1 Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo biết Linh chi dược thảo thiên nhiên xếp vào loại thượng dược Cách hàng ngàn năm, nấm Linh Chi dùng để làm thuốc, sách dược thảo nhiều triều đại Trung Quốc ghi nhận Linh Chi sử dụng làm thuốc từ lâu đời Giá trị dược liệu linh chi dược ghi chép thư tịch cổ Trung Quốc, cách 4000 năm (Zgao, J.D., 1994) Từ kinh nghiệm lưu truyền nhân gian, loài người biết sử dụng Linh chi theo nhiều cách khác Đến khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi nhà khoa học giới chứng minh tác dụng hữu ích việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi, suy nhược thần kinh… [3, 9] Hiện Linh chi không khan lúc trước người áp dụng kỹ thuật để nuôi trồng Linh chi môi trường nhân tạo ngày phát triển mạnh giới đạt đến quy mô công nghiệp Trong hai thập niên gần đây, nhà khoa học nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Singapore, Hongkong tăng cường nghiên cứu sản xuất nấm Linh Chi mở rộng hiệu sử dụng dược liệu Tại thị trường Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh nước xuất ngày tăng Nhiều sở tiến hành nghiên cứu nuôi trồng, chế biến thăm dò hoạt chất sinh học có nấm Linh chi Các thành phần hóa học có nấm Linh chi phong phú bao gồm nhóm: acid béo, steroid, alcaloid, protein, polysaccharide… [19] Trong thành phần có tác dụng dược lý quý báu, đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [2] Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa nguồn nguyên liệu cellulose dồi dào, tạo điều kiện cho nghề trồng nấm không ngừng phát triển Hiện nước có 32/61 tỉnh thành có sở nuôi trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001) [6] Dựa vào tình hình ngày phát triển ngành nấm Việt Nam cho phép môn công nghệ sinh học Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP Hồ Chí Nguyễn Vũ Duy Khanh Minh định thực đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sơi “Ganoderma lucidum” 1.2 MỤC ĐÍCH Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối nấm Linh chi 1.3 YÊU CẦU Xác định yếu tố dinh dưỡng đến tốc độ phát triển sợi nấm Linh chi Xác định yếu tố pH, xác định đường cong tăng trưởng sợi nấm Linh chi Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sợi nấm theo quy trình thực nghiệm Phân tích thành phần hoạt chất có sợi nấm 1.4 HẠN CHẾ ĐỀ TÀI Chưa khảo sát hết yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến môi trường nuôi cấy Nguyễn Vũ Duy Khanh Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 NẤM LINH CHI [2, 5, 6, 12] 2.1.1 Khái quát chung Nấm Linh chi có tên khoa học Ganoderma lucidum, người miền Bắc xưa gọi nấm lim Trong thư tịch cổ nấm Linh chi gọi với tên khác Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung… Nấm Linh chi thường phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, chúng thường phát triển giá thể gỗ mục nguyên liệu có chất sơ Hình thái thể nấm Linh chi mô tả sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt thận Mặt mũ có vân đồng tâm bóng loáng, màu vàng cam màu đỏ đậm nâu đen Mặt phẳng, có nhiều lổ nhỏ li ti, quan sinh bào tử Cuống nấm đặc cứng, sậm màu bóng loáng Giá trị dược liệu Linh chi dược ghi chép thư tịch cổ Trung Quốc, cách 4000 năm (Zgao, J.D., 1994) Trong sách “Thần nông thảo“ cách khoảng 2000 năm thời nhà Châu sau nhà dược học tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân thành “Lục Bảo Linh Chi“ thời nhà Minh với khái quát công dụng dược lý khác nhau, ứng theo màu (Lý Thời Trân, 1590) Theo Lý Thời Trân nấm Linh chi có màu khác nhau:  Xích chi (Linh chi đỏ gọi Hồng chi)  Hắc chi (Linh chi đen gọi Huyền chi)  Thanh chi (Linh chi xanh gọi Long chi)  Bạch chi (Linh chi trắng gọi Ngọc chi)  Hoàng chi (Linh chi vàng gọi Kim chi)  Tử chi (Linh chi tím) Cho đến Linh chi không giới hạn phạm vi đất nước Trung Quốc, mà mang tính toàn cầu Hiện có khoảng 250 báo nhà khoa học liên quan đến dược tính lâm sàng Linh chi công