HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƯU THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢM HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ AFLATOXIN TỪ NẤM MỐC CỦA VI KHUẨN LACTIC VÀ NẤM TRICHODERMA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2015 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM oOo LƯU THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢM HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ AFLATOXIN TỪ NẤM MỐC CỦA VI KHUẨN LACTIC VÀ NẤM TRICHODERMA Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Thanh Thủy TS Nguyễn Văn Giang HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực khóa luận cám ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015 Tác giả luận văn Lưu Thị Phương Thảo Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu, nhận nhiều giúp đỡ, bảo, động viên thầy cô, gia đình bạn bè Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Thanh Thủy TS Nguyễn Văn Giang, cô thầy người tận tình bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa Công nghệ thực phẩm, Công nghệ sinh học Học viện Nông Nghiệp Việt Nam giảng dạy, dìu dắt tơi suốt thời gian học tập Học viện Tôi xin trân trọng cảm ơn anh, chị làm việc phịng QC & Lab Cơng ty cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ cộng tác với tơi q trình học tập thực luận văn phịng Cuối cùng, tơi vơ biết ơn gia đình, người thân bạn bè khích lệ, động viên tơi đường học tập, nghiên cứu khoa học Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2015 Học viên Lưu Thị Phương Thảo Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract x PHẦN - MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Giả thiết khoa học 1.3 Mục tiêu nghiên cứu 1.4 Phạm vi nghiên cứu 1.5 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học thực tiễn PHẦN - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung nấm mốc độc tố nấm mốc 2.2 Độc tố aflatoxin: đặc điểm, chế gây bệnh tiêu chuẩn quy định 2.2.1 Khái quát độc tố aflatoxin 2.2.2 Cấu trúc hóa học aflatoxin 2.2.3 Q trình tổng hợp aflatoxin 2.2.4 Tính chất hóa lý aflatoxin 2.2.5 Độc tính aflatoxin 2.2.6 Các quy định aflatoxin thực phẩm 10 2.3 Các loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin điều kiện phát triển 12 2.3.1 Nấm mốc Aspergillus flavus 12 2.3.2 Nấm mốc Aspergillus parasiticus 13 2.4 Thực trạng nhiễm độc tố aflatoxin nơng sản biện pháp phịng trừ 13 2.4.1 Thực trạng nhiễm độc tố aflatoxin giới 13 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.4.2 Thực trạng nhiễm độc tố aflatoxin Việt Nam 15 2.4.3 Các biện pháp phòng, trừ aflatoxin 15 2.5 Giới thiệu vi khuẩn lactic khả kháng nấm mốc, độc tố nấm mốc 16 2.5.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 16 2.5.2 Các chất chuyển hóa kháng nấm sản xuất vi khuẩn lactic 17 2.6 Nấm Trichoderma 18 2.6.1 Giới thiệu chung nấm Trichoderma 18 2.6.2 Lợi ích nấm Trichoderma 19 2.6.3 Tính đối kháng nấm Trichoderma 20 2.6.4 Tình hình nghiên cứu tính đối kháng nấm Trichoderma với nấm mốc sinh độc tố aflatoxin 20 PHẦN - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.1.1 Đối tượng 22 3.1.2 Hóa chất, dụng cụ trang thiết bị, mơi trường sử dụng nghiên cứu 22 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 24 3.1.4 Thời gian nghiên cứu 24 3.2 Nội dung nghiên cứu 24 3.3 Phương pháp nghiên cứu 24 3.3.1 Xác định nấm mốc sinh độc tố aflatoxin quan sát hình thái bào tử 24 3.3.2 Xác định khả kháng nấm mốc vi khuẩn lactic phương pháp che phủ sửa đổi Magnusson Schnurer 3.3.3 26 Xác định khả ức chế nấm mốc sinh độc tố aflatoxin từ dịch chiết vi khuẩn lactic phương pháp đục lỗ thạch 26 3.3.4 Phương pháp thu dich chiết vi khuẩn lactic nấm Trichoderma 27 3.3.5 Xác định khả ức chế nấm mốc sinh độc dịch chiết vi khuẩn lactic dịch chiết nấm Trichoderma nồng độ khác 3.3.6 27 Đánh giá khả ức chế nấm Trichoderma với nấm sinh độc tố aflatoxin phương pháp đồng ni cấy 3.3.7 27 Đánh giá hoạt tính đối