1 giáo dục đào tạo Trờng Đại học Vinh -*** - trần thị thu huyền Tỏch v xỏc nh hm lng Cloramphenicol mu thc n nuụi tụm Chuyên ngành: hoá vô Mã số : 60 44 25 Luận văn thạc sĩ hoá học Mục lục Trang Lời cảm ơn Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Đặt vấn đề Chng Tổng quan 1.1 Phơng pháp sc ký lng cao áp 1.1.1.Nguyên lý 1.1.2.Các dạng sắc ký lỏng hiệu cao 1.1.3.Máy sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.Cloramphenicol 11 1.2.1 Cu to v tính cht .11 1.2.2 iu ch v ng dng 15 1.2.3 Tác động Cloramphenicol ngời thủy sản nuôi .16 1.2.4 Cloramphenicol thc phm 17 1.2.5 Các phng pháp phân tích Cloramphenicol 18 Chng K thut thc nghim 26 2.1 Hoá cht, thit b, dng c thí nghim .26 2.2 K thut sc ký lng cao áp vi thit b HPLC 27 2.3 K thut chun b mu 28 Chng Kt qu v tho lun 31 3.1 Các thí nghiệm nh tính ca Cloramphenicol 31 3.2 Tách v xác nh hàm lợng Cloramphenicol thit b HPLC 31 3.2.1 nh hng ca tc dòng 31 3.2.2 nh hng ca thnh phn dung dch pha ng 32 3.2.3 nh hng ca nhit ct tách 32 3.2.4 nh hng ca phng pháp x lý mu .33 3.2.5 Kt qu xác nh Cloramphenicol mu thc n nuôi tôm 33 Chơng 4: Kết luận đề xuất .37 Tài liệu tham khảo 38 Phụ lục .42 danh mục Các ký hiệu chữ viết tắt CAP :Cloramphenicol CAP-TMS :cloramphenicoltrimetylsilyl CODEX : Uỷ ban tiêu chuẩn hoá thực phẩm quốc tế FDA : Food and Drug Administrantion( Cục quản lý Thực phẩm Dợc phẩm Mỹ) GC: Sắc ký khí GC-MS: Sắc ký khí khối phổ HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao HSTH: Hiệu suất thu hồi HSTHTB: Hiệu suất thu hồi trung bình KTSVQN:Kỹ thuật sóng vuông quét nhanh LOD: Giới hạn phát LOQ: Giới hạn định lợng / giới hạn xác định MeOH: Metanol MS: Sắc ký khối phổ MSTFA: N-metyl-N(trimetyl silyl) trifluoro axetamit tt/tt: thể tích/thể tích kl/tt: khối lợng/thể tích đặt vấn đề Trớc đòi hỏi ngày cao lơng thực thực phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngời giới ngày gia tăng, ngời đứng trớc thử thách lớn phải cách tăng suất, sản lợng trồng vật nuôi nhng giữ đợc môi trờng sạch, cân sinh thái Để đạt đợc mục đích trên, ngời phải tăng cờng áp dụng tiến khoa học kĩ thuật vào sản xuất nh tạo giống trồng cho suất cao, ngắn ngày, chống chịu đợc sâu bệnh; tạo giống vật nuôi có sức đề kháng cao, phát triển nhanh Việc sử dụng thuốc kháng sinh cho thủy sản đợc coi vũ khí có hiệu cao ngời việc phòng chống dịch hại bảo vệ vật nuôi trớc phát triển nhanh chóng nhiều loại bệnh nguy hiểm với tốc độ lây lan nghiêm trọng Bên cạnh u điểm bảo vệ vật nuôi trớc công dịch bệnh, kháng sinh gây nhiều tác động khác nh gây ô nhiễm môi trờng, gây độc cho ngời sinh vật xung quanh hồ nuôi, làm tăng chi phí sản xuất, để lại tồn d thủy hải sản gây ảnh hởng đến chất lợng sản phẩm nh sức khỏe ngời tiêu dùng Tác động tiêu cực thuốc kháng sinh trở nên nghiêm trọng ngời sử dụng không yêu cầu kĩ thuật hay lạm dụng thuốc kháng sinh An toàn thực phẩm đóng vai trò quan trọng chiến lợc bảo vệ sức khỏe khỏe Việc dảm bảo vệ sinh, an toàn thực phẩm làm giảm bệnh tật, tăng cờng sức lao động mà góp phần phát triển kinh tế, văn hóa xã hội, giữ uy tín thơng hiệu sản phẩm hàng hóa xuất khẩu, uy tín quốc gia, thể quan tâm phủ ngời dân Thực phẩm an toàn thực phẩm không chứa tồn d hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, với loại hóa chất đợc