i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực công trình nghiên cứu nhận đƣợc nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo chân tình thầy cô, bạn đồng nghiệp quan Trƣớc hết cho gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Xuân Sâm GS TS Đặng Thị Thu – Bộ môn Hóa sinh – Vi sinh – Sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trƣờng đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hƣớng dẫn định hƣớng cho suốt trình nghiên cứu để hoàn thành luận án Tôi xin cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trƣờng đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ góp ý cho nhiều trình học tập nghiên cứu Nhân dịp cho gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp bạn bè đồng nghiệp, Trƣờng đại học Lâm nghiệp giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn giáo sƣ, phó giáo sƣ, tiến sĩ chủ tịch hội đồng, phản biện, thƣ ký ủy viên hội đồng dành thời gian quý báu để đọc tham gia hội đồng chấm luận án với góp ý cụ thể, gợi ý bổ ích, giúp hoàn thiện tốt nội dung nghiên cứu luận án Tôi vô cảm ơn khích lệ, động viên giúp đỡ nhiệt tình gia đình, bè bạn dành cho để hoàn thành luận án nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng Vũ Kim Dung năm 2015 ii LỜI CAM ĐOAN Luận án sản phẩm khoa học thuộc đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất Pectic oligosaccharide (POS) enzyme ứng dụng chế biến thực phẩm chức năng” mã số ĐT.04.14/CNSHCB, thuộc Đề án phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 Bộ Công thƣơng Là ngƣời tham gia trực tiếp nội dung thuộc đề tài đƣợc trình bày luận án này, xin cam đoan số liệu kết nêu luận án trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác đƣợc chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án Việc tham khảo nguồn tài liệu đƣợc thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo theo yêu cầu Hà Nội, ngày tháng năm 2015 GVHD GVHD Tác giả Nguyễn Thị Xuân Sâm Đặng Thị Thu Vũ Kim Dung iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH xi MỞ ĐẦU 1 TỔNG QUAN 1.1 Prebiotic pectic oligosaccharide 1.1.1 Prebiotic 1.1.2 Pectic oligosaccharide (POS) – nguồn prebiotic tiềm 1.1.2.1 Cấu tạo 1.1.2.2 Đặc tính sinh học POS 1.2 Cơ chất pectin 1.2.1 Cấu tạo 1.2.2 Pectin từ vỏ chanh leo 11 1.2.3 Enzyme thủy phân pectin 12 1.3 Endopolygalacturonase 13 1.3.1 Vai trò nguồn thu 13 1.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến thu nhận endopolygalacturonase 14 1.3.2.1 Ảnh hƣởng chất cảm ứng nguồn carbon 14 1.3.2.2 Ảnh hƣởng nguồn nitơ 15 1.3.2.3 Ảnh hƣởng yếu tố khác 16 1.3.3 Đột biến cải tạo chủng 16 1.3.4 Tách tinh enzyme 18 1.3.4.1 Thu chế phẩm endopolygalacturonase thô 18 1.3.4.2 Các phƣơng pháp kết tủa lọc 18 iv 1.3.4.3 Tinh endopolygalacturonase 19 1.3.5 1.4 Đặc tính xúc tác 20 Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide (POS) 21 1.4.1 Các yếu tố ảnh hƣởng tới trình thủy phân 23 1.4.2 Tách, tinh 24 1.4.3 Sấy tạo sản phẩm 26 1.5 Các phƣơng pháp đánh giá pectic oligosaccharide (POS) 26 1.5.1 Phân tích định tính 26 1.5.2 Phân tích định lƣợng 27 1.5.3 Đánh giá hoạt tính sinh học 29 1.5.3.1 Đánh giá hoạt tính