bố Nguyễn Vũ Duy Khanh Cấu trúc độc đáo Linh chi thành phần khoáng vi lượng đủ loại, số khoáng tố germanium, vanadium, crôm Chúng sử dụng nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc nhân tế bào với hàm lượng thấp Ở nước Châu Á, đặc biệt Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…, việc nghiên cứu phát triển sử dụng Linh chi công nghiệp hóa với quy mô lớn phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến bào chế dược phẩm Đồng thời nghiên cứu hóa dược hoạt chất có tác dụng dược lý phương pháp điều trị lâm sàng Ở Việt Nam, tài liệu lưu lại Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác (1720-1791) thấy đề cập đếnllinh chi Sau đó, Lê Quý Đôn khẳng định, nguồn sản vật quý đất rừng Đại Nam Trong “Cây thuốc vị thuốc Việt Nam” (1991), giáo sư Đổ Tất Lợi mô tả chi tiết trình bày đặc tính trị liệu loài nấm này, đồng thời cho loại Siêu thượng dươc 2.1.2 Vị trí phân loại [5, 7] Nấm Linh chi có vị trí phân loại thừa nhận rộng rãi nay: Ngành: Eumycota Ngành phụ: Basidiomycotina Lớp: Hymenomycetes Lớp phụ: Hymenomycetidae Bộ: Aphyllophorales Họ: Ganodermataceae Họ phụ: Ganodermoidae Giống: Ganoderma 2.1.3 Đặc điểm hình thái chu trình sống nấm Linh chi 2.1.3.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) Linh chi thuộc nhóm nấm lớn đa dạng chủng loại Từ xác lập thành chi riêng Ganoderma Karst (1881), đến tính có 200 loài ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum có 45 loài [3] Nguyễn Vũ Duy Khanh Nấm Linh chi loại nấm phá gỗ, đặc biệt thuộc Đậu (Fabales) Nấm xuất nhiều vào mùa mưa, thân gốc Ở Việt Nam Nấm Linh chi gọi nấm Lim phát miền Bắc Patouillard N.T (1890 đến 1928) Hình 2.1: Nấm Linh chi Nấm Linh chi (quả thể) nấm gồm phần cuống nấm mũ nấm (phần phiến đối diện với mũ nấm) Cuống nấm dài ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,53cm Cuống nấm phân nhánh, có uốn khúc cong queo Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, lông, phủ suốt lên mặt tán nấm Mũ nấm non có hình trứng, lớn dần có hình quạt Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng láng vecni Mũ nấm có đường kính - 15cm, dày 0,8 - 1,2cm, phần đính cuống thường gồ lên lõm Khi nấm đến tuổi trưởng thành phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm Nguyễn Vũ Duy Khanh 2.1.3.2 Chu trình sống nấm Linh chi Quả thể Đảm Sợi nấm song nhân Sợi nấm đơn nhân Đảm bào tử đảm Phối nhân đảm Hình 2.2: Chu trình phát triển nấm Linh chi [5] 2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐẶC TÍNH DƯỢC LÝ CỦA NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) Các phân tích G-Bing Lin chứng minh thành phần hóa dược tổng quát nấm Linh chi sau : [18] Nước: 12 – 13% Cellulose: 54 – 56% Lignine: 13 – 14% Lipid: 1.9 – 2.0% Monosaccharide: 4.5 – 5.0% Polysaccharide: 1.0 – 1.2% (chống hoạt động khối u, tăng sức đề kháng hệ miễn dịch cho thể) Sterol: 0.14 – 0.16% Protein: 0.08 – 0.12% Thành phần khác: K, Zn, Ca, Mn, Na, khoáng thiết yếu, nhiều vitamin, amino acid, enzyme hợp chất alcaloid Nguyễn Vũ Duy Khanh Từ năm 1980 đến nay, phương pháp đại: phổ kế UV (tử ngoại), IR (hồng ngoại), phổ kế khối lượng - sắc ký khí (GC – MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân đặc biệt kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) phổ kế plasma (ICP), xác định xác gần 100 hoạt chất dẫn xuất nấm Linh chi [2] Bảng 2.1: Các hoạt chất sinh học dẫn xuất nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) [19] Thành phần hoạt chất ARN **(Không xác định) ** Adenosine Beta – D - glucans Nhóm chất Nucleic acid Alkaloid Glycoprotein Nucleotide Polysaccharide Hoạt tính dược lý Kích thích hệ miễn dịch Chống virút Loại mô nấm Bào tử Bổ tim Quả thể Ức chế khối u Quả thể Tăng lưu thông máu Thư giản cơ, giảm đau Chống khối u Kích thích hệ miễn dịch Giảm lượng đường huyết Quả thể Quả thể Bổ tim Chống dị ứng Ganoderic Acids Triterpenoid Bảo vệ gan Ức chế