phép sử dụng lợng tồn d không đợc vợt mức cho phép, không chứa nấm mốc, mầm bệnh, vi sinh vật, kim loại nặng gây ảnh h- ởng đến sức khỏe ngời Tồn d hóa chất, kháng sinh thực phẩm gây nhiều hậu xấu cho sức khỏe ngời, môi trờng sinh thái, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng Theo tống kê y tế, từ năm 1997 đến 2000, riêng vụ ngộ độc thực phẩm phải cấp cứu 1391 vụ, gây ngộ độc cấp tính 25.509 ngời 217 ngời chết Năm 2001 xảy 227 vụ ngộ độc thực phẩm (có 30 vụ ngộ độc hàng loạt, bình quân 30 ngời/vụ) với tổng số 3814 ngời bị ngộ độc 63 ngời tử vong Các vụ ngộ độc hóa chất nguyên nhân chủ yếu hóa chất bảo vệ thực vật, thuốc chuột rau d kháng sinh tồn d thủy hải sản Tôm loại vật nuôi có giá trị kinh tế cao có giá trị xuất lớn nhng d lợng kháng sinh có tôm yếu tố hạn chế giá trị lọai thủy sản này.Vấn đề d lợng kháng sinh ảnh hởng đến uy tín chất lợng tôm xuất Việt Nam làm giảm thị phần xuất tôm Việt Nam sang thị trờng nớc thị trờng khó tính va có kiểm định nghiêm ngặt nh Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản Đã có lô hàng xuất bị trả tồn d kháng sinh cao mức cho phép Hiện Việt Nam cha có chơng trình quốc gia kiểm soát d lợng kháng sinh thủy sản nuôi, nhiều nớc khu vực giới áp dụng thành công chơng trình Cloramphenicol loại kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng khả phân tán tốt vào mô thể Cloramphenicol bị lạm dụng cho vào thức ăn gia súc, thức ăn thủy sản, thuốc thú y Cloramphenicol vào thể ngời đờng ăn uống Việc sử dụng kháng sinh bị giới hạn tiềm gây thiếu máu bất sản Chơng trình kiểm soát d lợng hóa chất độc hại thủy sản nuôi khuyến cáo cloramphenicol ảnh hởng đến hệ thống miễn dịch ngộ độc, gây ung th Vì FDA,CODEX khuyến nghị cloramphenicol không đựơc phép tồn d thực phẩm Tồn d cloramphenicol tôm có nguyên nhân chủ yếu từ nguồn thức ăn nuôi tôm đặc biệt thức ăn tôm chứa lợng cloramphenicol tơng đối lớn tôm đối tợng dễ bị nhiễm bệnh Việc xác định hàm lợng cloramphenicol mẫu thức ăn thủy sản cụ thể thức ăn nuôi tôm đóng vai trò quan việc kiểm soát d lợng kháng sinh thực phẩm thực phẩm xuất Với lý chọn đề tài luận văn là: Nghiên cứu xác định hàm lợng cloramphenicol mẫu thức ăn nuôi tôm Nội dung luận văn nhằm giải nhiệm vụ sau: -Nghiên cứu tính chất hoá học, vật lý phơng pháp định tính cloramphenicol -Nghiên cứu quy trình chiết pha rắn để làm làm giàu cloramphenicol mẫu thức ăn nuôi tôm -Nghiên cứu quy trình định lợng cloramphenicol phơng pháp HPLC chơng 1: tổng quan 1.1 Phơng pháp sắc ký lỏnG 1.1.1 Nguyên lý: Sắc kí lỏng hiệu cao phơng pháp phân tích dựa nguyên tắc Hoá lí (hấp thụ nhả hấp thụ liên tục chất hấp thụ) dựa vào hỗ trợ thiết bị dựa nguyên tắc quang điện để phát nồng độ chất phân tích Hiện tại, Việt Nam, tính tới thời điểm HPLC phơng pháp phân tích phổ biến phòng thí nghiệm hoá, phòng thí nghiệm hoá cho chuyên ngành dợc phẩm mỹ phẩm Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid ChromatographHLPC) phát triển nhanh từ năm 1960 Việc sử dụng chất nhồi có kích thớc nhỏ (5-10àm) làm cho hiệu tách phơng pháp tốt so với phơng pháp lỏng cổ điển Có thể nói cách đơn giản HPLC sắc ký cột (column chromatograph) kèm với máy dò tìm (detector) nhạy để pháp đợc chất tách trình chạy sắc ký Với tiến kĩ thuật cột, máy dò tìm (detector) chuyển sắc ký cột