prebiotic điều kiện in vitro 29 1.5.3.2 Đánh giá hoạt tính prebiotic điều kiện in vivo 30 1.5.3.3 Các số định lƣợng hoạt tính prebiotic 30 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 32 2.1.1 Vật liệu 32 2.1.2 Môi trƣờng 32 2.1.3 Hóa chất enzyme 33 2.1.4 Thiết bị 34 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh 35 2.2.1.1 Phân lập chủng sinh endopolygalacturonase 35 2.2.1.2 Xác định nấm sợi hình thái 35 2.2.1.3 Cải tạo chủng A niger sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao 35 2.2.1.4 Xác định điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp EPG cao 36 2.2.1.5 Xác định hoạt tính sinh học POS 37 v 2.2.1.6 Xác định vi sinh vật tổng số hiếu khí 37 2.2.1.7 Xác định Escherichia coli 37 2.2.1.8 Xác định Staphylococcus aureus 37 2.2.1.9 Xác định Salmonella 37 2.2.1.10 Thử nghiệm độc tính cấp pectic oligosaccharide 37 2.2.2 Phƣơng pháp hóa lý – sinh 38 2.2.2.1 Định lƣợng đƣờng khử DNS 38 2.2.2.2 Xác định hàm lƣợng POS Kit D-Galacturonic 38 2.2.2.3 Xác định hàm lƣợng POS HPAEC 40 2.2.2.4 Xác định hoạt độ polygalacturonase 40 2.2.2.5 Xác định hoạt độ endopolygalacturonase 40 2.2.2.6 Xác định hàm lƣợng protein 40 2.2.2.7 Tinh endopolygalacturonase 40 2.2.2.8 Điện di protein 42 2.2.2.9 Khảo sát đặc tính endopolygalacturonase 42 2.2.2.10 Phƣơng pháp thu pectin từ vỏ chanh leo 43 2.2.2.11 Xác định hàm lƣợng pectin 43 2.2.2.12 Xác định số este hóa pectin 43 2.2.2.13 Xác định điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS 44 2.2.2.14 Xác định thành phần POS sắc ký mỏng 44 2.2.2.15 Phƣơng pháp tinh POS 44 2.2.2.16 Chế độ sấy phun 44 2.2.2.17 Bảo quản POS 44 2.2.2.18 Thử nghiệm sản xuất bánh quy xốp bổ sung POS 44 2.2.3 Phƣơng pháp toán học 45 2.2.3.1 Tối ƣu hóa sinh tổng hợp EPG từ A niger UV06-12-23 45 vi 2.2.3.2 Tối ƣu hóa trình thủy phân giới hạn pectin tạo POS 46 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 Nghiên cứu thu nhận endopolygalacturonase 48 3.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng A niger sinh tổng hợp EPG cao 48 3.1.2 Cải tạo chủng A niger CNTP 5037 có khả sinh tổng hợp EPG cao 51 3.1.2.1 Sàng lọc dòng đột biến sinh endopolygalacturonase cao 53 3.1.2.2 Cải tạo chủng kỹ thuật chiếu UV nhiều lần 55 3.1.3 Thu nhận đặc tính endopolygalacturonase từ A niger UV06-12-23 56 3.1.3.1 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp EPG 56 3.1.3.2 Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp EPG từ A niger UV06-12-23 60 3.1.3.3 Tách tinh EPG từ chủng A niger UV06-12-23 63 3.1.3.4 Đặc tính EPG từ chủng A niger UV06-12-23 66 3.2 Sản xuất pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo 72 3.2.1 Thu nhận chuyển hóa HM pectin thành LM pectin 72 3.2.2 Xác định điều kiện thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo POS 76 3.2.2.1 Lựa chọn nồng độ pectin 77 3.2.2.2 Tỷ lệ enzyme/cơ chất thích hợp 78 3.2.2.