tổng hợp Quả thể cholesterol Ganodermadiol Adenosine Beta – D -glucans Triterpenoid Nucleotide Giảm huyết áp Ức chế ACE Tăng lưu thông máu Thư giản cơ, Giảm đau Chống khối u Polysaccharide Kích thích hệ miễn dịch Tăng sản suất kháng thể Nguyễn Vũ Duy Khanh Quả thể Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm Uridine, Uracil Nucleoside Cyclooctasulpher Phục hồi dẻo dai Hệ sợi nấm Chống dị ứng Hệ sợi nấm Chống dị ứng quang phổ Ling Zhi – Protein Ganodosterone Steroid Bảo vệ gan Hệ sợi nấm Triterpenoid Bảo vệ gan Hệ sợi nấm Ganoderic Acids Ganodermic Acid T –O Oleic Acid Triterpenoid Acid béo Điều hoà huyết áp Ức chế tổng hợp cholesterol Chống dị ứng Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm Năm 2001, Masao Hattori ly trích 10 triterpene mới, bao gồm lucidumol A B, ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y R Trong kiểu Lanostane triterpene có thành phần lipophilic Có khoảng 130 hợp chất ly trích từ thể, hệ sợi bào tử nấm Linh chi Thành phần hàm lượng triterpene phụ thuộc vào nguồn giống, yếu tố môi trường Vai trò triterpene có ý nghĩa quan trọng phòng chống bệnh HIV [22] Hàng loạt nghiên cứu Shufeng Zhou chứng minh polysaccharide triterpene nấm Linh chi có khả chữa trị bệnh viêm gan mãn tính Ganopoly ức chế trình dịch mã ADN polymerase virút gây bệnh HBV, ngăn chặn hoạt động virút Ngoài polysaccharide triterpene tác động hữu hiệu việc điều trị bệnh đái đường loại (type II diabetes mellitus) cho bệnh nhân [14] Năm 1994, Lin Zhibin Lei Lin Sheng xác định trọng lượng phân tử Polysaccharide từ G.lucidum khoảng 7.100 – 9.300 Những tổng kết vai trò sinh dược học nhóm polysaccharide loài nấm Linh chi giới thiệu Hội thảo Bắc Kinh với báo cáo tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa kỳ Nguyễn Vũ Duy Khanh He, Y et al (1992) khảo cứu BN3B - gồm polycaccharide đồng có hoạt tính tăng miễn dịch Trong BN3B1 xác định glucan (chỉ chứa glucose) BN3B3 arabinogalactan mang liên kết glycoside Hikino, H.et al từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyết nhiều polysaccharide Đó heteroglycan có hoạt tính chống ung thư Các ganoderan B có tác dụng làm tăng mức insuline huyết tương, giảm sinh tổng hợp glycogen giảm hàm lượng glycogen gan Đây sở trị liệu bệnh nhân đái tháo đường Các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u tăng tính miễn dịch Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm phương pháp dung hợp Protoplast chủng G.lucidum với G.applanatum, chí với nấm hương (Lentinus edodes), qua tăng cường hoạt tính chống khối u sarcom 180 phức polysaccharide – protein lên đáng kể Lei L.S Lin L.B (1993) chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – (Interleukine-2) hoạt tính ADN polymerase chuột già tuổi polysaccharide, soi sáng thêm khả trẻ hóa, tăng tuổi thọ nấm Linh chi Những nghiên cứu polysaccharide không tan nước chứng tỏ hiệu lực chống khối u rõ, chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ loài G.lucidum G.applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993) [2] Có lẽ đa dạng có tác dụng dược lý mạnh nhóm Saponine, triterpenoide acid ganoderic Vai trò chất chủ yếu ức chế giải phóng histamine, ức chế Angiotensine Conversino emzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp Cholesterol hạ huyết áp [2, 3, 19] 2.3 KHẢ NĂNG CHỮA BỆNH CỦA NẤM LINH CHI Linh chi dùng thượng dược khoảng từ 4000 năm Trung Quốc người ta chưa thấy tác dụng xấu hay độc tính Linh Chi Chúng khẳng định nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc nhân tế bào Nguyễn Vũ Duy Khanh 10 Tài liệu cổ nói tương đối cụ thể khả trị liệu nấm Linh chi Lý Thời Trân (1595) Theo tác giả loại Linh chi loại có đặc tính riêng Bảng 2.2: Lục bảo Linh chi tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590) Tên gọi Màu sắc Thanh chi Xanh Hồng chi Đỏ Hoàng chi Vàng Bạch chi Trắng Hắc chi Đen Đặc tính dược lý Vị chua, tính