BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG THỊ HẢI YẾN “NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG ACTINOPLANES SP VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP ACARBOSE” CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VŨ VĂN HẠNH TS ĐỒNG HUY GIỚI HÀ NỘI – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, tháng năm 2015 Tác giả luận văn Dương Thị Hải Yến Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, nỗ lực thân, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình cá nhân, tập thể trường Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Hạnh TS Đồng Huy Giới tạo điều kiện cho nghiên cứu thực luận văn Phòng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, chỉnh sửa luận văn tạo điều kiện vật tư, hóa chất thiết bị cho nghiên cứu để hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất anh chị làm việc Phòng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tận tình cho sống, học tập, làm việc môi trường hòa đồng, thân thiện thời gian vừa qua Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên ngành sống suốt thời gian học tập trường Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, tập thể lớp CH22CNSHB tất bạn bè động viên, hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2015 Tác giả luận văn Dương Thị Hải Yến Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng vi Danh mục hình, đồ thị vii Danh mục chữ viết tắt ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu đề tài Nội dung nghiên cứu đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Acarbose – thuốc điều trị bệnh tiểu dường type 2 1.1.1 Nhóm ức chế hoạt động α-glucosidase 1.1.2 Tính chất hóa học acarbose 1.1.3 Cơ chế tác dụng dược lý 1.1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất acarbose từ chủng vi sinh vật giới Việt Nam 1.2 Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose 1.2.1 Tổng quan xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm, hình thái xạ khuẩn 1.2.3 Xạ khuẩn Actinoplanes 1.3 Đột biến cải biến chủng 1.3.1 Giới thiệu đột biến 9 1.3.2 Sự cải biến chủng giới 10 1.3.3 Sự cải biến chủng Việt Nam 11 1.4 Ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả sinh tổng hợp acarbose chủng xạ khuẩn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 12 Page iii 1.4.1 Ảnh hưởng nguồn Cacbon đến khả sinh tổng hợp acarbose chủng xạ khuẩn 12 1.4.2 Ảnh hưởng nguồn Nitrogen đến khả sinh tổng hợp acarbose chủng xạ khuẩn 12 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 2.1 Vật liệu 14 2.1.1 Chủng vi sinh vật 14 2.1.2 Hóa chất 14 2.1.3 Dung dịch đệm 14 2.1.4 Môi trường 15 2.1.5 Thiết bị thí nghiệm 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phương pháp vi sinh 16 2.2.2 Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase (AG) (Yamaki K and Mori Y 2006) 17 2.2.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 18 2.2.4 Phương pháp gây đột biến NTG kết hợp với tia UV 18 2.2.5 Tối ưu môi trường lên men sản xuất acarbose 19 2.2.6 Tinh acarbose 24 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Kết đột biến sàng lọc 26 3.1.1 Tạo dòng đột biến NTG kết hợp tia UV 26 3.1.2 Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase dòng đột biến NTG kết hợp tia UV 29 3.1.3 Sắc ký đồ TLC dòng đột biến NTG + UV 31 3.1.4 Tính ổn định số dòng đột biến qua hệ 33 3.1.5 So sánh hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) trước sau đột biến 36 3.2 Tối ưu môi trường sản xuất cho hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) đạt cao 37 3.2.1 Ảnh hưởng nguồn Nitrogen đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 37 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 3.2.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 38 3.2.3 Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 39 3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)41 3.2.5 Tối ưu đa hướng yếu tố 42 3.2.6 Hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) chủng Actinoplanes môi trường trước sau tối ưu 47 3.3 Tinh chất hoạt tính ức chế α-glucosidase từ dịch lên men dòng NV45.18 48 3.3.1 Tinh qua cột trao đổi cation (amberlyst resin exchange 15R) 48 3.3.2 Xác định độ tinh hàm lượng acarbose dịch tinh 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 Kết luận 54 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 61 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Danh mục hóa chất dùng thí nghiệm 14 2.2 Các dung dịch đệm dung dịch hóa chất sử dụng nghiên cứu 15 2.