kháng dịch chiết nấm Trichoderma phương pháp bổ sung vào môi trường nuôi cấy lỏng nồng độ khác 3.3.8 29 Đánh giá khả giảm hàm lượng độc tố aflatoxin từ nấm dịch chiết vi khuẩn lactic, dịch chiết nấm Trichoderma phương pháp ELISA Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 30 Page iv PHẦN - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 34 Kết sàng lọc mẫu chứa độc tố aflatoxin phân lập chủng nấm mốc sinh độc tố aflatoxin 34 4.1.1 Kết sàng lọc mẫu chứa độc tố aflatoxin 34 4.1.2 Kết phân lập xác định nấm sinh độc tố aflatoxin 34 4.2 Kết đánh giá hoạt tính vi khuẩn lactic với nấm sinh độc tố aflatoxin aflatoxin ngô nguyên liệu 4.2.1 37 Kết xác định khả ức chế nấm mốc sinh độc tố aflatoxin từ vi khuẩn lactic 4.2.2 37 Kết xác định khả ức chế nấm mốc sinh độc tố aflatoxin từ dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic 4.2.3 39 Kết bổ sung dịch chiết vi khuẩn lactic nồng độ khác vào môi trường nuôi cấy PD lỏng 4.2.4 40 Kết xác định khả giảm hàm lượng độc tố aflatoxin từ nấm dịch chiết vi khuẩn lactic 4.3 42 Kết đánh giá hoạt tính nấm Trichoderma với nấm sinh độc tố aflatoxin aflatoxin ngô nguyên liệu 4.3.1 43 Kết đánh giá khả ức chế nấm Trichoderma với nấm sinh độc tố aflatoxin 4.3.2 43 Kết đánh giá khả ức chế dịch chiết nấm Trichoderma với nấm sinh độc tố aflatoxin 4.3.3 44 Kết đánh giá khả giảm hàm lượng độc tố aflatoxin từ nấm dịch chiết nấm Trichoderma 47 4.4 Thảo luận 47 4.4.1 Sử dụng vi khuẩn lactic ức chế nấm sinh độc tố aflatoxin giảm hàm lượng độc tố aflatoxin 4.4.2 48 Sử dụng nấm Trichoderma ức chế nấm sinh độc tố aflatoxin giảm hàm lượng độc tố aflatoxin 49 PHẦN - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt GRAS Generally Recognized as Safe Cơng nhận an tồn CA Coconut Agar Thạch nước cốt dừa DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EU Europe Châu Âu HCC Hepatocellular carcinoma Ung thư biểu mô tế bào gan IARC International Agency for Research on Cơ quan Nghiên cứu Quốc tế Cancer Ung thư Không quy định KQĐ LAB Lactic acid bacteria Vi khuẩn lactic LD50 Medium letalisdosis Liều lượng gây chết trung bình MRS Man, Rogosa, Sharpe NOR Norsolorinic OMST O-methylsterigmatocystin OTA Ochratoxin A OTB Ochratoxin B OTC Ochratoxin C PDA Potato Dextro Agar RNA Ribonucleic acid ST Sterigmatocystin UV Ultraviolet Thạch khoai tây Tia cực tím Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các loại độc tố thường gặp Bảng 2.2 Tính chất hóa lý aflatoxin Bảng 2.3 Giá trị LD50 aflatoxin B1 Bảng 2.4 Giới hạn aflatoxin thực phẩm theo QCVN 8-1:2011/BYT 10 Bảng 3.1 Đặc điểm mẫu ngô đem sàng lọc 22 Bảng 3.2 Đặc điểm nhận dạng nấm mốc A flavus A parasiticus 25 Bảng 3.3 Chia số lượng mẫu theo mục đích thí nghiệm: 30 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc xuất sau ngày nuôi cấy 35 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc bào tử chủng nấm mốc 36 Bảng 4.3 Bảng mã hóa chủng vi khuẩn 37 Bảng 4.4 Kết theo dõi hoạt tính kháng khuẩn chủng lactic 38 Bảng 4.5 Hiệu ức chế nấm mốc A parasiticus dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic 40 Bảng 4.6 Khối lượng bào tử nấm A.parasiticus nuôi cấy môi trường lỏng PD bổ sung dịch chiết Lab6 41 Bảng 4.7 Khối lượng bào tử nấm A.parasiticus nuôi cấy môi trường lỏng PD bổ sung dịch chiết Lab19 42 Bảng 4.8 Nồng độ độc tố aflatoxin mẫu ngô 42 Bảng 4.9 Hiệu ức chế nấm đối kháng Trichoderma nấm mốc sinh độc tố phương pháp đồng nuôi cấy 44 Bảng 4.10 Năng suất sinh khối khô A flavus phát triển mơi trường PD có bổ sung dịch chiết Trichoderma 45 Bảng 4.11 Năng suất sinh khối khô A parasiticus phát triển môi trường PD lỏng có bổ sung dịch chiết Trichoderma Bảng 4.12 Hàm lượng độc tố aflatoxin mẫu ngơ thí nghiệm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 46 47 Page vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Các dạng cấu trúc aflatoxin Hình 2.2 Tổng hợp aflatoxin tiền chất tức Sterigmatocystin (ST) O-methyl sterigmatocystin (OST) Hình 2.3 Hình ảnh khuẩn lạc (A) bào tử (B) nấm A flavus 12 Hình 2.4 Hình ảnh khuẩn lac (A) bào tử (B) nấm A.parasiticus 13 Hình 2.5 Hình ảnh khuẩn lạc (A) bào tử (B) nấm Trichoderma 18 Hình 3.1 Các bước sàng lọc mẫu ngô nhiễm mốc chứa độc tố aflatoxin 24 Hình 3.2 Các bước xác định nấm sinh độc tố aflatoxin 26 Hình 3.3 Giới thiệu phương pháp đồng ni cấy 28 Hình 3.4 Các bước chuẩn bị mẫu ngơ thí nghiệm 30 Hình 3.5 Các bước chuẩn bị mẫu phân tích aflatoxin 31 Hình 3.6 Các bước định lượng aflatoxin mẫu ngô nguyên liệu 33 Hình 4.1 Mẫu ngơ ánh sáng tia UV 34 Hình 4.2 Kết phân lập nấm sinh độc tố aflatoxin : 35 Hình 4.3 Ảnh thể khả ức chế nấm mốc vi khuẩn lactic Hình 4.4 39 Sự ức chế dịch chiết vi khuẩn lactic tăng trưởng nấm A parasiticus (1) dịch chiết vi khuẩn lactic sau ly tâm; (2) thử nghiệm chủng Lab 6; (3) thử nghiệm chủng Lab19 40 Hình 4.5 Bào tử nấm A parasiticus sau sấy 41 Hình 4.6 Kết khả ức chế A parasiticus nấm Trichoderma 43 Hình 4.7 Kết khả ức chế A flavus nấm Trichoderma 44 Hình 4.8 A flavus phát triển mơi trường PD có bổ sung dịch chiết Trichoderma thu sinh khối Hình 4.9 45 A parasiticus phát triển mơi trường PD lỏng có bổ sung dịch chiết Trichoderma thu sinh khối Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 46 Page viii 4.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CỦA NẤM TRICHODERMA VỚI NẤM SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN VÀ AFLATOXIN TRONG NGÔ NGUYÊN LIỆU 4.3.1 Kết đánh giá khả ức chế nấm Trichoderma với nấm sinh độc tố aflatoxin Trong thí nghiệm đồng ni cấy, nấm mốc sinh độc tố nấm đối kháng đồng ni cấy PDA đường kính 9cm Hiệu ức chế nấm đối kháng Trichoderma chống lại nấm mốc sinh độc tố xác định cách so sánh bán kính tăng trưởng nấm mốc sinh độc tố đĩa đối kháng với bán kính phát triển đĩa đối chứng Số liệu sử dụng để tính hiệu ức chế (PIRG, Percent Inhibition of Radical Growth) trình bày mục 3.3.5 Kết đánh giá thể Bảng 4.9 Trên đĩa PDA thí nghiệm, Trichoderma tăng trưởng nhanh tiếp xúc với nấm A flavus sau ngày nuôi cấy A parasiticus sau ngày đồng ni cấy, tiếp tục ngày sau nấm Trichoderma phát triển mạnh phát triển chồng lên nấm mốc sinh độc tố nấm sinh độc tố phát triển đường kính khóm nấm tăng lên Đối với nấm A parasiticus, sau ngày đồng nuôi cấy đĩa thí nghiệm nấm tiếp xúc với Trong thời gian phát triển PDA, giá trị PIRG đạt 60.22% ngày sau đồng nuôi thấp so với nấm A flavus Đối chứng A.parasiticus – A.parasiticus Thí nghiệm Tricoderma – A.parasiticus Thứ tự khuẩn lạc đĩa, tính từ trái qua phải: Bên trái: khuẩn lạc Trichoderma, Bên phải: khuẩn lạc Aspergillus parasiticus Hình 4.6 Kết khả ức chế A parasiticus nấm Trichoderma Đối với nấm A flavus, sau ngày nuôi cấy nấm đĩa đối kháng tiếp xúc với Trong thời gian phát triển PDA, giá trị PIRG đạt 63,51% Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43 ngày sau đồng nuôi cấy Đối chứng A.flavus – A.flavus Thí nghiệm Tricoderma – A.flavus Hình 4.7 Kết khả ức chế A flavus nấm Trichoderma Thứ tự khuẩn lạc đĩa thí nghiệm, tính từ trái qua phải: Bên trái: khuẩn lạc Trichoderma, Bên phải: khuẩn lạc Aspergillus flavus Trên đĩa đối chứng đường kính nấm phát triển mạnh bán kính đạt 3.5 cm nấm A flavus 3.2 nấm A parasiticus sau ngày nuôi cấy Bảng 4.9 Hiệu ức chế nấm đối kháng Trichoderma nấm mốc sinh độc tố phương pháp đồng nuôi cấy Nấm sinh độc tố Aspergillus flavus Aspergillus Parasiticus Tỷ lệ ức chế tăng trưởng (PIRG,%) ngày ngày e d c c b 63.51a 60.22a 36.71 31.18e 50.66 36.53d 53.75 45.43c 55.03 50.99b 59.69 58.01a Chú thích: Các giá trị hàng có số mũ khác mức ý nghĩa α = 5% 4.3.2 Kết đánh giá khả ức chế dịch chiết nấm Trichoderma với nấm sinh độc tố aflatoxin Từ dịch chiết Trichoderma thu phần 3.3.4, tiếp tục thực nghiên cứu khả ức chế nấm mốc A flavus A parasiticus dịch chiết nồng độ khác A flavus A parasiticus nuôi môi trường Potato Dextrose có bổ sung dịch chiết Trichoderma nồng độ khác 0, 1, 2, 3, 4% Sau nuôi cấy ngày, sinh