bình, không độc chủ trị sáng mắt, bồ gan khí an thần, tăng trí nhớ Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡng tim, bổ trung, chữa trị tức ngực Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần ích tì khí Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông mũi, an thần, chữa ho nghịch Vị mặn, tính bình, không độc, trị chứng bí tiểu Theo cách diễn đạt truyền thống người phương Đông, tác dụng lớn nấm Linh chi sau: [1, 7, 8] - Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn) - Bảo can (bảo vệ gan) - Cường tâm (thêm sức cho tim) - Kiện vị (củng cố dày hệ tiêu hoá) - Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp) - Giải độc (giải tỏa trạng thái dị cảm) - Trường sinh (tăng tuổi thọ) Qua phân tích hoạt chất mặt dược lý sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy Linh chi có tác dụng với số bệnh: Đối với bệnh tim mạch: Nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định huyết áp Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng nhiều huyết áp ổn định Đối với người suy nhược thể, huyết áp thấp nấm Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh dưỡng Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh Chi có tác dụng giảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao máu, làm giảm hệ số sinh bệnh Nấm Linh chi làm giảm xu kết bờ tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ Nguyễn Vũ Duy Khanh 31 4.2.1.2 Ảnh hưởng hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối môi trường lỏng KH2PO4 nguồn cung cấp kali photphat cho nấm Nguồn kali đóng vai trò làm đồng yếu tố (cofactor), cung cấp cho loại enzym hoạt động Đồng thời đóng vai trò cân khuynh độ (gradient) bên tế bào Nguồn phosphate tham gia tổng hợp ATP, acid nucleic, phospholipid màng Vì tiến hành khảo sát hàm lượng KH2PO4 thích hợp cho môi trường nuôi cấy sinh khối nấm Linh chi Thí nghiệm bố trí nghiệm thức, nghiệm thức chai, chai chứa 20ml môi trường Bảng 4.2: ảnh hưởng KH2PO4 đến tốc độ tăng trưởng Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 Môi trường nuôi cấy PG + 0,5g/l KH2PO4 PG + 1g/l KH2PO4 PG + 1,5g/l KH2PO4 PG + 2g/l KH2PO4 Khối lượng (g/20ml) 0,322 0,475 0,449 0,364 khối lượng sinh khối (g/20ml) 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 NT1 NT2 NT3 NT4 Nghiệm thức Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối Nhận xét : Dựa biểu đồ 4.2 nhận thấy tăng hàm lượng KH2PO4 lên dần lượng sinh khối tăng Mặt khác, hàm lượng KH2PO4 sử dụng vượt mức chịu đựng tế bào nấm lượng sinh khối thu giảm Lượng sinh khối thu cao Nguyễn Vũ Duy Khanh 32 0,475 g/20ml lượng KH2PO4 g/l Khi lượng KH2PO4 g/l lượng sinh khối thu dược thấp 0,322 g/20ml 4.2.1.3 Ảnh hưởng hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối môi trường lỏng Glucose có chứa nguồn cacbon dùng để tổng hợp nên chất: hydratcacbon, amino acid, acid nucleic, lipid… cần thiết cho phát triển nấm Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn cacbon cung cấp lượng cho trình trao đổi chất Đối với loài nấm khác nhu cầu cacbon khác Thí nghiệm khảo sát hàm lượng Glucose ảnh hưởng tới tốc dộ tạo sinh khối sợi nấm Linh chi trẹn môi trường lỏng Thí nghiệm bố trí nghiệm thức, nghiệm thức chai, chai chứa 20ml môi trường Bảng 4.3: Ảnh hưởng Glucose đến tốc độ tăng trưởng Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Nguyễn Vũ Duy Khanh Môi trường nuôi cấy P + 10 g/l Glucose P + 15 g/l Glucose P + 20 g/l Glucose P + 25 g/l Glucose P + 30 g/l Glucose Khối lượng (g/20ml) 0,389 0,414 0,435 0,247 0,215 Khối lượng sinh khối (g/20ml) 33 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Nghiệm thức Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối Nhận xét: Dựa vào biểu đồ ta thấy tăng hàm lượng Glucose lên sinh khối tăng theo đến giá trị Glucose = 20g sinh khối thu 0,4345g, Hàm lượng Glucose tăng lượng sinh khối thu giảm Vậy hàm lượng Glucose = 20g giá trị tốt cho môi