thành phơng pháp phân tích có tốc độ nhanh hiệu suất cao Loại cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao lên khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lu lợng vài mililit/phút qua cột tách Lợng mẫu phân tích HPLC cần khoảng 20àl Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) có khả tách hợp chất đặc thù nh: - Các hợp chất cao phân tử ion thuộc đối tợng nghiên cứu y học, sinh học Các hợp chất tự nhiên không bền Các hợp chất bền nhiệt, chất dễ nổ Các hợp chất gồm có: nucleotit, axit amin, đờng, polisacarit, sắc tố thực vật, axit hữu cơ, lipit không phân cực phân cực, chất màu, dợc phẩm, chất hoạt động bề mặt, vitamin, kháng sinh, Điều khác biệt HPLC GC phơng pháp HPLC, mẫu cần làm hoà tan mà không cần làm bay hơi, HPLC phân tích đợc chất mà không sợ gây phân hủy nhiệt trình phân tích 1.1.2 Các dạng sắc ký lỏng hiệu cao: a Dạng trao đổi ion: Pha tĩnh rắn (IEC) chứa nhựa trao đổi ion dới dạng bột mịn thờng chất hữu mang nhóm hoạt động khác nhau: cation để tách kim loại kiềm kiềm thổ, amonium, amin anion, để tách anion vô cơ, phosphate hữu cơ.pha động thờng dung dịch nớc b Dạng HPLC phân bố hiệu suất cao: Sử dụng pha tĩnh pha động có độ phân cực khác Nếu pha tĩnh không phân cực pha động phân cực đợc gọi dạng sắc ký đảo pha (Reverse Phase chromatography) dạng tách đợc thành phần không phân cực nh hydrocacbon có phân tử khối lớn 1000, vitamin tan dầu, anthraquinon, Dạng sắc ký pha thuận tách hợp chất có ancol, amin, Gồm hai loại: sắc kí lỏng-lỏng sắc kí pha liên kết -Sắc kí lỏng-lỏng(LLC): pha tĩnh chất lỏng đợc bao bề mặt hạt chất mang,tức đựơc hấp phụ chất mang -Sắc kí pha liên kết(BPC): pha tĩnh đợc gắn hóa học với chất mang tạo liên kết siloxan nối nhóm silic với silicagen c Sắc kí hấp phụ hiệu suất cao(sắc kí lỏng-rắn LSC) Pha tĩnh chất rắn mà bề mặt có chứa nhóm hidroxyl phân cực pha động dung môi không phân cực d.Sắc kí lỏng hiệu suất cao gel(sắc kí loại cỡ SEC) Phơng pháp đợc ứng dụng chủ yếu cho chất có phân tử lợng lớn Chất nhồi cho SEC hạt xốp silicagel hay polime có kích thớc nhỏ(khoảng 10àm) Pha tĩnh dung môi nàm lỗ xốp hạt, pha động dung môi chảy hạt Chỉ phân tử nhỏ khuyếch tán vào lớp xốp, rửa giải phân tử lần lợt theo cỡ từ lớn đến nhỏ 1.1.3.Máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC): Máy HPLC gồm có phận nh sau: Hệ thống cung cấp dung môi Bơm cao áp trộn dung môi Hệ thống đa mẫu vào cột Cột sắc ký Detectơ Hệ thống ghi nhận tín hiệu xử lí kết 10 - Sơ đồ nguyên tắc máy sắc ký lỏng hiệu cao nh sau: - Bình chứa dung môi; - Bơm cao áp; - Bộ bơm mẫu; - Cột sắc ký; - Detector; - máy ghi tín hiệu a Hệ thống cung cấp dung môi bơm cao áp: +Bình chứa dung môi: Bình chứa thuỷ tinh, làm thép không gỉ, phơng pháp rửa giải thông thờng cần bình chứa dung môi, phơng pháp rửa giải gradien thờng dùng 2,3,4 bình chứa dung môi khác hệ dung môi rửa giải hỗn hợp loại dung môi trộn lẫn với theo tỉ lệ đợc xác định Cần loại hạt khí hoà tan dung môi +Hệ thống bơm: Dung môi pha động đợc bơm cao áp hút đẩy pha động vào cột với áp 30 Để xác định hàm lợng CAP mẫu thức ăn tôm cần phải xử lý mẫu bơm vào máy HPLC Dựa vào đờng chuẩn diện tích peak đo đợc ta tính đợc hàm lợng CAP Phơng pháp xác định CAP xác ta sử dụng phơng pháp thêm Tức thêm lợng xác CAP vào mẫu đo Nếu