chất đối chứng dương Ellipticin thể hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư KB, LU, MCF7 với giá trị IC50 0,31; 0,45 0,53 μg/ml Cặn dịch n-hexan mãng cầu xiêm có tác dụng gây độc tế bào dòng tế bào thử nghiệm KB, LU MCF7 với giá trị IC50 tương ứng 0,08 μg/ml, 0,7 μg/ml 6,9 μg/ml < 20 μg/ml ( theo tiêu chuẩn Mỹ với chất chưa tinh khiết) Tác dụng cặn dịch chiết n-hexan dòng tế bào KB mạnh thể giá trị IC50 nhỏ 0,08 μg/ml < 20 μg/ml , tốt chất đối chứng Ellipticine với giá trị IC50 lớn hơn; cặn chiết có hiệu lực trung bình dòng tế bào MCF7 Ví dụ 2: thử hoạt tính tác dụng tế bào ung thư của nụ vối Việt Nam Cây vối có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Phân bố Cây vối mọc hoang và được trồng hầu hết ở khắp các tỉnh miền bắc nước ta Ngoài còn gặp ở một số nước châu Á nhiệt đới Lào, Campuchia, Trung Quốc Thành phần hóa học • Lá vối chứa rất ít tanin, alcaloit và tinh dầu, tinh dầu lá gồm nhiều thành phần đó có thành phần chính là (Z) β-ocimen,myrcen, (E) β-ocimen • Vỏ chứa triterpen nhóm olean là acid arjunolic • Nụ vối: - Flavonoid: Nụ vối chứa nhiều flavonoid, với nhiều thành phần đã được định dạng - Tinh dầu: Từ mẫu nụ vối Việt Nam, với phương pháp sắc ký khối phổ GC/MS, Nguyễn Thị Dung và cộng sự đã xác định được 55 thành phần khác có tinh dầu nụ vối, gồm các monoterpen,serquiterprn và hydrocarbon serquiterpen - Thành phần khác: ethyl galat, acid galic,acid ursolic,β-sitosterol và acid einamic Nội dung và phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu • Nghiên cứu tác dụng tế bào ung thư: cao phân đoạn EtOAc, chất phân lập Vật liệu phương pháp nghiên cứu • Nghiên cứu tác dụng tế bào ung thư – Dòng tế bào ung thư phổi: A549 – Dòng tế bào ung thư vú đã kháng adriamicin : MCF7IADR – Dòng tế bào ung thư vú đã kháng tamoxifen: MCF7/TamR – Dòng tế bào ung thư dạ dày: NCI-N87 – Dòng tế bào ung thư buồng trứng: OVCAR-8 • Đối tượng nghiên cứu: hợp chất phân lập , cao phân đoạn EtOAc • Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp Skehan SRB Tế bào được nuôi cấy đĩa 96 giếng Sau ủ, tế bào được cố định bằng acid tricloacetic, sau đó được nhuộm bằng SRB 0,4%, rửa thuốc nhuộm dư bằng acid acetic % Thôi thuốc nhuộm bằng Triz base, SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan hết, đem mẫu đo mật độ quang tại bước sóng 540nm Mật độ quan của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu Nụ vối (8kg) Ethanol 960, chiết ở nhiệt độ thường x3 lần Dịch chiết ethanol Cao đặc nụ vối + 2l ethanol 960 Cao ethnol lỏng + n-hexan(2l) x5 lần DC ethanol DC n-hexan + nước (1,5l) Cao chiết n-hexan (241,5g DC nước EtOAc (2l) x lần DC EtOAc DC nước Cao EtOAc (640g) Hình Sơ đồ thu dịch chiêt từ nụ vối THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chuẩn bị mẫu • Mẫu nghiên cứu Mẫu 1: Cao phân đoạn EtOAc Mẫu 2: Hợp chất phân lập được • Chuẩn bị mẫu: Các mẫu thử được hòa tan dung môi DMSO (dimethyl sufloxide) ở nồng độ 10mg/ml (với nồng độ ban đầu) • Môi trường nuôi cấy thích hợp là RpMI 1640 hoặc DMEM, pha thành nồng độ để thử cho nồng độ cuối cùng của mẫu thử giếng lần lượt là 100,50,25,12.5,6.25 µg/ml với mẫu và 20,10,5,2.5,1.25 với mẫu một cách tương ứng • Adriamicin – có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư được sử dụng làm thuốc đối chứng dương thí nghiệm, với liều tác dụng trực tiếp lên tế bào là 20,4,0.8,0.16 và 0.032 µg/ml Tiến hành: Các thao được tiến hành với điều kiện sạch khuẩn nghiêm ngặt o Tế bào cung cấp vào các giếng của đĩa 96 giếng, cho 180µl môi trường nuôi cấy có khoảng 5000 – 8000 tế bào/ giếng Để giếng trống làm chứng trắng o Các đĩa được ủ tủ ấm 370 , 5% CO2 24h cho tế