trưởng lỏng nuối cấy sinh khối Kết luân : Dựa vào kết ghi nhận hàm lượng MgSO4= 3g, KH2PO4 = 1g, glucose = 20g hàm lượng sinh khối phát triển nhiều Như môi trường lỏng bổ sung hàm lượng khoáng chất ta thu lượng sinh khối đạt giá trị cực đại 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA PH LÊN MÔI TRƯỜNG CẤY Hầu hết môi trường nuôi cấy có pH tối thích cho trình phát triển giống Sự tăng giảm pH (chính tăng giảm H+) môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến phát triển hệ sợi tơ nấm Linh chi Chúng tiến hành cấy giống chai thuỷ tinh 100ml, chứa lượng môi trường 20ml Trước hấp trùng, ta chỉnh pH môi trường mẫu Nguyễn Vũ Duy Khanh 34 giá trị : pH =3,5 ; pH =4; pH =4,5; pH =5; pH =5,5; pH =6,8; pH =7 Sau tiến hành cấy giống cách gắp hạt lúa cho vào chai Bảng 4.4 : Ảnh hưởng pH lên tốc độ tạo sinh khối Linh Chi pH TN 3,5 0,193 0,111 0,152 Khối lượng sinh khối (g/20ml) TB 0,225 0,241 0,233 4,5 0,348 0,290 0,319 0,333 0,366 0,349 5,5 0,344 0,386 0,365 6,8 0,346 0,336 0,341 0,278 0,270 0,274 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 3,5 4,5 5,5 6,8 pH Biểu đồ 4.4: Ảnh hưởng pH lên tăng sinh khối Ganoderma lucidum Nhận xét Dựa vào biểu đồ nhận thấy sinh khối tơ nâm có khả tăng trưởng tốt khoảng pH = 5,5 Khi nuôi cấy mô trường có pH = 3,5 khối lượng sinh khối thấp 0,152 g/20ml Sinh khối tăng dần theo giá trị pH, tăng giá trị pH 6,8 sinh khối giảm 0,341 g/20ml giảm dần pH = điều kiện nuôi cấy Kết luận Nguyễn Vũ Duy Khanh 35 Như chọn giá trị pH = 5,5 giá trị pH tối thích cho phát triển tơ nấm với lượng sinh khối cao đạt 0,365 g/20ml 4.4 ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM LINH CHI Quá trình sinh trưởng tơ nấm phải trải qua giai đoạn: giai đoạn thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn cân giai đoạn già cỗi Trong thí nghiệm này, tiến hành nuôi cấy sinh khối trong chai nhỏ 100ml, chứa 20ml môi trường PG + MgSO4 + KH2PO4 Điều chỉnh pH 5,5 sau đem hấp trùng Mỗi lần cấy gắp hạt lúa cho vào chai Khoảng thời gian lấy mẫu cách ngày Mẫu sấy khô 500C - 600C sau cân ghi nhận số liệu Bảng 4.5: Khối lượng sinh khối nấm Linh chi thay đổi theo thời gian nuôi cấy môi trường lỏng Thời gian (ngày) 12 15 18 21 TN NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY LẦN 0,114 0,167 0,254 0,533 0,751 0,814 0,754 LẦN 0,144 0,148 0,319 0,451 0,809 0,863 1,009 TB 0,129 0,158 0,286 0,492 0,780 0,839 0,881 Nguyễn Vũ Duy Khanh Khối lượng sinh khối (g/20ml) 36 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 12 15 18 21 Ngày Đồ thị 4.1: Đường cong sinh trưởng Ganoderma lucidum Nhận xét Đường cong sinh trưởng yếu tố quan trọng trình nuôi cấy sinh khối sợi nấm Linh chi Dựa vào đồ thị ta biết xác khoảng thời gian sinh khối phát triển mạnh nhất, lúc sinh khối ổn định lúc sinh khối bắt đầu già Từ đường cong sinh trưởng nhận thấy : • Trong ngày đầu, tơ nấm thích nghi với môi trường, sinh khối tăng lên • Đến ngày thứ 12, sinh khối phát triển không nhanh, tơ nấm chuyển sang màu vàng • Từ ngày 12 đến ngày 15, sinh khối phát triển vượt bậc • Từ ngày 15 trở sinh khối tăng chậm, tơ nấm từ vàng nhạt chuyển sang màu vàng đậm 4.5 TỐI ƯA HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LỎNG NUÔI CẤY HỆ SỢI GANODERMA LUCIDUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM Chúng xác định điền kiện tối ứa để thu sinh khối cực đại, tiến hành tối ưa háo thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp qui hoặch thực nghiệm tiến hành sau : Nguyễn Vũ Duy Khanh 37 Xét k=3 nhân tố ảnh hưởng dến phát triển nấm (Glucose, KH2PO4, MgSO4) thí nghiệm lặp lại lần Hàm mục tiêu Y sinh khối Ganoderma lucidum Bảng 4.6 : Mức biến thiên nhân tố sinh trưởng Các yếu tố (g/l) Các mức Mức sở Khoảng biến thiên Mức Mức Trong x1 x2 x3 3,0 0,5 3,5 2,5 1,0 0,2 1,2 0,8 20 22 18 x1 : Hàm lượng MgSO4 bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l) x2 : Hàm lượng KH2PO4 bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l) x3 : Hàm lượng glucose bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l) y1 : Khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum lần lặp thứ (g/20ml) y2 : khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum lần lặp thứ (g/20ml) y3 : khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum lần lặp thứ (g/20ml) Ytb : khối lượng trung bình sinh khối Ganoderma lucidum lần lặp lại (g) Bảng 4.7 : kết thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm Số TN x1 x2 x3 3,5 2,5 3,5 2,5 3,5 2,5 3,5 2,5 1,2 1,2 0,8 0,8 1,2 1,2 0,8 0,8 22 22 22 22 18 18 18 18 ∑ S2 = GTT = f = K-1=2 => Gtb = => GTT< Gtb Nguyễn Vũ Duy Khanh y1 0,165 0,170 0,170 0,166 0,175 0,191 0,176 0,158 Y2 0,167 0,171 0,174 0,181 0,176 0,170 0,192 0,180 Y3 0,172 0,177 0,176 0,180 0,18 0,179 0,190 0,181 Ytb 0,168 0,173 0,173 0,176 0,177 0,180 0,187 0,173 38 4.6 XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) 4.6.1 Định tính alkaloid • Thử nghiệm Cho dịch chiết bột tơ nấm Linh chi đỏ tác dụng với thuốc thử Mayer thuốc thử Dragendoff ống : dịch chiết tơ nấm Linh chi đỏ + thuốc thử Dragendoff ống 2: dịch chiết tơ nấm Linh chi đỏ + thuốc thử Mayer Hình 4.5: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer Dragendoff Kết Dựa kết thử nghiệm ta thấy Ống 1: Khi dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendoff dung dịch chuyển sang màu nâu kết tủa Ống 2: Dịch chiết có màu vàng nhạt, xuất kết tủa trắng • Thử nghiệm Nguyễn Vũ Duy Khanh 39 Hình 4.6: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer Dragendoff Kết Ống 1: xuất màu vàng kết tủa Ống 2: màu đục xuất kết tủa với hàm lượng Nhận xét: Dịch chiết nấm Linh chi đen phần đem thử nghiệm với loại thuốc thử Mayer Dragendorff nhận thấy kết dương tính Đối với dịch chiết phần đem thử nghiệm kết âm tính: Bột dược liệu trích với nước – acid: trích hết tấc alcaloid dạng baz tự (N biến thành NH+ tan nước), alcaloid dạng thứ cấp N+, dạng N – oxid (N+ -> O), dạng glycosid, alcaloid loại có tính phân cực mạnh, trích hợp chất có chứa nitơ (protein, glycoprotein, nucleotide)… hợp chất alcaloid cho kết dương tính với thuốc thử Bột dược liệu trích với dung môi hữu – kiềm không trích alcaloid dạng N – oxid, dạng N tứ cấp, dạng tan tốt nước Phương pháp trích tốt alcaloid dạng baz tự có tính phân cực tính baz yếu, alcaloid có cấu trúc đặc thù –C=C –N – Kết luận: hoạt chất alcaloid có tơ nấm Linh chi đỏ với hàm lượng thấp nên phương pháp định tính không thấy đươc sư diện chúng 4.6.2 Định tính saponin 4.6.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt Nguyễn Vũ Duy Khanh 40 Hình 4.7: thử nghiệm tính tạo bọt từ sinh khối nấm Lnh chi Kết quả: Độ bền bọt Kết Sau 15 phút + Sau 30 phút ++ Sau 60 phút +++ Độ bền bọt bền vững sau 60 phút Như dược liệu từ sinh khối có chứa hoạt chất saponin 4.6.2.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel Ống 1: dịch chiết sau cho acid vào Ống 2: dịch chiết sau cho bazo vào Hình 4.8: Thử nghiệm saponin toàn phần theo Fontan – Kaudel Kết Bọt ống nghiêm bền 15 phút, bọt ống nghiệm cao gấp lần cột bọt ống nghiệm Như vậy, môi trường kiềm bọt bền môi trường acid Sơ kết luận có saponin steroid Nguyễn Vũ Duy Khanh 41 4.6.3 Định tính triterpenoid Hình 4.9: Định tính triterpenoid phản ứng Liebermann – Burchard Kết thí nghiệm nhận thấy sinh khối thể nấm Linh chi có chứa hoạt chất triterpenoid (môi trường chuyển sang màu xanh lục sau cho acid H2SO4 đậm đặc vào từ từ) Ống 1(đối chứng): nước cất + acid Ống 2: Dịch chiết + acid đậm đặc 4.6.4 Định tính acid hữu Hình 4.10 : Định tính acid hữu có thể Linh chi Sau cho dịch chiết nước bột tơ thể nấm Linh chi đỏ tác dụng với tinh thể Na2CO3 hơ nóng nhận thấy có bọt khí xuất bay Như vậy, dịch chiết nước từ tơ nấm Linh chi đỏ có chứa hàm lượng thành phần acid hữu 4.6.5 Định lượng polysaccharide từ sinh khối nấm Linh chi Nguyễn