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 16 3.1 Số lượng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau xử lý NTG + UV 26 3.2 Hoạt tính ức chế α-glucosidase số dòng đột biến chọn lọc 30 3.3 Sắc ký đồ TLC dòng đột biến NTG + UV 33 3.4 So sánh hoạt tính α-glucosidase (%) trước sau đột biến 36 3.5 Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 37 3.6 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 38 3.7 Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 40 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 41 3.9 Các nhân tố tối ưu 42 3.10 Các giải pháp nhận sau sử dụng phương pháp RSM- CCD Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 46 Page vi DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ STT 1.1 Tên hình Trang Cấu trúc enzyme α- glucosidase phức hợp maltose and NAD+ (http://en.wikipedia.org/wiki/Alpha-glucosidase) 1.2 Ảnh hưởng chất ức chế α-glucosidase đến trình trao đổi đường thể 1.3 Công thức cấu tạo acarbose 1.4 Hình thái xạ khuẩn 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tối ưu nguồn cacbon 19 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tối ưu nguồn nitrogen: 21 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tối ưu nhiệt độ 22 2.4 Sơ đồ thí nghiệm tối ưu pH 23 3.1 Đường cong sống sót chủng Actinoplane sp KCTC 9162 VD sau đột biến NTG kết hợp tia UV 3.2 27 Các dòng khuẩn lạc xạ khuẩn chủng Actinoplanes sp sau khoảng thời gian đột biến 28 3.3 Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ số dòng đột biến 31 3.4 Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ dòng đột biến 32 3.5 Tính ổn định sáu dòng đột biến qua hệ 34 3.6 Sắc ký đồ TLC dịch lên men lỏng từ sáu dòng đột biến qua hệ: Acarbose chuẩn 10mg/ml (C), NV45.15(1), NV45.18 (2), NV15.8 (3), NV15.5 (4), NV30.4 (5): A, B, C, D, E, F sắc ký đồ TLC dịch lên men lỏng từ dòng đột biến hệ 2, hệ 3, hệ 4, hệ 5, hệ hệ 7) 35 3.7 So sánh hoạt tính α-glucosidase (%) trước sau đột biến 36 3.8 Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 37 3.9 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 39 3.10 Ảnh hưởng pH môi trường đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 40 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 41 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii 3.12 Tương tác hàm lượng maltose pH tới khả ức chế αglucosidase (%) 43 3.13 Tương tác pepton với nhiệt độ tới khả ức chế αglucosidase (%) 44 3.14 Tương tác pepton với Maltose tới % ức chế α-glucosidase 45 3.15 Tương tác nhiệt độ với pH tới khả ức chế α-glucosidase (%) 45 3.16 Giải pháp tối ưu thực nghiệm theo mô hình RSM-CCD 46 3.17 Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men dòng NV45.18 môi trường trước sau tối ưu; C: acarbose chuẩn; 1: MT trước tối ưu; 2: MT sau tối ưu 47 3.18 So sánh hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) dịch lên men chủng NV45.18 môi trường trước sau tối ưu 48 3.19 Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men dòng NV45.18 môi trường trước đưa qua cột 49 3.20 Sắc ký đồ TLC phân đoạn acarbose từ dịch lên men dòng NV45.18 qua cột trao đổi ion dạng acid amberlyst 15R C: acarbose chuẩn; 1-18: phân đoạn 50 3.21a Phổ MS mẫu chuẩn Acabose (C25H43NO18, KLPT 645.60) từ Sigma (CAS Number 56180-94-0, EC Number 260-030-7, (Sigma) xác định dung môi methanol hệ thống LC/MS-MS-xevo TQ, ESI 51 3.21b Phổ MS Acabose tinh xác định hệ thống HPLC/MS-MS-xevo TQ, ESI 3.21c Mẫu sau sắc kí trao đổi cation amberlyst resin exchange 15R Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 52 53 Page viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ ĐTĐ Đái tháo đường NTG N-methyl-N’-nitron-nitrosoguanidine AGI α-glucosidase inhibition TLC Thin-layer chromatography RSM Response Surface Methods CCD Central Composite Design BĐT Bột đậu tương UC Ức chế CNM Cao nấm men pNP-G