khối A.flavus A.parasiticus lọc, rửa sạch, sấy khô cân Hiệu ức chế xác định tỷ lệ giảm khối lượng sinh khối khô A flavus A parasiticus phát triển Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 môi trường PD nồng độ dịch chiết xuất so với đối chứng (0%) Đối với nấm Aspergillus flavus Kết ức chế dịch chiết Trichoderma với nấm mốc A flavus phương pháp bổ sung dịch chiết vào môi trường nuôi cấy lỏng thể Bảng 4.10 hình 4.8 Bảng 4.10 Năng suất sinh khối khô A flavus phát triển mơi trường PD có bổ sung dịch chiết Trichoderma Nồng độ chiết xuất môi Năng suất sinh khối Tỷ lệ giảm sinh khối trường nuôi cấy lỏng (%) (mg/ml) (%) (đối chứng) 0,850 0,435 0,350 0,224 0,221 48,82 58,82 73,64 74,00 Qua bảng số liệu ta thấy hiệu ức chế sinh khối nấm A flavus phát triển mơi trường PD có tương quan với nồng độ dịch chiết Trichoderma bổ sung nồng độ dịch chiết từ đến 4% hiệu tăng từ lên 74,00% Với nồng độ dịch chiết bổ sung từ đến 3% thấy rõ giảm sinh khối (0,85 xuống 0,224g với tỷ lệ giảm sinh khối từ lên 73,64%) Với nồng độ dịch chiết bổ sung từ đến 4% giảm sinh khối khối không lớn (0,224 xuống 0,221g với tỷ lệ giảm sinh khối từ 73,64 lên 74,00%) A B Hình 4.8 A flavus phát triển mơi trường PD có bổ sung dịch chiết Trichoderma thu sinh khối Chú thích: A/ Nấm A flavus sau năm ngày nuôi cấy lắc môi trường PD B/ Thu tản nấm qua giấy lọc C/ Nấm A flavus sau sấy Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 Đối với nấm Aspergillus parasiticus Kết ức chế dịch chiết Trichoderma với nấm mốc A parasiticus phương pháp bổ sung dịch chiết vào môi trường nuôi cấy lỏng thể Bảng 4.11 hình 4.9 Bảng 4.11 Năng suất sinh khối khô A parasiticus phát triển mơi trường PD lỏng có bổ sung dịch chiết Trichoderma Nồng độ chiết xuất môi Năng suất sinh khối Tỷ lệ giảm sinh khối trường nuôi cấy lỏng (%) (mg / mL) (%) (đối chứng) 0,713 0,431 39,55 0,378 46,98 0,285 60,03 0,283 60,30 Qua bảng số liệu ta thấy hiệu ức chế sinh khối A parasiticus phát triển mơi trường PD có tương quan với nồng độ dịch chiết Trichoderma bổ sung nồng độ dịch chiết từ đến 4% hiệu tăng từ lên 60.30% Với nồng độ dịch chiết bổ sung từ đến 3% thấy rõ giảm sinh khối (0.713 xuống 0.283g với tỷ lệ giảm sinh khối từ lên 60.03%) Với nồng độ dịch chiết bổ sung từ đến 4% giảm sinh khối khối không lớn ( 0.285 xuống 0.283g với tỷ lệ giảm sinh khối từ 60.03 lên 60.30%) A B C Hình 4.9 A parasiticus phát triển mơi trường PD lỏng có bổ sung dịch chiết Trichoderma thu sinh khối Chú thích: A/ Nấm A parasiticus sau ngày nuôi cấy lắc môi trường PD B/ Nấm A parasiticus sau sấy C/ Nấm A parasiticus A flavus sau sấy Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46 Qua bảng số liệu hình ảnh ta thấy hiệu ức chế nấm đối kháng Trichoderma nấm A flavus cao so với nấm A parasiticus kết hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu thí nghiệm 4.3.3 Kết đánh giá khả giảm hàm lượng độc tố aflatoxin từ nấm dịch chiết nấm Trichoderma Hàm lượng độc tố mẫu lây nhiễm nấm mốc sinh độc tố aflatoxin sau phun dịch chiết nấm Trichoderma có tương quan thuận với nồng độ dịch chiết phun vào Dịch chiết Trichoderma có hiệu với chủng nấm trên, thể rõ rệt từ ngày thứ sau phun dịch chiết Bảng 4.12 Hàm lượng độc tố aflatoxin mẫu ngơ thí nghiệm Nồng độ (%) ngày (ppb) ngày (ppb) ngày (ppb) ngày (ppb) Mẫu lây nhiễm A flavus - 40 60 66,67 - 26,67 33,33 37,5 - 20 23,33 26,67 - 16,67 18,66 20 - 13,33 15,33 16 Mẫu lây nhiễm A parasiticus - 41,3 62 68 - 28,66 36,67 40 - 22 26,67 29,33 - 20 24,6 26,66 - 19,33 20 21,33 4.4 THẢO LUẬN Trong trình lưu trữ loại thực phẩm thức ăn chăn nuôi, phần lớn hư hỏng ngộ độc nấm Aspergillus, Fusarium, Penicillium (Nickelson Jakobson, 1997), gây thiệt hại lớn kinh tế toàn giới (Magnusson et al., 2003) Hơn nữa, loại nấm sản sinh bào tử gây dị ứng độc tố nấm mốc gây nguy hiểm sức khỏe cách nghiêm trọng (Nielson Rios, 2000) Biện pháp kiểm soát thích hợp để ngăn chặn phát triển nấm loại ngũ cốc, thực