Vũ Duy Khanh 42 Tiến hành ly trích polysaccharides từ 10 gam nấm Linh chi sấy khô theo qui trình thí nghiệm Sau trình lọc sấy khô thu nhận 0.3144 gam polysaccharide thô Như hàm lượng polysaccharide thô có thể nấm Linh chi đỏ đạt khoảng 0.31% Hình 4.11 : hình ảnh polysaccharide kết tủa sau lọc Phần 5: KẾT LUẬN Nguyễn Vũ Duy Khanh 43 5.1 KẾT LUẬN Môi trường lỏng với hàm lượng glucose (18g), KH2PO4 (0,8g), MgSO4  (3.,5g) thích hợp cho sinh khối Ganoderma lucidum đạt dược hiệu suất cao  Với giá trị pH= 5,5 sinh khối phát triển tốt  Thời gian thua hoạch 14 ngày  Sinh khối hệ sợi (GAnoderma lucidum) có chứa thành phần hóa học: Saponine, saponin triterpenoid, acid béo hàm lượng polysaccharide thô ly trích sinh khối nấm Linh chi khoảng 0,31% 5.2 ĐỀ NGHỊ Vì thời gian thực đề tài có hạn nên chưa thể nghiên cứu đầy đủ nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum), đề nghị nghiên cứu thêm về: Khảo sát sâu tác dụng số khoáng chất khác thành phần hóa học, tác dụng dược lý, lâm sàng Nhằm hoàn thiện quy trình nuôi cấy môi trường lỏng ứng dụng ngành dược ngành sản xuất trà thảo dược Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Vũ Duy Khanh 44 Tài liệu tiếng việt Đoàn Sáng, 2003 Linh chi nguyên chất bệnh thời Nhà xuất Y học, Hà nội, Việt nam Lê Xuân Thám, 1996 Nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điển hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà nội, Việt nam Lê Xuân Thám, 1996 Nấm Linh chi - dược liệu quí việt nam Nhà xuất mủi cà mau Lê Duy Thắng, 2001 Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Lân Dũng, 2001 Công nghệ nuôi trồng nấm, tập Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Hữu Đống, 2003 Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Hữu Đống Đinh Xuân Linh, 2000 Nấm ăn nấm dược liệu - công dụng công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Hà nội Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn Zani Federico, 2002 Cơ sở khoa học công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền Nuyễn Ánh Tuyết, 2003 Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM 10 Nguyễn Phước Nhuận, 2001 Giáo trình sinh hoá học, phần Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM 11 Trần Hùng, 2004 Phương pháp nghiên cứu dược liệu Đại học Y Dược TP.HCM 12 Trần Văn Mão, 2004 Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Tài liệu tiếng anh Nguyễn Vũ Duy Khanh 45 13 Steyaert R.L, 1972 Species of Ganoderma and related genera mainly of the boyor and leiden herbaria National de Beigique, Burxelle 14 Shufeng Zhou, A clinical Study of a Ganoderma lucidum extract in patients with type II diabetes mellitus Division of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Science, Auckland University, Auckland, New Zealand 15 Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou, 2001 Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature Froc Int Symposium Ganoderma Sci, Auckland 16 Yihuai Gao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of Ganoderma polysaccharides Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,00-00 17 Zhaoji – Ding, 1980 The Ganodermataceae in chine Berlin Shiffigart Tài liệu internet 18 http://www.About Lingzhi.htm 19 http://www activeCompoundsReishi.html 20 http://www Biomed~1.htm 21 http://www.bfa-ernaehrung.de/Deutsch/Information/pflanzenstoffe/artikel3.pdf 22 http://www Mushroom Information Gano HIV.mht 23 http://203.162.44.79/khcn/magazine/Tap7/So6/06.htmđnh5 Nguyễn Vũ Duy Khanh [...]... cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum Nhận xét Đường cong sinh trưởng là một yếu tố quan trọng trong quá trình nuôi cấy sinh khối sợi nấm Linh chi Dựa vào đồ thị ta biết chính xác được khoảng thời gian nào sinh khối phát triển mạnh nhất, lúc nào sinh khối ổn định và lúc sinh khối bắt đầu già đi Từ đường cong sinh trưởng chúng tôi nhận thấy : • Trong 6 ngày đầu, tơ nấm thích nghi với môi trường, sinh khối. .. 