ρ- nitrophenyl α- D- glucopyranoside ĐB Đột biến Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ chủng xạ khuẩn tự nhiên Actinoplanes sp KCTC 9162 VD đột biến NTG kết hợp UV khoảng thời gian (15, 30, 45, 60 90 phút) đột biến khác tạo 139 dòng đột biến sàng lọc Trong có dòng đột biến NV45.18 có hoạt tính ức chế α- glucosidase (%) cao chủng gốc, cao gấp 21% so với hoạt tính ức chế α- glucosidase chủng gốc có hoạt tính ổn định qua hệ nghiên cứu Đã đánh giá thành công ảnh hưởng đồng thời nguồn Cacbon, Nitro, nhiệt độ pH đến khả sinh tổng hợp acarbose dòng đột biến chọn lọc NV45.18 sử dụng phần mềm Design- Expert ® 9.0.3 tìm điều kiện lên men tối ưu cho hoạt tính ức chế α- glucosidase cao 82.883% với hàm lượng maltose, peptone (g/l) môi trường 20, 2.449 Ở điều kiện nhiệt độ 27.5 oC, pH 7, tốc độ lắc 150 vòng/phút thời gian lên men ngày Tinh acarbose từ dịch lên men chủng đột biến NV45.18 sử dụng cột trao đổi cation (amberlyst resin exchange 15R) cho hiệu cao (hàm lượng acbose mẫu sau tinh cột đạt khoảng 95%, xác định theo HPLC) Kiến nghị Tiến hành lên men lượng lớn dòng đột biến chọn lọc NV45.18 môi trường tối ưu Hoàn thiện qui trình tinh acarbose từ dịch lên men dòng NV45.18 qui mô bán công nghiệp Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Tý (2007) "Vi sinh vật học." Nhà xuất giáo dục: Hà Nội Bùi Thị Hà (2008) "Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên." Nhà xuất Đại học Thái Nguyên Vũ Văn Hạnh, Lê Thị Thùy Dương, Quyền Đình Thi Nguyễn Thị Thu Thủy (2012) "Nâng cao độc lực diệt rệp đào chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium đột biến tia cực tín (UV) N-methyl-N'nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) nhằm sản xuất thuốc trừ sâu sinh học." Tạp chí Khoa học Công nghệ 50(2): tr 197- 209 Vũ Thi Hằng, Vũ Văn Hạnh Quyền Đình Thi (2012) "Tối ưu điều kiện tổng hợp chất ức chế alpha-Glucosidase từ Bacillus dùng cho điều trị tiểu đường." TC Y học VN 396: 149-153 Huỳnh Thị Thanh Hiền Trịnh Thị Bích Huyền (2010) "Sử dụng ma trận Plackett- Burman phương pháp đáp ứng bề mặt- thiết kế cấu trúc có tâm nhằm tối ưu hóa sinh tổng hợp Lipase từ Bacillus Licheniformis GBDTY1." Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3A): 811- 818 Mai Xuân Lương (2001) "Hóa Sinh Học." NXB Giáo Dục Bạch Hoàng Mi, Nguyễn Thị Nguyệt, Vũ văn Hạnh Đỗ Thị Tuyên (2013) "Sàng lọc tuyển chọn số chủng Actinoplanes Streptomyces sản xuất chất ức chế men α-glucosidase." Proceedings, Hội nghị KH CNSH toàn quốc 2013 Quyển 1: 383-387 Quyền Đình Thi Vũ Văn Hạnh (2011) "Tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase để điều trị bệnh tiểu đường type 2." TCCNSH Tập (4A): 729-735 Lê Đình Trung (2002) "Di truyền học." NXB Giáo Dục 10 Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Vũ Văn Hạnh Quyền Đình Thi (2011) "Sàng lọc số chủng Actinoplanes sp sinh tổng hợp cao chất acarbose có tính ức chế alpha-glucosidase." Tạp chí Công nghệ Sinh học 9: 861-865 11 Đỗ Thị Tuyên, Vũ Văn Hạnh, Vũ Thị Thu Hằng, Trịnh Đình Khá Quyền Đình Thi (2013) "Tách chiết tinh hoạt chất DNJ (1Deoxynojirimycin) ức chế α-glucosidase từ chủng B subtilis VN9 phân lập từ Việt Nam." Proceedings, Hội nghị KH CNSH toàn quốc 2013 Quyển 1: 550-554 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 12 Hồ Tuyên, Nguyễn Thị Hồng Liên Lê Gia Hy (2009) "Nghiên cứu tối ưu môi trường lên men sinh tổng hợp cephalosporin biến chủng Acremonium chrysogenum AC 880-33." Báo cáo Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc: tr.228- 231 13 Lê Uyển, Nguyễn Xuân Trường, Phan Thị Hà, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên Trần Quốc Việt (2009) "Nghiên cứu số tính chất sử dụng hóa chất gây đột biến để nâng cao hoạt tính phân giải protein protease ngoại bào vi khuẩn Bacillus sp"." Tạp trí khoa học ĐHQGHN 28: 121 - 128 14 Nguyễn Quỳnh Uyển, Nguyễn Xuân Trường, Phan Thị Hà, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên Trần Quốc Việt (2010) "Nghiên cứu số tính chất sử dụng hóa chất gây đột biến NTG để nâng cao độ phân giải protein protease ngoại bào vi khuẩn Bacillus sp." Tạp chí khoa học Đại học quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 4: 121- 128 Tài liệu tiếng Anh 15 Anneliese Crueger and Jurgen Distler (1996) "Acarbose biosynthesis genes from Actinoplanes sp., process for the isolation thereof and the use thereof CA 2170577 A1." 