khoảng thời gian lu mà ta nghi ngờ peak CAP diện tích peak tăng tơng ứng thêm CAP ta khẳng định đợc peak nghi ngờ peak xác CAP mẫu đo Trong luận văn khảo sát việc xác định hàm lợng CAP mẫu thức ăn tôm Đồng thời xác định hiệu suất thu hồi CAP phơng pháp sau: Chuẩn bị mẫu thức ăn tôm có mẫu trắng mẫu lại cho lợng xác CAP lần lợt : 0,03g; 0,05g; 0,07g Đo hàm lợng CAP HPLC 2.3.Kỹ thuật chuẩn bị mẫu -Nguyên tắc xử lý mẫu: Tách chất phân tích CAP khỏi tạp chất vào dung môi phân cực etyl axetat Loại chất béo chiết lỏng với n-hexan Làm giàu làm mẫu 31 phép chiết pha rắn -Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu để đo máy HPLC Trong chuẩn bị mẫu 50,0 g thức ăn tôm, xay nhỏ Mẫu 1: không cho thêm CAP Mẫu 2: thêm 0,01 g CAP Mẫu 3: thêm 0,3 g CAP Mẫu 4: thêm 0,4 g CAP Thêm 40 ml etyl axetat nghiền trộn kỹ siêu âm 15 phút Lọc lấy dịch hữu phễu lọc Buchner Cất cô chân không đến gần khô (còn gần ml) Hòa tan phần lại ml metanol thêm 10 ml dung dịch salin 4% Chiết hai lần, lần 15 ml n-hexan phễu chiết Sau chiết với 15 ml etylaxetat làm lần, loại bỏ pha nớc Cất cô chân không pha hữu đến gần khô Hòa tan mẫu lại ml dung dịch MeOH:H2O 80:20 -Tiến hành chiết pha rắn: Rửa cột pha rắn silicagel ml metanol, sau luyện cột ml nớc Cho mẫu qua cột, điều chỉnh chân không để tốc độ dòng chảy cỡ 1,5 ml/phút Hút cho khô cột vài phút Rửa 10 ml MeOH:H 2O 5:95(tt/tt) Rửa giải tách CAP ml MeOH:H2O 80:20, thu đợc mẫu phân tích 32 Ta biểu diễn quy trình chuẩn bị mẫu theo sơ đồ sau: Mẫu Chơng 3: Nghiền xay kết Etyl axetat ( 40 ml) thảo Siêu âm luận Lọc Bucner 3.1.Các thí Cât cô đuổi dung môi nghiệm Metanol định tính Dung dịch salin 4% Dịch n - hexan (để loại chất béo) Chiết lấy pha nước Etyl axetat Dịch chiết hữu Cất cô chân không Dung dịch mẫu Chiết pha rắn Mẫu bơm vào HPLC cloramphenicol: Thí nghiệm 1: Xác định điểm chảy CAP Kết là: Từ 149 đến 1530C Thí nghiệm 2: Hòa tan viên thuốc Cloramphenicol ml etanol 50%(tt/tt), thêm 10 ml dung dịch CaCl 1% 50 mg bột kẽm, đun nóng cách thủy 10 phút Lọc dung dịch nóng để nguội Thêm 0,1 ml benzoyl clorua lắc phút Thêm 0,5 ml dụng dịch sắt (III)clorua 10,5% ml cloroform, lắc Lớp nớc có màu đỏ tím nhạt đến đỏ tía Thí nghiệm 3: Lấy viên thuốc Cloramphenicol 250mg vào chén sứ, thêm 33 10g natri cacbonat khan, đốt 10 phút, để nguội Hoà tan cặn ml dung dịch acid nitric 2M, lọc Lấy ml dịch lọc, thêm ml nớc Dung dịch phải cho phản ứng A ion clorit Cụ thể dùng dung dịch AgNO để nhận biết ion Cl- có kết tủa trắng xuất hiện: Ag+ + Cl- =AgCl Thí nghiệm 4: Lấy viên thuốc Cloramphenicol 250 mg hòa tan vào etanol cho dung dịch FeCl3 thấy có kết tủa xuất Thí nghiệm 5: Lấy viên thuốc Cloramphenicol 250 mg hòa tan vào etanol, cho bột kẽm cho dung dịch FeCl thấy xuất dung dịch màu vàng đậm 3.2.Tách xác định hàm lợng CAP thiết bị HPLC 3.2.1 nh hng ca tc dòng Tốc độ dòng dung môi phải nhỏ ml/phút với áp suất cực đại lớn 200 bar nhỏ 10 ml/phút với áp suất cực đại nhỏ 200 bar Tốc độ dòng ảnh hởng lớn đến thời gian lu mẫu ảnh hởng đến chiều cao peak tơng ứng Ví dụ: Khi nghiên cứu định lợng CAP đặt tốc độ dòng 0,8ml/phút thời gian lu thờng gần phút tốc độ dòng 0,7 ml/phút thời gian lu gần phút Nh tốc độ dòng lớn thời gian lu nhỏ Trong thí nghiệm luận văn hệ thống HPLC cài đặt tốc độ dòng là: 0,7 ml/phút 