phẩm, thức ăn chế biến lưu trữ quan trọng hàng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47 đầu để tránh làm ô nhiễm thực phẩm giảm thiểu nguy sức khỏe cộng đồng Trong năm gần đây, có nhiều quan tâm ứng dụng vi sinh vật chất chuyển hóa chúng để ngăn chặn hư hỏng để kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm (Stiles, 1996) 4.4.1 Sử dụng vi khuẩn lactic ức chế nấm sinh độc tố aflatoxin giảm hàm lượng độc tố aflatoxin Vi khuẩn axit lactic quan tâm chúng có khả sản xuất hợp chất kháng khuẩn axit lactic, axit acetic, sản xuất bacteriocin (Lavermicocca et al, 2000; Lindgern Dobrogosz, 1990) Trong nhiều nghiên cứu tập trung vào hoạt động kháng khuẩn vi khuẩn axit lactic (Dodd Gasson, 1994; Lindgren Dobrogosz, 1990; Stiles, 1996), có tương đối báo cáo tác dụng chống nấm El-Gendy Marth (1981) cho thấy Lactobacillus casei ức chế phát triển sản xuất aflatoxin Aspergillus parasiticus Nhóm nghiên cứu Lavermicocca et al., (2000) chứng minh hợp chất chống nấm axit phenyllactic acid 4hydrophenyllactic sản xuất Lactobacillus plantarum Nhóm nghiên cứu Jeong-Dong Kim, (2005) phân lập 120 chủng vi khuẩn lactic từ kim chi xác định 10% số vi khuẩn axit lactic phân lập hoạt tính kháng nấm chống lại A fumigatus Và 4.16% tổng số vi khuẩn phân lập có hoạt tính mạnh với số nấm mốc, số có hai chủng vi khuẩn Lactobacillus curvatus Lactobacillus sakei có khả kháng mạnh nấm A flavus,tuy nhiên chưa thấy nhóm cơng bố khả khử độc tố aflatoxin A flavus sỉnh Trong thí nghiệm chúng tơi chưa xác định chất tiết từ chủng Lactobacillus TO2 Streptococcus TO5 có khả ức chế nấm sinh độc tố aflatoxin Do điều kiện hạn chế nên thí nghiệm dừng thí nghiệm đánh giá khả ức chế hoạt tính từ dịch chiết vi khuẩn mà chưa có khả sâu vào việc tách chiết hợp chất kháng nấm cụ thể phục vụ thí nghiệm nghiên cứu giới kể Tuy nhiên, xác định 30 chủng nấm thu thập có khả kháng khuẩn E.coli , nấm Peniciliim ( đánh giá từ nghiên cứu trước) mà khơng có khả hoạt tính ức chế thấp nấm sinh độc tố aflatoxin khả giảm hàm lượng độc tố aflatoxin ngô nguyên liệu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 4.4.2 Sử dụng nấm Trichoderma ức chế nấm sinh độc tố aflatoxin giảm hàm lượng độc tố aflatoxin Trichoderma loài nấm đứng đầu hệ vi sinh vật đất, có tính đối kháng cao nghiên cứu nhiều nước giới Trong tự nhiên nấm Trichoderma loại vi sinh vật có lợi cho trồng không độc hại Nấm Trichoderma phân giải chất hữu cung cấp dinh dưỡng cho trồng tác nhân sinh học đối kháng lại loại nấm bệnh cho trồng đất Rhizoctonia solani, Fusarium, Rolfsii Sclecrotium, Verticillium (Nguyen Thi Thanh et al., 2014) Khả đối kháng Trichoderma chủ yếu thông qua hoạt động hệ enzyme ngoại bào mà sinh Mỗi chủng Trichoderma ssp khác có hệ enzyme khác catalase, pectinase, protease hay cenlulase Kết cho thấy, Trichoderma khai thác đối tượng tiềm cho lĩnh vực kháng khuẩn, chống nấm mốc giảm hàm lượng độc tố aflatoxin chúng sinh (Emma et al., 2008) Trên giới có nghiên cứu khả ức chế nấm mốc sinh độc tố aflatoxin độc tố aflatoxin T harzianum ức chế A flavus phần trăm ức chế dao động từ (68,8-100%) dịch chiết T harzianum (Monira Rashed Al-Othman et al., 2013) Theo Mumtaz Baig et al 2012 T harzianum ức chế tăng trưởng A flavus 67% sau ngày đồng nuôi cấy với nấm A flavus Theo Anita S patil chứng minh T harzianum nấm đối kháng có hiệu chống lại tác nhân gây bệnh thực vật kiểm tra, cho thấy phạm vi tỷ lệ ức chế khác 56,52 - 71,01% với A flavus 50,00 - 64,00% so với A parasiticus (Anita S patil et al., 2012) Một số chủng nấm Trichoderma spp chứng minh làm suy giảm aflatoxin B1 từ 65-99% ngày 28 ± ° C (Dimitrios et al., 2012) Việc sử dụng chủng nấm đối kháng thuộc lồi Trichoderma để kiểm sốt hàm lượng aflatoxin Aspergillus spp sinh Ấn Độ có kết tốt (Mausam et al., 2007) Tuy nhiên, Việt Nam hướng ứng dụng nấm Trichoderma kiểm soát nấm mốc sinh độc tố aflatoxin giảm hàm lượng độc tố aflatoxin nông sản chưa quan tâm nghiên cứu