16 Beunink J, Schedel M and Steiner U (1997) "Osmotically controlled fermentation process for the preparation of acarbose German paten DE 19637591." US patent(6, 130,07) 17 Bischoff H (1995) "The mechanism of alpha-glucosidase inhibition in the management of diabetes." Clin Invest Med 18(4): 303–311 18 Carlo Taurino, Luca Frattini, Giorgia Letizia Marcone, Luciano Gastaldo and Flavia Marinelli (2011) "Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 as a cell factory for producing teicoplanin." Taurino et al Microbial Cell Factories 10(82) 19 Chand P (2005) "Novel multation method for increased cellulose production." Journal of Applied Microbiology 98: 318 - 323 20 Cheng X, Xu B, Wei SJ, Qiu XW and Tu GQ, (2008) "Isolation and identification of a rare Actinomycetes strain producing α-glucosidase inhibitor." Food and Fermentation Industries China 34(9): 58-60 21 Chiba S (1997) "Molecular mechanism in alpha-glucosidase and glucoamylase." Biosci Biotechnol Biochem 61(8): 1233–1239 22 Choi BT and Shin CS (2003) "Reduced Formation of Byproduct Component C in Acarbose Fermentation by Actinoplanes sp CKD48516." Biotechnol Prog 19(6): 1677-1682 23 Cooper R, Truumees I, Gunnarsson I, Loebenberg D, Horan A, Marquez J, Patel M, Gullo V, Puar M and Dasa P, (1992) "Sch 42137, a novel antifungal antibiotic from an Actinoplane sp Fementation, isolation, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56 structure and biological properties." J Antibiot (Tokyo) 45 24 De Azeredo LAI, De lima MB, Colelho RRR and Freire DMG (2006) "A LowCost Fermentation Medium for Thermophilic Protease Production by Streptomyces sp 594 Using Feather Meal and Corn Steep Liquor." Curr Microbiol(53): 335-339 25 DEMİRKAN E (2011) "Production, purification, and characterization of α-amylase by Bacillus subtilisand its mutant derivates." Turk J Biol 35: 705-712 26 Fremmer W, Puls W, Schafer D and SD (1975) "Glycoside-hydrolase enzyme inhibitors German patent DE 2064092." US patent 3: 876-776 27 Goeke K, Drepper A and Pape H (1996) "Formation of acarbose phosphate by a cell-free extract from the acarbose producer Actinoplanes sp J Antibiot." (Tokyo) 49: 661-663 28 Hanefeld M (2007) "The role of alpha-glucosidase inhibitors (acarbose) In: Mogensen CE, editor Pharmacotherapy of diabetes: new development Berlin." Springer pp: 143-152 29 Hanefeld M, Schaper F and Koehler C (2008) "Effect of Acarbose on Vascular Disease in Patients with Abnormal Glucose." Tolerance Cardiovasc Drugs Ther 22 225-231 30 Hanh V V, Anh P.T and Kim K (2009) "Fungal Strain Improvement for Cellulase Production Using Repeated and Sequential Mutagenesis." Mycobiology 37(4): 267 - 271 31 Hanh V V, Anh P.T and Kim K (2010) "Improvement of fungal satrain by repeated and sequential mutagenesis and optimization of solid state fermentation for the hyper- production of raw- starch- digesting enzyme." Journal of Microbiology and Biotechnology 20(4): 718- 726 32 Hemker M, S.A., Goeke K, Schroder W, Lenz J, Piepersberg W and Pape H (2001) "Identification, cloning, expression, and characterization of the extracellular acarbosemodifying glycosyltransferase, AcbD, from Actinoplanes sp strain SE50." J Bacteriol 183: 4484-4492 33 Jae-Chan Lee and Hae-Ryong Park (2003) "Production of teicoplanin by a mutant of Actinoplanes teicomyceticus." Biotechnology Letters 25: 537-540 34 Jung H-M, Jeya M, Kim S-Y, Moon H-J, Kumar SR, Zhang Y-W and Lee J-K (2009) "Biosynthesis, biotechnological production, and application of teicoplanin: curent sate and perspectives." Appl Microbiol Biotechnol.” 