bào ổn định, bám lên bề mặt đáy giếng o Sau 24h nuôi cấy, thêm 20µl thuốc thử và thuốc chuẩn ở các nồng độ khác vào mỗi giếng Mỗi nồng độ được lặp lại ở giếng, lắc nhẹ đĩa nuôi cấy để thuốc tan hoàn toàn môi trường o Ủ đĩa nuôi cấy 48h cho thuốc phát huy tác dụng Sau đó, đĩa tế bào được cố định bằng cách nhỏ thêm 50µl dung dịch acid tricloacetic 50% vào mỗi giếng ở 40c thời gian 1h rồi rửa nhẹ bằng nước cất và hong khô (nhiệt độ phòng) o Nhuộm SRB: Thêm 50µl SRB 0,4% vào mỗi giếng, ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng o Rửa thuốc nhuộm SRB dư thừa bằng acid acetic 1% lần sau đó để khô ở nhiệt độ phòng o Thôi thuốc nhuộm SRB mẫu bằng 100µl dung dịch triz –base 10mM/giếng, để thuốc nhuộm tan hết thì đem mẫu đo mật độ quang ở bước sóng 540nm o % tế bào sống sau đã xử lý thuốc so với chứng trắng (tế bào không được xử ký bằng thuốc) được tính theo công thức sau: 3.Kết quả - Thử kết quả độc tính của mẫu và mẫu Tác dụng ức chế ( % ) Mẫu thử Nồng độ µg/ml MCF7- TamR A549 100 OVCAR-8 NCI-N87 MCF7-ADR 66,0±1,19 63,47±4,47 72,19±2,71 65,64±1,57 79,73±5,81 32,3±6,08 41,07±4,54 42,75±1,66 47,65±6,65 51,53±2,97 I 13,87±4,73 27,02±1,42 18,23±4,34 28,06±1,47 12.5 I 1,03±0,17 11,83±0,85 9,09±2,80 16,64±6,65 6.125 I 0,24±0,04 2,39±2,55 6,48±3,56 59,6±5,45 63,49±0,35 67,63±2,38 72,15±3,45 74,36±6,75 29,6±0,50 40,43±5,06 31,41±1,98 54,23±4,49 23,21±5,41 I 9,4 ±1,82 11,44±3,51 1,33±3,94 Mẫu 1: cao phân đoạn EtOAc 50 25 20 10 I Mẫu 2: hợp chất 3,28±0,25 2.5 I I 1.25 I I I I I I I I Ghi chú /: tế bào đĩa nuôi không bị ức chế Nhận xét: cả mẫu nghiên cứu đều có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư rõ rệt với nồng độ cao nhất là 100 và 50 µg/ml với mẫu 20 và 10 µg/ml với mẫu Kết thử độc tính Tác dụng ức chế (IC50, ug/ml)" A549 OVCAR-8 NCI- N87 MCF7- ADR MCF7- TamR Mẫu 84,85 74,38 53,60 62,08 42,41 Mẫu (hợp chất flavonoid được phân lập) 20,11 16,90 16,09 10,95 17,03 0,74 0,71 1,16 21,54 0,54 Adriamicinb Bảng : Tác dụng ức chế tế bào ung thư của mẫu thử Nhận xét: - Mẫu cao phân đoạn EtOAc từ dịch chiết nụ vối có tác dụng độc cả dòng tế bào ung thư nghiên cứu với IC50 thấp nhất là 42.41 µg/ml dòng MCF7-tamR và IC50 cao nhất là 84,4 µg/ml dòng A549 - Mẫu hợp chất 1: có tác dụng độc cả dòng tế bào ung thư nghiên cứu với IC50 thấp nhất là 10,95 µg/ml dòng tế bào MCF7-ADR và IC50 cao nhất là 20,11 µg/ml dòng A549 - Hợp chất 1(mẫu 2) phân lập được và mẫu cao phân đoạn EtOAc đều có tác dụng các dòng tế bào ung thư nghiên cứu, đặc biệt là tác dụng các dòng tế bào ung thư đã kháng thuốc điều trị Adriamicinb - So sáng với mẫu chứng dương Adriamicin ở dòng tế bào MCF7-ADR, IC50 của hợp chất chỉ bằng một nửa, từ đó cho thấy tác dụng rõ rệt của hợp chất dòng tế bào ung thư đã kháng thuốc Ảnh minh hoạ Ảnh hưởng của mẫu thử lên sự phát triển tế bào ung thư TÀI LIỆU THAM KHẢO • [1] Nguyễn Tiến Bân (2000), Thực vật chí Việt Nam - Họ Na (Annonaceae), Nxb Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, tr 8, tr 316-321 • [2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội, • [3] Bộ y tế (2009), ung thư đại cương, Nhà xuất bản giáo dục Hà Nội • [4] Adeyemi, David Olawale, Komolafe, Omobola Aderibigbe, Adewole, Olarinde Stephen, Obuotor Efere Martins, Adenowo Thomas Kehinde (2009), ―Anti hyperpglycemic activities of Annona muricata (Linn)‖, Afr J Trad., CAM (1): 62 – 69 • [5] Anon., Purdue News September 1997; Purdue University, West Lafayette, IN http://www.purdue.edu/UNS/newsandphotos.html • [6] Berlowski A., Katarzyna Zawada, Iwona Wawer, Katarzyna Paradowska (2013), ―Antioxidant Properties of Medicinal Plants from Peru―, Food and Nutrition Sciences, 4, 71-77 • [7]Almudena Bermejo, Bruno Figadère, Maria-Carmen Zafra-Polo, Isabel Barrachina, Ernesto Estornell and Diego Cortes (2005), “Acetogenins from Annonaceae: recent progress in isolation, synthesis and mechanisms of action‖, Nat Prod Rep., 22, 269-303 • [8] Nguyen Thi Dung,Jung Min Kim, Sun Chul Kang (2008), “Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and the ethanol extract of Cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr and Perry buds”, Food and Chemical Toxicology Xin chân thành cảm ơn ! [...]