3.2.2 nh hng ca thnh phn dung dch pha ng Thành phần dung dịch pha động ảnh hởng lớn đến kết phân tích Trong thí nghiệm xác định hàm lợng CAP phơng pháp HPLC luận văn dùng pha động MeOH/H2O 60/40 Nếu tỉ lệ pha động không đợc tuân thủ nghiêm ngặt có tác dụng 34 không tốt đến đối xứng peak ảnh hởng lớn đến thời gian lu Ví dụ : Cũng phép xác định CAP máy HPLC nhng dùng pha động metanol 100% cho peak đối xứng thời gian lu 2,272 phút nhng dùng pha động MeOH/H2O = 60/40 cho peak đối xứng thời gian lu gần phút 3.2.3 nh hng ca nhit ct tách Nhiệt độ cột tách có ảnh hởng đến trình phân tích ảnh hởng đến chuyển động nhiệt phần tử mẫu co giãn cột khí hậu khắc nghiệt Nghệ An, nhiệt độ ban ngày ban đêm có chênh lệch lớn Hiện máy sắc ký đại có trang bị thiết bị điều nhiệt, ta cài đặt nhiệt độ cho máy suốt thời gian phân tích Vì vậy, thiết bị HPLC đại kết phân tích bị ảnh hởng nhiệt độ Trong thí nghiệm luận văn hệ thống HPLC cài đặt nhiệt độ là: 300C 3.2.4 nh hng ca phng pháp x lý mu Mỗi giai đoạn xử lý mẫu ảnh hởng đến kết phân tích Nhất quy trình xử lý mẫu phức tạp nh phơng pháp HPLC Trong quy trình xử lý mẫu không tuân thủ bớc quy trình chuẩn gây sai số lớn cho kết phân tích Việc thêm dung môi vào để thực trình chiết quan trọng tỉ lệ dung môi thứ tự đem dung môi vào mẫu Trong phơng pháp xử lý thức ăn nuôi tôm nêu bớc thực phải cẩn thận giai đoạn chiết pha rắn Nếu cho sai lợng MeOH/H2O không thu đợc CAP 35 3.2.5 Kt qu xác nh Cloramphenicol mu thc n nuôi tôm Mỗi mẫu tiến hành đo máy HPLC hai lần kết nh sau: Mẫu 1: Lần Diện tích peak Diện tích peak 6497807 6199927 trung 6497807 + 6199927 bình==6348867 Dựa vào đờng chuẩn suy nồng độ CAP thức ăn tôm 0,0226 mg/ml Vì thể tích sau chiết pha rắn ì thu đợc 2ml mẫu nên ta co thể tính đợc nồng độ CAP mẫu là: 0,02262 =0,0452 mg Vì xét 50 g mẫu thức ăn nuôi tôm nên khối lợng CAP 100 g ì 0,0452 mg2 = 0,0904 mg Nh % khối lợng CAP mẫu thức ăn nuôi tôm là: %CAP==9,04.10-5 % Mẫu 2: 0, 0904 ì103 ì 100 100 Lần Diện tích peak Diện tích peak 7467373 7339276 trung 7467373 + 7339276 bình= =7403324,5 Dựa vào đờng chuẩn suy nồng độ CAP thức ăn tôm 0,0264 mg/ml Vì thể tích sau chiết pha rắn thu đợc 2ml mẫu nên ta co thể tính đợc nồng độ CAP mẫu là: 0,0264-0,0226=0,0038 mg/ml 36 Từ suy khối lợng CAP ml mẫu là: 0,00382 = ì 0,0076 mg 0, 0076 ì100 0, 01 HSTH = = 76% Mẫu 3: Lần Diện tích peak 45753448 45654668 Diện tích peak trung 45753448 + 45654668 bình= =45704058 Dựa vào đờng chuẩn suy nồng độ CAP thức ăn tôm 0,1627 mg/ml Vì thể tích sau chiết pha rắn thu đợc 2ml mẫu nên ta co thể tính đợc nồng độ CAP mẫu là: 0,1627-0,0226=0,1401mg/ml Từ suy khối lợng CAP ml mẫu là: 0,1401 ì 2=0,2802 mg/ml HSTH = 0, 2802 ì100 0,3 = 93,4% Mẫu 4: Lần Diện tích peak 53378796 50016856 Diện tích peak trung 53378796 + 50016856 bình= =51697826 Dựa vào đờng chuẩn suy nồng độ CAP thức ăn tôm 0,1840 mg/ml Vì thể tích sau chiết pha rắn thu đợc 2ml mẫu nên ta tính đợc 37 nồng độ CAP mẫu là: 0,1840 - 0,0226 = 0,1614 mg/ml Từ suy khối lợng CAP ml mẫu là: 0,1614 = ì 0,3228 mg/ml HSTH = = 0,3228 ì100 0, 80,7% Nh độ thu hồi CAP lần xử lý mẫu là: HSTHTB = 76 + 93, + 80, = 83,37% Để xác định giới hạn phát sử dụng phơng pháp pha loãng nồng độ đến không thấy xuất peak nồng độ trớc đợc coi nồng độ nhỏ phát CAP Theo phơng pháp