84(417-428) 35 Keun K and Jae- Yeon L (1998) "Strain improvement of yeast for ethanol production using a combined treatment of electric and chemical mutagen N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine." Journal of Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57 Microbiology Biotechnology 68: 119 - 123 36 Kihara Y, Ogami Y, Taburu A and Unoki M (1997) "Safe andeffective treatment of diabetes mellitus associated with chronic liver diseases with an alpha-glucosidase inhibitor, acarbose J." Gastroenterol 30: 777-782 37 KJL Dennis (1995) "Screening properties of certain two level designs." Metrika 42: 283- 288 38 Klaus Selber and Bernhard Weingaertner (2011) "Genomics of Actinoplanes utahensis CA 2807264 A1." 39 Kudad R and Kumar M (1994) "Hypercellulolytic mutant of Fusarrium oxysporum Letter in Applied Microbiology." 19: 397- 400 40 Lee S, Saueribrei B, Niggemann J and Egelkrout E (1997) "Biosynthesic studies on the α-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp.: source of the maltose unit." J Antibiot 50: 954-961 41 Li KT, Hou J, Wei SJ and Cheng X (2012) "An optimized industrial fermentation processes for acarbose production by Actinoplanes sp A56." Bioresource Technology 118: 580-583 42 Li Y and Liu Z (2007) "Application of Plackett-Burman experimental design and Doehlert design to evaluate nutritional requirements for xylanase production by Alternaria mali ND-16." Appl Microbiol Biotechnol Prog 77: 285-291 43 Liu C and Sun ZT (2008) "Response surface optimization of fermentation conditions for producing xylanase by Aspergillus niger SL-05." J Ind Microbiol 35: 703-711 44 Mahumud T (2003) "The C7N aminocyclitol family of natural products." Nat Prod Rep 20: 137-166 45 McLaughlin CL, Thompson A, Greenwood K, Sherington J and Bruce C (2009) "Effect of acarbose on acute acidosis." J Dairy Sci 92: 27582766 46 Minami H1 and Suzuki H (2003) "A mutant Bacillus subtilis gammaglutamyltranspeptidase specialized in hydrolysis activity." FEMS Microbiol Lett 224(2): 169-173 47 Nakao Kojima and Yasuhiro Kojima (1992) "Actinoplanes as a producer of rapamycin " EP 0638125 B1 24: 128-134 48 RL Plackett and JP Burman (1946) "The design of optimum multifactorial experiments." Biometrika 37: 305- 325 49 Ronald and M A (1946) "Handbook of Media for Environmental Microbiology." Biometrika 37: 204-215 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 50 Shah MM and Cheryan M (1995) "Acetate production by Clostridium thermoaceticum in corn steep liquor media." J Industrial Microbiol 15: 424-428 51 Silveira MM, Wisbeck E, Hoch I and Jonas R (2001) "Production of glucose-fructose oxidoreductase and ethanol by Zymomonas mobilis ATCC 29191 in medium containing corn steep liquor as vitamins." Appl Microbiol Biotechnol 55: 148-157 52 Simone M, Monciardini P, Gaspari E and Donadio S (2013) "Isolation and characterization of NAI-802, a new lantibiotic produced by two different Actinoplanes strain." The Journal of Antibiotic 66: 73-78 53 Stanbury P F, Whitaker A and Hall S J (1995) "Fermentation economics Principles offermentation technology, 2nd Ed, Pergamon Press, Oxford." 331-341 54 Sun LH, Li MG, Wang YS and Zheng YG (2012) "Significantly enhanced production of acarbose in fed-batch fermentation with the addition of Sadenosylmethionine." Microbiol Biotechnol Prog 22: 826-831 55 T.Sakai and I K (2003) "A marine strain of Flavobacteriaceae utilizes brown seaweed fucoidan,." Marine Biotechnology 5: 409-416 56 Thi Tuyen Do and Thanh Hoang Le (2014) "Enhancement of acarbose production by selected mutant Actinoplanes Int.Meeting in Korea." Microbial and Biotech Busan: 25-27 57 Thi Tuyen Do and Vu Van Hanh (2014) "Selection of Actinoplanes sp Strain and Optimization of Medium for Acarbose Production." Int.Meeting in Korea, Microbial and Biotech Busan(25-27): June, 2014 58 UF W and WP (2004) "Biotechnogy and molecular biology of the alphaglucosidase inhibitor acarbose." Marine Biotechnology 6: 27-35 59 Vértesy L, Ehlers E, Kogler H, Kurz M, Meiwes J, Seibert G, Vogel M and Hammann P (2000) "Friulimicins: novel lipopeptide antibiotics with peptidoglycan synthesis inhibiting activity from Actinoplanes friuliensi sp nov II IIsolation and structural chracterization." 