... dụng trên tế bào ung thư của nụ vối Việt Nam 1 Cây vối có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Phân bố Cây vối mọc hoang và được trồng hầu hết ở khắp các tỉnh miền bắc nước ta Ngoài ra còn gặp ở một số nước châu Á nhiệt đới như Lào, Campuchia, Trung Quốc Thành phần hóa học • Lá vối chứa rất ít tanin, alcaloit và tinh dầu, tinh dầu lá gồm... khác: ethyl galat, acid galic,acid ursolic,β-sitosterol và acid einamic Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu • Nghiên cứu tác dụng trên tế bào ung thư: cao phân đoạn EtOAc, chất phân lập 4 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu • Nghiên cứu tác dụng trên tế bào ung thư – Dòng tế bào ung thư phổi: A549 – Dòng tế bào ung thư vú đã kháng adriamicin : MCF7IADR... MCF7IADR – Dòng tế bào ung thư vú đã kháng tamoxifen: MCF7/TamR – Dòng tế bào ung thư dạ dày: NCI-N87 – Dòng tế bào ung thư buồng trứng: OVCAR-8 • Đối tượng nghiên cứu: hợp chất phân lập , cao phân đoạn EtOAc • Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp Skehan SRB Tế bào được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng Sau khi ủ, tế bào được cố định bằng acid tricloacetic, sau đó... EtOAc (2l) x 5 lần DC EtOAc DC nước Cao EtOAc (640g) Hình 2 Sơ đồ thu dịch chiêt từ nụ vối THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1 Chuẩn bị mẫu • Mẫu nghiên cứu Mẫu 1: Cao phân đoạn EtOAc Mẫu 2: Hợp chất 1 phân lập được • Chuẩn bị mẫu: Các mẫu thử được hòa tan trong dung môi DMSO (dimethyl sufloxide) ở nồng độ 10mg/ml (với nồng độ ban đầu) • Môi trường nuôi cấy thích... ug/ml)" A549 OVCAR-8 NCI- N87 MCF7- ADR MCF7- TamR Mẫu 1 84,85 74,38 53,60 62,08 42,41 Mẫu 2 (hợp chất flavonoid được phân lập) 20,11 16,90 16,09 10,95 17,03 0,74 0,71 1,16 21,54 0,54 Adriamicinb Bảng : Tác dụng ức chế tế bào ung thư của mẫu thử Nhận xét: - Mẫu cao phân đoạn EtOAc từ dịch chiết nụ vối có tác dụng độc trên cả 5 dòng tế bào ung thư nghiên cứu với IC50 thấp... trên cả 5 dòng tế bào ung thư nghiên cứu với IC50 thấp nhất là 10,95 µg/ml trên dòng tế bào MCF7-ADR và IC50 cao nhất là 20,11 µg/ml trên dòng A549 - Hợp chất 1(mẫu 2) phân lập được và mẫu cao phân đoạn EtOAc đều có tác dụng trên các dòng tế bào ung thư trong nghiên cứu, đặc biệt là tác dụng trên các dòng tế bào ung thư đã kháng thuốc điều trị Adriamicinb... 16,64±6,65 6.125 I 0,24±0,04 2,39±2,55 6,48±3,56 59,6±5,45 63,49±0,35 67,63±2,38 72,15±3,45 74,36±6,75 29,6±0,50 40,43±5,06 31,41±1,98 54,23±4,49 23,21±5,41 I 9,4 ±1,82 11,44±3,51 1,33±3,94 Mẫu 1: cao phân đoạn EtOAc 50 25 20 10 I Mẫu 2: hợp chất 1 5 3,28±0,25 2.5 I I 1.25 I I I I I I I I Ghi chú /: tế bào trong đĩa nuôi không bị ức chế Nhận xét: cả 2 mẫu nghiên cứu đều có tác dụng... thuốc Ảnh minh hoạ Ảnh hưởng của mẫu thử lên sự phát triển tế bào ung thư TÀI LIỆU THAM KHẢO • [1] Nguyễn Tiến Bân (2000), Thực vật chí Việt Nam - Họ Na (Annonaceae), Nxb Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội, tr 8, tr 316-321 • [2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội, • [3] Bộ y tế (2009), ung thư đại cương, Nhà xuất bản giáo dục Hà Nội • [4] Adeyemi, David