này, thiết bị HPLC mà nghiên cứu có giới hạn phát đến 10 -10 mg/ml Chúng lặp lại thí nghiệm lần kết thu đợc là: Lần Diện tích peak 25623 21927 18719 Chúng khảo sát độ lặp lại nồng độ 0,02 mg/ml kết thu đợc nh sau: Lần Diện tích peak 892397 895124 880589 882486 890974 Giá trị diện tích peak trung bình: Lần 10 Diện tích peak 841550 857360 865523 866629 856958 38 ==872959 xn x nn i =1 Độ lệch chuẩn: =0,176 ( xi x) Độ lệch chuẩn tơng đối: s = Sn ì1 100 x n RSD(%) = = 0,176% 3.2.Thảo luận: Quá trình thực nghiệm đợc hoàn thành với kết tốt, kết có độ xác độ tin cậy cao, sửa chữa số liệu điều đánh giá dựa vào peak thực mẫu đo Vì thời gian có hạn nên cha khảo sát đợc số phơng pháp khác để đối chứng Chơng 4: kết luận đề xuất 4.1.kết luận: Căn vào nhiệm vụ đề tài luận văn hoàn thành đợc nhiệm vụ nh sau: + Về lý thuyết: - Lý thuyết phơng pháp sắc kí lỏng cao áp - Lý thuyết chung Cloramphenicol +Về thực nghiệm: - Đã nghiên cứu đợc phản ứng định tính cloramphenicol - Đã nghiên cứu quy trình xác định hàm lợng cloramphenicol mẫu thức ăn nuôi tôm - Đã xác định hàm lợng lợng cloramphenicol mẫu thức ăn nuôi tôm: 9,04.10-5 % - Đã xác định độ lặp lại cloramphenicol mẫu thức ăn nuôi tôm nồng độ 0,02 mg/ml 39 - Đã xác định đợc giới hạn phát cloramphenicol mẫu thức ăn nuôi tôm: +Giới hạn phát hệ thống 2.10-10 +Giới hạn phát phơng pháp 4.10-10 - Đã xác định đợc độ thu hồi cloramphenicol mẫu thức ăn nuôi tôm 83,37 % 4.2.đề xuất: Với kết thu đợc luận văn này, hy vọng góp phần đánh giá lợng d thừa cloramphenicol thức ăn nuôi tôm tài liệu tham khảo I Tiếng Việt 1.N.X Acmetop (1984) Hóa học vô cơ, tập Nxb ĐH & THCN 2.A.K.Bako (1995) Phân tích trắc quang phần 1-2 Nxb Giáo dục, Hà Nội 3.Nguyễn Trọng Biểu, Mai Hửu Đua (1974) Chuẩn bị dung dịch cho phân tích hóa học Nxb KHKT Hà Nội Nguyễn Trọng Biểu, Từ Văn Mạc (2002) Thuốc thữ hữu Nxb KHKT, Hà Nội 5.F.Cotton,G, Wilicinson (1984) Cơ sở hóa vô cơ, tâp 2.NXB ĐH & THCN 6.Nguyễn Tinh Dung (2000) Hóa học phân tích, Phần III Các ph ơng phơng pháp định lợng hóa học NXB Giáo dục, Hà Nội Doeffel (1983) Thống kê hóa học phân tích.NXB ĐH & THCN, Hà Nội 8.Trần Thị Đà, Nguyễn Thế Ngôn(2001) Hóa học vô cơ, tập Nxb Giáo 40 dục, Hà Nội Phan Đình Châu, Nguyễn Việt Hơng, Từ Minh Koóng, Đỗ Hữu Nghị Kĩ thuật sản xuất dợc phẩm, tập Trờng Đại học Dợc Hà Nội 10.Trần Tứ Hiếu (2002) Hóa học phân tích.Nxb ĐHQG,Hà Nội 11.Từ Vọng Nghi, Huỳnh Văn Trung,Trần Tứ Hiếu(1986) Phân tích nớc NXB KHKT, Hà Nội 12.Hoàng Nhâm(2000) Hóa học vô cơ, tập II NXB Giáo dục, Hà Nội 13 Lơng Đức Phẩm (2003) Công nghệ sử lí nớc thải sinh học.NXB Giáo dục, Hà Nội 14 Hồ Viết Quý (1991) Các phơng pháp phân tích hóa lí ĐHSP Hà Nội 15 Hồ Việt Quý (1995) Phức chất phơng pháp nghiên cứu ứng dụng hóa học hiên đại ĐHSP Quy Nhơn 16 Hồ Việt Quý (1999) Các phơng pháp phân tích quang học hóa học NXB ĐHQG Hà Nội 17 Hồ Việt Quý (2000) Phức chất hóa học NXB Giáo dục, Hà Nội 18 Hồ Viết Quý, Đặng Trân Phách (dịch), Nguyễn Tinh Dung (hiệu đính) (1995) Hóa học phân tích quang học hóa học nxb ĐHQG, Hà Nội 19.Hồ Việt Quý (1994) Xử lí số liệu thực nghiệm phơng pháp toán học thống kê ĐHSP Quy Nhơn 20.Hồ Viết Quý (1998) Các phơng pháp phân tích hiên đại ứng dụng hóa học Nxb ĐHQG Hà Nội 21.Hồ Viết Quý (2005) Các phơng pháp phân tích công cụ hóa học hiên đại Nxb ĐHSP Hà Nội 22 Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phơng pháp phân tích vật lí hóa lí, Tập NXB Khoa học kĩ thuật 23 Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), ứng dụng số phơng pháp 41 phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử NXBGD Hà Nội 24.