6: 306-317 60 Viera Horváthová, Štefan Janeček and Ernest Šturdík (2000) "Amylolytic enzymes: their specificities, origins and properties." Biologia, Bratislava 55(6): 605-615 61 Vikas Sharma and P K Singh (2012) "Strain Improvement of Bacillus coagulans and Geobacillus stearothermophilus for Enhanced Thermostable Cellulase Production and the Effect of Different Metal Ions on Cellulase Activity." International Journal of Engineering Science & Technology (11): 47-04 62 Vikto´ ria La´za´ r and Gajinder Pal Singh (2013) "Bacterial evolution of Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 antibiotic hypersensitivity." Molecular Systems Biology 9: 37-45 63 Vu VH and Kim K (2009) "High-cell-density fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae KV-25 using molasses and corn steep liquor." J Microbiol Biotechnol 19: 1603-1611 64 Wang YJ, Liu LL, Wang YS, Xue YP, Zheng YG, Shen YC (2012) "Actinoplanes utahensis ZJB-08196 fed-batch fermentation at elevated osmolality for enhancing acarbose production." Bioresource Technology 103: 337-342 65 Wehmeier UF and Piepersberg W (2004) "Biotechnology and molecular biology of the alfa-glucosidase inhibitor acabose." Appl Microbiol biotechnol 63: 613-625 66 Wei SJ, cheng X, Huang L and Li KT (2010) "Medium optimization for acarbose production by Actinnoplanes sp A56 using the response surface methoatology." Afric J Biotechnol 9: 1949-1954 67 Wiliams and Wilkins (1974) "Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology." 8th edition 9: 184-194 68 Yamaki K and Mori Y (2006) "Evaluation of α-glucosidase inhibitory activity in colored foods: a trial using slope factors of regression curves." Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi 53(4): 229-231 69 Zhang M (2009) "Genetic transfomation of Bt gene into sorghum (Sorghum bicolor L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens." Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 25(3): 418 - 423 Tài liệu internet 70 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/images/khuanlacxakhuan 004.jpg 71 http://tailieu.vn/doc/acarbose-599748.html 72 http://vi.wikipedia.org 73 http://vietsciences.free.fr 74 http://www.daithaoduong.vn 75 http://www.dieutri.vn/benhhocnoi/6-10-2012/S2614/Benh-hoc-dai-thaoduong.htm 76 http://www.nhanhoa.org/vi/sec/education/diabetes_project.do Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Ảnh hưởng NTG tia UV đến khả sống sót chủng Actinoplane sp KCTC 9162 VĐ Thời gian xử lý NTG UV (phút) Tỷ lệ sống sót (%) 100 15 21.79 30 11.54 45 6.41 60 2.56 90 Phục lục 2: Hoạt tính ức chế α-glucosidase dòng đột biến NTG kết hợp NTG Dòng đột biến NTG & UV So sánh với chủng xạ khuẩn gốc (%) Dòng đột biến NTG & UV So sánh với chủng xạ khuẩn gốc (%) Dòng đột biến NTG & UV So sánh với chủng xạ khuẩn gốc (%) Actinoplanes sp KCTC 9162 VĐ 100 NV15.47 93.03 NV30.22 56.48 NV15.1 88.99 NV15.48 47.97 NV30.23 78.34 NV15.2 104.26 NV15.49 98.75 NV30.24 36.67 NV15.3 103.87 NV15.50 84.07 NV30.25 100.41 NV15.4 105.04 NV15.51 89.7 NV30.26 100.72 NV15.5 111.93 NV15.52 85.97 NV30.27 90.55 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 NV15.6 93.57 NV15.53 71.98 NV30.28 69.79 NV15.7 100.58 NV15.54 36.67 NV30.29 37.78 NV15.8 134.41 NV15.55 97.63 NV30.30 59.94 NV15.9 81.45 NV15.56 59.28 NV30.31 47.93 NV15.10 76.29 NV15.57 56.19 NV30.32 45.68 NV15.11 90.24 NV15.58 89.7 NV30.33 46.35 NV15.12 83.73 NV15.59 76.42 NV30.34 99.01 NV15.13 101.16 NV15.60 52.36 NV30.35 94.53 NV15.14 101.32 NV15.61 26.75 NV30.36 111.59 NV15.15 68.9 NV15.62 37.64 NV30.37 52.5 NV15.16 88.78 NV15.63 41.27 NV30.38 19.76 NV15.17 97.91 NV15.64 64.34 NV30.39 64.34 NV15.18 57.85 NV15.65 70.23 NV30.40 45.93 NV15.19 102.65 NV15.66 73.52 NV45.1 27.73 NV15.20 72.83 NV15.67 67.45 NV45.2 29.64 NV15.21 85.43 NV15.68 56.48 NV45.3 28.23 NV15.22 50.15 NV15.69 78.34 NV45.4 27.08 NV15.23 100.84 NV15.70 36.67 NV45.5 31.14 NV15.24 93.52 NV15.71 68.57 NV45.6 95.21 NV15.25 59.31 NV15.72 67.69 NV45.7 92.77 NV15.26 93.42 NV15.73 71.54 NV45.8 31.26 NV15.27 55.07 NV30.1 76.63 NV45.9 81.39 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62 NV15.28 79.07 NV30.2 68.57 NV45.10 80 NV15.29 71.27 NV30.3 82.258 NV45.11 79.96 NV15.30 57.94 NV30.4 108.82 NV45.12 111.01 NV15.31 52.17 NV30.5 108.33 NV45.13 32.9 NV15.32 101.29 NV30.6 25.599 NV45.14 97.69 NV15.33 67.07 NV30.7 30.72 NV45.15 114.14 NV15.34 73.38 NV30.8 30.15 NV45.16 62.26 