mà chủ yếu theo hướng phòng trừ nấm bệnh hại rễ trồng, sản xuất phân hữu vi sinh Trichomix (Nguyen Thi Thanh et al., Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 49 2014) Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu thí nghiệm khả đối kháng nấm Trichoderma nấm sinh độc tố aflatoxin khả giảm hàm lượng độc tố aflatoxin có ngơ ngun liệu Trong thí nghiệm bước đầu thu kết khả quan, nấm Trichoderma có khả ức chế cao nấm sinh độc tố aflatoxin dịch chiết nấm có khả giảm hàm lượng độc tố aflatoxin có ngô nguyên liệu.Tuy nhiên điều kiện thời gian cịn hạn chế, chúng tơi chưa xác định định chế kháng nấm sinh độc tố khử độc tố aflatoxin nấm Trichoderma Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau q trình nghiên cứu chúng tơi thu kết sau: -Phân lập chủng nấm mốc sinh độc tố nấm mốc sinh độc tố aflatoxin A flavus A parasiticus từ mẫu ngô nguyên liệu - Xác định chủng vi khuẩn Lab Lab 19 có khả ức chế nấm mốc A parasiticus không ức chế A flavus Trong dịch chiết chủng Lab 19 có hiệu ức chế nấm mốc làm giảm độc tố nấm mốc cao chủng Lab môi trường lý thuyết, nhiên hiệu chưa vượt 50% Rất hiệu ức chế môi trường thực tế (môi trường bột ngô nguyên liệu) -Xác định nấm mốc Trichoderma có khả ức chế loại nấm mốc sinh độc tố aflatoxin phân lập sau ngày nuôi cấy A flavus A parasiticus với hiệu tương đối cao 5.2 KIẾN NGHỊ -Tiếp tục nghiên cứu để tìm nhiều chủng vi khuẩn lactic Tricoderma có khả ức chế nấm mốc sinh độc tố aflatoxin có khả giảm hàm lượng độc tố aflatoxin; -Nghiên cứu thêm chế kháng nấm sinh độc tố độc tố chủng thu được; -Nghiên cứu làm giàu chất kháng nấm sinh độc tố tạo chế phẩm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trần Văn An (1997) Độc tố nấm mốc thực phẩm động vật Đậu Ngọc Hào (1992) Thức ăn nhiễm nấm mốc độc tố aflatoxin chúng với gà công nghiệp Tạp chí nơng nghiệp cơng nghệ thực phẩm Số Tiêu chuẩn ngành Y tế 52 TCN-TQTP 0001:2003 thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus thực phẩm Tiêu chuẩn ngành Y tế 52 TCN-TQTP 0009:2004 thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus parasiticus, Aspergillus versicolor thực phẩm Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus thực phẩm Tiêu chuẩn ngành y tế 52 TCN-TQTP 0001:2003 Tài liệu tiếng Anh Agrios, George N (2005) Plant Pathology: Fifth Edition Elsevier Academic Press p 922 ISBN 0-12-044565-4 Ananth S.B., and Farid W (2000) Importance of aflatoxin in human and livestock health André S., Monika S., (2010) Biology and biotechnology of Trichoderma Appl Microbiol Biotechnol 2010 Jul; 87(3): 787–799 Anita S patil et al., (2012) In vitro antagonistic properties of selected Trichoderma species against tomato root rot causing pythium species International Journal of Science, Environment and Technology, Vol 1, No 4, 302 – 315 Annual Reports on Surveillance and Monitoring for Harmful Chemical Substances in Animal Feed (in the fiscal year 2009, Japan) Food and Agricultural Materials Inspection Center (FAMIC) Ashraf A.M., Abdullah N.A., Ahmed A M., Shaban R.S., Ashraf A.H., (2013) Antagonistic Activities of Some Fungal Strains against the Toxigenic Aspergillus flavus Isolate and its Aflatoxins Productivity Journal of pure and applied microbiology Nov Vol (Spl Edn.), p 169-178 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 Bankole SA, Mabekoje OO (2004) Myco flora and occurrence of aflatoxin B-1 in dried yam chips from markets in Ogun and Oyo States, Nigeria Mycopathologia 157: 111-115 Bennett JW, Klich M (2003) Mycotoxins Clin Microbiol Rev Jul; 16(3): 497– 516 doi: 10.1128/CMR.16.3.497-516.2003 Cassel EK, Barao SM and Carmal DK (1988) Aflatoxicosis and ruminants Texas Vet Med Diagnostic lab, Tesas college The national dairy database (1992) NDB, Health, Test, Hf100200 TxT 10 Chung TC, Axelsson L, Lindgren SE, Dobrogosz WJ (1989) In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri Microbial Ecology and Health and Disease, 2, 