Đinh Văn Thành(2006), Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lợng vitamin D số chế phẩm Multivitamin sắc ký lỏng hiệu cao, Hà Nội 42 II Tiếng Anh 25.Hinilicova M., Sommer 4-(2-pyridilazo)- (1961) resorcinol accelerator mertic chemical indicator Col Czech Chem Comm 26, p.2198- 2205 26 Kimitoshi S, Mitsishita, Takashi G (1999) Preconcentration of trace cadmium from water sample using 4-(2- pyridilazo)- resorsinol Capriquat loaded silicagel 27 B Reanak and J Korbl (1960) Collecction of czechoslovak chemical aommunications Vol.24, N03,p 797 28 Roston D.A (1984) determination of metal ions Precolumn chelation with PAR for by liquid chromatography.Analytical Chemistry,Vol.56,p.241-244 29.Siroki M., Marie L., Stefanae Z., Herak M.J Characterization of complexes involved in the spectrophotometric determination of cobalt 4-(2pyridilazo )-resorsinol Analytical Chimical Acta,Vol.75,p110-109 30 Shabana Amin (1997) Doctor of philosophy Kinetic and thermodynamic aspects of complexation of trivalent metals (Al 3+ and Fe3+) by Maltol 31 Chen,Jiansong, Teo, Khay Chuan (2002) Determination of cadimium,copper, lead, and zinc in water samples by flame automic absortion spectrometry after cluod point extraction Analytical Chimical Acta,450 (1-2), 215-222 Chem.Abs.Vol.136,p.188,936 32 N.N Greenwood and A.Earnshaw (1998) Chemitry of the elements Buttrt worth,Heinemann,p 216-229 33 Kirk (1992) Othmer encyclopedia of chemical technology th edn, Vol.2, Aluminium and aluminium alloys, p.184-251; aluminium compuonds, p.252-345 Interscience, New York 43 34.Akio Yuchi,Tomoaki Okubo , Hiroko Wada and Genkichi NAkagawa (2006) Complexation equilibria of cadmium ions with xylenol orange as studied by cadmiumion selective electrode Analytical sciences April 1987, Vol.3, Inist CNRS 35 Chan-Il Park, Huyn-Sookim, and Ki- Woncha (1999) Separation of Fe(III) and concentration of metal ions using cation exchane resin bonder with xylenol orange Journal of the Korean Chemical Society, Vol.43, NO.6, p.401 36.Các trang web : www.hoahocvietnam.com www.hoahoc.org www.chemvn.net 44 Phần phụ lục [...]... tích peak tăng tơng ứng khi thêm CAP thì ta khẳng định đợc peak nghi ngờ là peak chính xác của CAP trong mẫu đo Trong luận văn này chúng tôi đã khảo sát việc xác định hàm lợng CAP trong mẫu thức ăn tôm Đồng thời xác định hiệu suất thu hồi CAP bằng phơng pháp sau: Chuẩn bị 4 mẫu thức ăn tôm trong đó có 1 mẫu trắng và 3 mẫu còn lại thì cho lợng chính xác CAP lần lợt là : 0,03g; 0,05g; 0,07g Đo hàm lợng... 112341 171095 226182 8 7 6 5 Dựa vào bảng kết quả trên ta thiết lập đợc đờng chuẩn nh sau: 30 Để xác định hàm lợng CAP trong mẫu thức ăn tôm cần phải xử lý mẫu và bơm vào máy HPLC Dựa vào đờng chuẩn và diện tích peak đo đợc ta sẽ tính đợc hàm lợng CAP Phơng pháp xác định CAP sẽ chính xác hơn nếu ta sử dụng phơng pháp thêm Tức là thêm lợng chính xác CAP vào mẫu đo Nếu trong khoảng thời gian lu mà ta... 2 bình==6348867 Dựa vào đờng chuẩn suy