NV15.35 93.69 NV30.9 25.27 NV45.17 91.46 NV15.36 106.5 NV30.11 105.35 NV45.18 121.87 NV15.37 92.07 NV30.12 61.51 NV60.1 31.92 NV15.38 34.67 NV30.13 67.69 NV60.2 36.23 NV15.39 52.36 NV30.14 71.54 NV60.3 92.35 NV15.40 26.75 NV30.15 61.75 NV60.4 88.15 NV15.41 37.64 NV30.16 77.41 NV60.5 68.57 NV15.42 41.27 NV30.17 74.33 NV60.6 74.53 NV15.43 37.86 NV30.18 64.34 NV60.7 47.79 NV15.44 43.54 NV30.19 70.23 NV60.8 69.79 NV15.45 45.68 NV30.20 73.52 NV15.46 45.23 NV30.21 67.45 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63 Phục lục 3: Sắc ký đồ TLC dòng đột biến NTG kết hợp UV Hình 1: Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ dòng đột biến Acarbose chuẩn 10mg/ml (C), Chủng Actinoplanes sp KCTC 9162 VĐ (1), NV15.32 (2), NV15.33 (3), NV15.34 (4), NV15.35 (5), N15.36 (6), NV15.37 (7), NV15.38 (8), NV15.39 (9), NV15.40 (10), NV15.41 (11), NV15.42 (12), NV15.43 (13), NV15.44 (14), NV15.45 (15) Hình 2: Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ dòng đột biến Acarbose chuẩn 10mg/ml (C), Chủng Actinoplanes sp KCTC 9162 VĐ (1), NV15.46 (2), NV15.47 (3), NV15.48 (4), NV15.49 (5), N15.50 (6), NV15.51 (7), NV15.52 (8), NV15.53 (9), NV15.54 (10), NV15.55 (11), NV15.56 (12), NV15.57 (13), NV15.58 (14), NV15.59 (15) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 Hình 3: Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ dòng đột biến Acarbose chuẩn 10mg/ml (C), Chủng Actinoplanes sp KCTC 9162 VĐ (1), NV15.60 (2), NV15.61 (3), NV15.62 (4), NV15.63 (5), N15.64 (6), NV15.65 (7), NV15.66 (8), NV15.67 (9), NV15.68 (10), NV15.69 (11), NV15.70 (12), NV15.71 (13), NV15.72 (14), NV15.73 (15) Hình 4: Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ dòng đột biến Acarbose chuẩn 10mg/ml (C), Chủng Actinoplanes sp KCTC 9162 VĐ (1), NV30.1 (2), NV30.2 (3), NV30.3 (4), NV30.4 (5), NV30.5 (6), NV30.6 (7), NV30.7 (8), NV30.8 (9), NV30.9 (10), NV30.11 (11), NV30.12 (12), NV60.3 (13), NV60.4 (14), NV30.13 (15), NV30.14 (16), NV30.15 (17), NV30.16 (18), NV30.17 (19) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 Hình 5: Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ dòng đột biến Acarbose chuẩn 10mg/ml (C), Chủng Actinoplanes sp KCTC 9162 VĐ (1), NV30.18 (2), NV30.19 (3), NV30.20 (4), NV30.21 (5), NV30.22 (6), NV30.23 (7), NV30.24 (8), NV30.25 (9), NV30.26 (10), NV30.27 (11), NV30.28 (12), NV30.29 (13), NV30.30 (14), NV30.31 (15), NV30.32 (16), NV30.33 (17) Hình 6: Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ dòng đột biến Acarbose chuẩn 10mg/ml (C), Chủng Actinoplanes sp KCTC 9162 VĐ (1), NV30.34 (2), NV30.35 (3), NV30.36 (4), NV30.37 (5), NV30.38 (6), NV30.39 (7), NV30.40 (8), NV45.1 (9), NV45.2 (10), NV45.3 (11), NV45.4 (12), NV45.5 (13) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 Hình 7: Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ dòng đột biến Acarbose chuẩn 10mg/ml (C), Chủng Actinoplanes sp KCTC 9162 VĐ (1), NV45.11 (2), NV45.12 (3), NV45.13 (4), NV45.14 (5), NV45.6 (6), NV45.7 (7), NV45.8 (8), NV45.9 (9), NV45.10 (10), NV45.15 (11), NV45.16 (12), NV45.17 (13), NV45.18 (14), NV60.5(15), NV60.6(16), NV60.7(17), NV60.8 (18) Phục lục 4: Tính ổn định sáu dòng đột biến qua hệ Dòng NV15.5 111.93 101.03 118.35 92.47 83.74 120.34 104.32 NV15.8 134.41 94.34 101.53 113.38 118.35 108.68 112.19 NV45.12 111.01 87.34 109.35 98.39 104.56 108.32 113.45 NV45.15 114.14 96.76 104.69 78.98 107.39 87.39 112.58 NV45.18 121.87 124.36 118.09 116.65 122.47 131.36 119.37 NV30.4 114.56 79.68 67.29 110.38 105.39 115.34 ĐB 108.82 Phục lục 5: So sánh hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) chủng Actinoplanes sp trước sau đột biến Chủng Actinoplanes sp Hoạt tính ức chế α-glucosidase (% ± SD) Chủng ban đầu 88.241 ± 2.099 Chủng NV45.18 72.887 ± 0.65 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 Phục lục 6: So sánh hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) môi trường trước sau tối ưu Môi trường Hoạt tính ức chế α-glucosidase (% ± SD) Tối ưu 89.077± 5.792 Cơ 83.677± 7.642 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 [...]