137–144 11 Corsetti A, Gobetti M, Rossi J, Damiani P (1998) Antimold activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lb sanfranciscensis CB1 Applied Microbiology and Biotechnology, 50, 253–256 12 De Hoog G.S and J Guarro 1995 Atlas of clinical fungi Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn and Delft, The Netherlands 13 Devero, A (1999) Aflatoxin: The effects on human and animal health Biol, 4900; Fall 14 Dimitrios I.T., Dimakopoulou,Antoniou P and ElEfthErios C.T., (2012) Review Biological control strategies of mycotoxigenic fungi and associated mycotoxins in Mediterranean basin crops Phytopathologia Mediterranea 51, 1, 158−174 15 Dobrogosz W, Casas I, Karlsson M (1989) Lactobacillus reuteri and enterimicrobita Microbial Ecology and Health and Disease, 8, 124–131 16 Dodd H.M., Gasson M.J (1994) Bacteriocins of lactic acid bacteria In: Gasson MJ, De Vos WM, editors Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria London: Blackie Academic and Professional London; pp 211–251 17 Dovičičová M., Tančinová D., Labuda R., Sulyok M., (2012) Aspergillus parasiticus from wheat grain of Slovak origin and its toxigenic potency Czech J Food Sci., 30: 483–487 18 Dyer S.K., (1994) Detection of toxigenic isolates of Aspergillus flavus and related species on coconut cream agar J Appl Bacteriol 1994, 76(1), 75–78 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 19 Edds GT, Nair NP, Simpson CF (1973) Effect of AFB1 on resistance in poultry against cecal coccidiosis and Marek's disease Am J Vet Res, Vol.34, pp.819-826 20 El-Gendy SM, Marth EH (1981) Growth and aflatoxin production by Aspergillus parasticus in the presence of Lactobacillus casei J Food Prot 44:211–212 21 Emma W.G., Simeon O K., (2006) The Use of Trichoderma harzianum and T viride as Potential Biocontrol Agents Against Peanut Microflora and Their Effectiveness in Reducing Aflatoxin Contamination of Infected Kernels No 439447 22 Gachomo E W., Kotchoni O S., (2008) The use of T harzianum and T viride as potential biocontrol agents against peanut microflora and their effectiveness in reducing aflatoxin contamination of infected kernels Biotechnology, 7(3), 439-447 23 Ghiasian SA, Shephard GS, Yazdanpanah H (2011) Natural Occurrence of Aflatoxins from Maize in Iran Mycopathologia 4: 1573-0832 24 Groopman JD, Donahue PR, Zhu J, Chen J, Wogan GN (1985) Aflatoxin metabolism in humans Detection of metabolites and nucleic acid adducts in urine by affinity chromatography Proc Natl Acad Sci , USA, Vol.82, pp.6492-6497 25 Hedayati MT, Pasqualotto AC, Warn PA, Bowyer P, Denning DW (2007) Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin producer Microbiology Jun;153(Pt 6):1677-92 26 Jones FT, Beth M, Genter MM, Hagler WM, Hansen JA, Mowrewy BA, Poore MH, Whitlow LW (1994) Understanding and coping with effects of mycotoxins in livestock feed and forage Electronic publication No DRO-29, NCCES, North Carolina State Univ., Raleigh, North Carolina 27 Kabara J, Eklund T (1991) Organic acid and esters In N J Russel & G W Gould (Eds.), Food preservatives (pp 44–71) London: Blackie 28 Keeler R.F, Tu A.T (1983) Handbook of natural toxins Vol.I Plant and fungal toxin, pp.308, New York, Marcal Dekker, Ine 29 Krishnamachari K.A., Bhat R.V., Nagarajan V., Tilak T.B (1975a) Investigations into outbreak of hepatitis in parts of Western India Indian J Med Res, Vol.63, pp.1036-1049 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 30 Krishnamachari K.A., Bhat R.V., Nagarajan V., Tilak T.B (1975b) Hepatitis due to aflatoxicosis An outbreak in Western India Lencet i pp.1061-1062 31 Lavermicocca P., Valerio F., Evidente A., Lazzaroni S., Corsetti A., Gobetti M (2000) Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B Appl Environ Microbiol 66:4084–4090 32 Lindgren S.E., Dobrogosz W.J (1990) Antagonistic activities of lactic acid bacteria in food and feed fermentations FEMS Microbiol