0,414 0,435 0,247 0,215 Khối lượng sinh khối (g/20ml) 33 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Nghiệm thức Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng của Glucose đến tốc độ tăng sinh khối Nhận xét: Dựa vào biểu đồ ta thấy khi tăng hàm lượng Glucose lên thì sinh khối tăng theo đến giá trị Glucose = 20g thì sinh khối thu được 0,4345g, Hàm lượng Glucose càng tăng thì lượng sinh khối thu được càng... đến tốc độ tăng sinh khối Nhận xét : Dựa và biểu đồ 4.2 chúng tôi nhận thấy khi tăng hàm lượng KH2PO4 lên dần thì lượng sinh khối tăng Mặt khác, khi hàm lượng KH2PO4 sử dụng vượt quá mức chịu đựng của tế bào nấm thì lượng sinh khối thu được giảm Lượng sinh khối thu được cao nhất là Nguyễn Vũ Duy Khanh 32 0,475 g/20ml khi lượng KH2PO4 là 2 g/l Khi lượng KH2PO4 là 1 g/l thì lượng sinh khối thu dược thấp... màu vàng nâu, chính giữa khối nội chất tụ lại dạng giọt dầu có màu nhạt hơn Kích thước bào tử khoảng 8 – 11 x 6 – 8 µm Hình 4.2 : Cấu trúc bào tử nấm Ganoderma lucidum 4.2 SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) 4.2.1 Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm Ganodrma lucidum trên các môi trường lỏng 4.2.1.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối nấm Linh chi trong môi... PG + 4 g/l MgSO4 Khối lượng (g/20ml) 0,178 0,346 0,466 0,379 khối lượng sinh khối (g/20ml) 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 NT1 NT2 NT3 NT4 Nghiệm thức Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của MgSO4 lên tăng sinh khối Nhận xét: Dựa vào biểu đồ 4.1 chúng tôi nhận thấy khi sử dụng MgSO4 ở mức 1g/l thì sinh khối phát triển chậm nhất và khi tăng dần hàm lượng MgSO4 lên 3g/l thì lượng sinh khối thu được cao... ngày thứ 12, sinh khối phát triển nhưng không nhanh, tơ nấm dần dần chuyển sang màu vàng • Từ ngày 12 đến ngày 15, sinh khối phát triển vượt bậc • Từ ngày 15 trở đi sinh khối tăng rất chậm, tơ nấm từ vàng nhạt chuyển sang màu vàng đậm 4.5 TỐI ƯA HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LỎNG NUÔI CẤY HỆ SỢI GANODERMA LUCIDUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM Chúng tôi xác định điền kiện tối ứa để thu được sinh khối cực đại,... gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng Tiến hành thu nhận sinh khối sau 9 ngày Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô Thí nghiệm được thực hiện với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 2 chai Vậy tổng số chai cấy là 14 chai 3.4.4 Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi trên môi trường lỏng PG Nguyễn... : Ảnh hưởng pH lên tốc độ tạo sinh khối của Linh Chi pH TN 3,5 0,193 0,111 0,152 Khối lượng sinh khối (g/20ml) 1 2 TB 4 0,225 0,241 0,233 4,5 0,348 0,290 0,319 5 0,333 0,366 0,349 5,5 0,344 0,386 0,365 6,8 0,346 0,336 0,341 7 0,278 0,270 0,274 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 3,5 4 4,5 5 5,5 6,8 7 pH Biểu đồ 4.4: Ảnh hưởng của pH lên sự tăng sinh khối của Ganoderma lucidum Nhận xét Dựa vào biểu... tăng sinh khối của Ganoderma lucidum Nhận xét Dựa vào biểu đồ trên chúng tôi nhận thấy sinh khối tơ nâm có khả năng tăng trưởng tốt trong khoảng pH = 5,5 Khi nuôi cấy trong mô trường có pH = 3,5 thì khối lượng sinh khối thấp nhất 0,152 g/20ml Sinh khối tăng dần theo giá trị của pH, nhưng khi tăng giá trị pH 6,8 thì sinh khối giảm 0,341 g/20ml và giảm dần cho đến pH = 7 trong cùng một điều kiện nuôi cấy... nhận sinh khối ở các ngày 3, 6, 9, 12, 15, 21 Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50 oC và tiến hành cân trọng lượng khô Trong quá trình thí nghiệm, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 2 chai Tổng số chai cấy là 10 chai 3.5 PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 3.5.1 Mục đích Tìm điều kiện tối ưu để thực hiện các quá trình hoặc chọn lựa thành phần tối ưu của nhiều phần tử trong quá trình nuôi cấy vi sinh