... thông tin về việc tối ưu hóa môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu phát triển chủng Actinoplanes sp và tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp acarbose” 2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Chọn được một chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp acarbose năng suất cao - Tối ưu môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose của chủng xạ khuẩn... sản phẩm tự nhiên (Mahumud T 2003) do các chủng Actinoplanes sp như Actinoplanes sp SE50 (Goeke K, Drepper A et al 1996) Actinoplanes sp A56 (Wei S, Cheng X et al 2010), Actinoplanes sp. CKD485-16 (Choi BT and Shin CS 2003) sinh tổng hợp ra Actinoplanes là một chủng xạ khuẩn được nghiên cứu rộng rãi, nhiều nghiên cứu đã chứng minh chủng Actinoplanes sp sinh tổng hợp ra acarbose như là một sản phẩm tự nhiên... al 2008), tối ưu hóa sinh tổng hợp lipase từ Bacillus licheniformis GBDTY1(Huỳnh Thị Thanh Hiền, Trịnh Thị Bích Huyền et al 2010), tối ưu sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp A56 (Wei SJ, cheng X et al 2010) Sau bước sàng lọc ban đầu, thí nghiệm tối ưu theo phương pháp RSMCCD được dùng để tối ưu hóa giá trị các yếu tố đang được nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tối ưu hóa các... đĩa thạch để lên men và chọn được dòng đột biến mong muốn 2.2.5 Tối ưu môi trường lên men sản xuất acarbose Từ các dòng đột biến, chọn ra một dòng đột biến có hoạt tính acarbose cao nhất Ta sẽ sử dụng dòng đột biến này để nuôi và tối ưu môi trường lên men sản xuất acarbose thích hợp cho dòng đột biến này A Tối ưu đơn hướng các yếu tố 2.2.5.1 Tối ưu nguồn cacbon Nuôi cấy chủng Actinoplane sp đã được chọn... biết các chủng sinh tổng hợp acarbose (Cheng X, Xu B et al 2008) Để nâng cao năng suất sinh tổng hợp acarbose, Wei et al (2010) đã tối ưu môi trường lên men cho chủng Actinoplanes sp A56, ảnh hưởng của glucose, maltose, dịch chiết ngô, bột đậu tương và monosodium glutamate đến sinh tổng hợp acarbose Maltose và dịch chiết ngô là hai yếu tố có tác dụng quan trọng, làm tăng sinh tổng hợp acarbose từ 837 đến... α-glucosidase qua chỉ số đo OD ở bước sóng 415nm Tìm khoảng pH nuôi cấy thích hợp B Tối ưu đa hướng các yếu tố Từ tối ưu đơn hướng chúng tôi tìm được các khoảng thích hợp Để kiểm tra sự ảnh hưởng lẫn nhau của các yếu tố tới quá trình lên men sinh tổng hợp acarbose, chúng tôi tiếp tục tối ưu các yếu tố môi trường trong lên men sinh tổng hợp acarbose theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) dựa trên phần mềm Design-... tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ điều chế acarbose làm nguyên liệu thuốc chữa bệnh đái tháo đường” thuộc chương trình NCKH trọng điểm quốc gia phát triển Công nghiệp dược liệu đến năm 2020, Bộ công thương 2012-2015 do TS Đỗ Thị Tuyên chủ nhiệm cũng đang được tiến hành Trong khuôn khổ của luận văn thạc sỹ, chúng tôi đặt ra nhiệm vụ “Nghiên cứu phát triển chủng Actinoplanes sp và tối ưu điều kiện lên. .. Anneliese Crueger và cộng sự đã đột biến chủng Actinoplanes sp SE 50/110 để chọn lọc ra gene sinh tổng hợp acarbose từ chủng xạ khuẩn đột biến này (Anneliese Crueger and Jurgen Distler et al 1996) Năm 1998, Kim và cộng sự đã sử dụng xung điện và hóa chất NTG để cải biến hai chủng nấm men S diastaticus (ATCC 28339) và Saccharomyces spp trong sản xuất cồn sinh học Dòng đột biến chọn lọc NF30-9 lên men được ethanol... Nam • Trên thế giới Chủng Actinoplanes sp CKD485-16 được lên men sinh tổng hợp acarbose với năng suất 2,3 g/l acarbose và 0,6 g/l thành phần C của acarbose sau Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5 khi kết thúc lên men Maltose, bán phân tử của acarbose, cần được duy trì ở nồng độ cao trong môi trường trong suốt quá trình lên men để sinh tổng hợp acarbose có hiệu... độ thích hợp Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm tối ưu nhiệt độ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22 2.2.5.4 Tối ưu pH Nuôi cấy chủng Actinoplane sp đã được chọn trong các pH khác nhau 6 6,5 7 7,5 8 Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase Xác định pH nuôi cấy thích hợp Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm tối ưu pH Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường lên men tối ưu, trong