Rev 7:149–163 33 Magnusson J., Schnürer J coryniformis subsp coryniformis strain (2001) SI3 produces Lactobacillus a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound Appl Environ Microbiol ;67: 1–5 34 Martins ML, Martins HM, Bernardo F (2001) Aflatoxins in spices marketed in Portugal Food Addit Contam Apr;18 (4):315-9 35 Moss MO (2008) Fungi, quality and safety issues in fresh fruits and vegetables J Appl Microbiol May; 104(5):1239-43 doi: 10.1111/j.1365- 2672.2007.03705.x Epub 2008 Jan 23 36 Niku-Paavola ML, Laitila A, Mattila-Sandholm T, Haikara A (1999) New types of antimicrobial compound produced by Lactobacillus plantarum Journal of Applied Microbiology, 86, 29–35 37 Odoemelam SA, Osu CI (2009) Aflatoxin B(1) Contamination of Some Edible Grains Marketed in Nigeria E-Journal of Chemistry 6: 308-314 38 Okkers DJ, Dicks LMT, Silvester M, Joubert JJ, Odendaal HJ (1999) Characterization of pentocin TV35b acteriocin-like peptide isolate from Lactobacillus pentosus with fungistic effect on Candida albicans J Appl Microbiol 87:726–734 39 Palumbo JD, Baker JL, Mahoney NE (2006) Isolation of bacterial antagonists of Aspergillus flavus from almonds Microb Ecol 52:45&52 40 Patterson DS, Galaney EM, Roberts BA (1978) The estimation of AFM1 in milk using 2-dimensional TLC.Fd.Cosmet toxicol, Vol.16, pp.49-50 41 Radostits OM, Gay CC, Blood DC, Hinchcliff KW (2000) Veterinary medicine, pp.1684-1688, W.B Saunders Co Ltd., London Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 42 Richard Lawley (2013) Aflatoxin Food Safety Watch The science of safe food February 43 Rouse S, Harnett D, Vaughan A, Sinderen D (2008) Lactic acid bacteria with potential to eliminate fungal spoilage in foods Journal of Applied Microbiology, 104, 915–923 44 Saori A, Nancy PK (2011) Aspergillus flavus Annual Review of Phytopathology Vol 49: 107-133 (Volume publication date September) DOI: 10.1146/annurev-phyto-072910-095221 45 Schaafsma AW, Hooker DC (2007) Climatic models to predict occurrence of Fusarium toxins in wheat and maize Int J Food Microbiol Oct 20;119(1-2):11625 Epub 2007 Aug 19 46 Seo JH, Min WK, Kweon DH, Park K, Park YC (2011) Characterisation of monoclonal antibody against aflatoxin B1 produced in hybridoma 2C12 and its single-chain variable fragment expressed in recombinant Escherichia coli Food Chemistry 126: 1316-1323 47 Sjogren J, Magnusson J, Broberg A, Schnürer J, kenne L (2003) Antifungal 3hydroxyl fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB14 Applied and Environmental Microbiology, 69, 7554–7557 48 Smith BP (2002) Large animal internal medicine 3rd ed pp.1627-1637 Mosby, Inc USA 49 Sonomoto K, Yokota A (editor) (2011) Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria: Current Progress in Advanced Research Caister Academic Press ISBN 978-1904455-82-0 50 Strom K, Sjogren J, Broberg A, Schnurer J (2002) Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo (L-Phe-L-Pro) and cyclo (L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and phenyllactic acid Applied and Environmental Microbiology, 68, 4322–4327 51 Vargas EA, Preis RA, Castro L, Silva CM (2001) Co-occurrence of aflatoxins B1, B2, G1, G2, zearalenone and fumonisin B1 in Brazilian corn Food Additive Contaminants 18: 981-986 52 Wang p, Afriyie-Gyawu E, Tang Y, Johnson NM, Xu L, Tang L, Huebner HJ, Ankrah NA, Ofori-Adjei D, Ellis W, Jolly PE, Williams JH, Wang JS, Phillips Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56 TD (2008) NovaSil clay intervention in Ghanaians at high risk for aflatoxicosis: II Reduction in biomarkers of aflatoxin exposure in blood and urine Food Additives and Contaminants: Part A: Chemistry, Analysis, Control, Exposure and Risk Assessment, 25:622-634 53 WHO, World Health Organization (1979) Environmental Health Criteria, Safety evaluation of certain food additives pp 1-127 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57