ra nồng độ CAP trong thức ăn tôm là 0,0226 mg/ml Vì thể tích sau khi chiết pha rắn ì thu đợc 2ml mẫu nên ta co thể tính đợc nồng độ của CAP trong mẫu 1 là: 0,02262 =0,0452 mg Vì xét trong 50 g mẫu thức ăn nuôi tôm nên khối lợng CAP trong 100 g là ì 0,0452 mg2 = 0,0904 mg Nh vậy % khối lợng CAP trong mẫu thức ăn nuôi tôm là: %CAP==9,04.10-5 % Mẫu 2: 0, 0904 ì103... thuật chuẩn bị mẫu -Nguyên tắc xử lý mẫu: Tách chất phân tích CAP khỏi các tạp chất vào dung môi ít phân cực etyl axetat Loại chất béo bằng chiết lỏng với n-hexan Làm giàu và làm sạch mẫu 31 bằng phép chiết pha rắn -Cách tiến hành: Chuẩn bị 4 mẫu để đo trên máy HPLC Trong đó chuẩn bị mỗi mẫu là 50,0 g thức ăn tôm, xay nhỏ Mẫu 1: không cho thêm CAP Mẫu 2: thêm 0,01 g CAP Mẫu 3: thêm 0,3 g CAP Mẫu 4: thêm... loại bỏ tạp chất, silan hóa và phân tích Tiến hành chuẩn bị mẫu theo các bớc sau để xác định độ thu hồi CAP: Lấy 5 mẫu, mỗi mẫu 5 g nghiền mịn trong đó 1mẫu trắng và 4 mẫu cho vào 1ml dung dịch CAP có nồng độ khác nhau (1ppm, 0,1ppm,0,01ppm,0,001ppm) trộn đều cho vào ống ly tâm, thêm vào 1 ml NaCl 4%, 20 ml etyl axetat, lắc trong 1 phút, ly tâm với 25 tốc độ 3600 vòng/phút trong 10 phút (lặp lại quá... ml/phút Nhiệt độ : 300C -Cho chạy đờng nền để ổn định máy -Tiêm mẫu vào máy và chờ kết quả peak Để xác định đợc hàm lợng của CAP trong mẫu ngời ta dựa vào mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích peak trên đờng chuẩn đã đợc thiết lập sẵn Để xác định đờng chuẩn ta chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn đã biết chính xác nồng độ Cụ thể ở đây chúng tôi chuẩn bị 6 mẫu rồi đo diện tích peak kết quả nh sau: Nồng độ... quan trọng nhất là tỉ lệ của dung môi và thứ tự đem dung môi vào mẫu Trong phơng pháp xử lý thức ăn nuôi tôm đã nêu mỗi bớc thực hiện phải rất cẩn thận nhất là giai đoạn chiết pha rắn Nếu cho sai lợng MeOH/H2O thì có thể không thu đợc CAP 35 3.2.5 Kt qu xác nh Cloramphenicol trong mu thc n nuôi tôm Mỗi mẫu chúng tôi tiến hành đo trên máy HPLC hai lần kết quả nh sau: Mẫu 1: Lần 1 2 Diện tích peak Diện... nitro hoá nhân thơm và amid hoá amin bậc 1 ở mạch thẳng đợc đồng phân D(-) theo: 18 1.2.3.Tác động của cloramphenicol đối với con ngời và thủy sản nuôi Cloramphenicol đợc phân lập từ môi trờng nuôi cấy Streptomyces venezuelae năm1947, do phổ kháng khuẩn rộng và khả năng phân tán tốt vào các mô cơ thể nên CAP bị lạm dụng cho vào thức ăn gia súc, thức ăn thủy sản ,thuốc thú y CAP đi vào cơ thể con ngời... 10g/l trong một cốc có chiều dày 1cm và đo ở bớc sóng xác định 20 Do vậy: A(1%,1 cm) Biết A, M ta tính đợc rồi từ đó A= cd với d=1cm , = 10 ì M tính nồng độ dựa vào phơng trình : ì tính đợc theo A(1%,1 cm) ở trên, A đo đợc ta sẽ tính đợc nồng độ c b.Nghiên cứu xác định d lợng cloramphenicol trong tôm bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm Chuẩn bị mẫu phân tích : Là 3 mẫu tôm. .. container mực trị giá hơn 2,5 tỷ đồng Nguy cơ lây nhiễm Cloramphenicol có thể từ rất nhiều nguồn khác nhau: - Từ thức ăn nuôi tôm có chứa Cloramphenicol -Từ thuốc kháng sinh Cloramphenicol ngời chăn nuôi thả xuống hồ cho 19 tôm ăn khi tôm bị bệnh -Một nguy cơ tởng chừng rất đơn giản là từ bàn tay ngời công nhân chế biến thực phẩm.Nguy cơ lây nhiễm Cloramphenicol từ kem bôi tay của công nhân chê biến để