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ 79 3.2.2.4 Ảnh hƣởng pH 80 3.2.2.5 Ảnh hƣởng tốc độ khuấy 81 3.2.2.6 Ảnh hƣởng thời gian 82 3.2.2.7 Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân pectin tạo POS 84 3.2.3 Thu hồi tinh POS từ dịch thủy phân 88 3.2.3.1 Tinh POS kỹ thuật lọc màng 88 3.2.3.2 Tinh POS qua cột sắc ký 89 3.2.4 Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm POS 91 vii 3.3 Nghiên cứu đánh giá hoạt tính thăm dò khả ứng dụng POS 100 3.3.1 Hoạt tính sinh học 100 3.3.1.1 Ảnh hƣởng POS đến phát triển vi khuẩn có lợi có hại 100 3.3.1.2 Khả tăng sinh vi khuẩn có lợi POS prebiotic khác 103 3.3.1.3 Xác định điểm hoạt tính prebiotic POS 104 3.3.2 Đánh giá chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm chế phẩm POS 105 3.3.2.1 Kiểm tra chất lƣợng sản phẩm 105 3.3.2.2 Thử nghiệm độc tính cấp sản phẩm chuột 107 3.3.3 Thử nghiệm sản xuất bánh quy xốp bổ sung POS 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112 4.1 Kết luận 112 3.4 Kiến nghị 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 PHỤ LỤC 128 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích DE Mức độ este hóa (Degree of esterication) DP Mức độ trùng hợp (Degree of polymerization) EPG Endopolygalacturonase FPLC Sắc ký nhanh protein lỏng hiệu cao (Fast performance liqiquid chromatography) G1 Monogalacturonic acid G2 Digalacturonic acid G3 Trigalacturonic acid HGA Homogalacturonan HM Pectin có mức độ methyl hóa cao (High methyl este) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liqiquid chromatography) kDa Kilo Dalton Kdo 2-keto-3-deoxy-mano-octulosonic LM Pectin có mức độ methyl hóa thấp (Low metyl este) NAOS Neoagaro oligosaccharides PMG Polymethylgalacturonase PMGL Polymetylgalacturonate lyase PG Polygalacturonase PGL Polygalacturonate lyase POS Pectic oligosaccharide PE Pectinesterase RG I Rhamnogalacturonan I RG II Rhamnogalacturonan II TE Transelimilase TLC Sắc ký mỏng (Thin layer chromatography) v/v Thể tích/ thể tích (Vol/vol) w/v Ttrọng lƣợng/ thể tích (Weight/vol) w/w Trọng lƣợng/ trọng lƣợng (Weight/weight) ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lƣợng pectin loại trái Bảng 1.2 Thành phần vỏ chanh leo 12 Bảng 1.3 Khả tổng hợp polygalacturonase nguồn chất khác 15 Bảng 1.4 Đặc tính endopolygalacturonase 20 Bảng 2.1 Hóa chất, dụng cụ enzyme 33 Bảng 2.2 Máy, thiết bị 34 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp 38 Bảng 2.4 Thành phần trình tự thí nghiệm định lƣợng galacturonic acid theo 39 Kit D-galacturonic 39 Bảng 2.5 Các yếu tố tối ƣu nghiên cứu sinh tổng hợp endopolygalacturonase từ chủng A niger UV06-12-23 45 Bảng 2.6 Ma trận thực nghiệm tối ƣu hóa sinh tổng hợp EPG từ A niger UV06-12-23 46 Bảng 2.7 Các biến số nghiên cứu tối ƣu hóa trình thủy phân giới hạn pectin tạo POS 47 Bảng 2.8 Ma trận thực nghiệm tối ƣu hóa trình thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo POS 47 Bảng 3.1 Nguồn gốc đặc điểm chủng nấm mốc phân lập từ nguồn vỏ 48 Bảng 3.2 Giá trị bán kính vòng thủy phân chủng nấm mốc thử nghiệm 49 Bảng 3.3 Hoạt độ polygalacturonase chủng nấm mốc thử nghiệm 50 Bảng 3.4 Hoạt độ endopolygalacturonase chủng nấm mốc thử nghiệm 51 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng thời gian chiếu xạ tới tỉ lệ sống A niger CNTP 5037 52 Bảng 3.6 Khả tổng hợp endopolygalacturonase chủng xử lý UV 53 Bảng 3.7 Khả sinh tổng hợp endopolygalacturonase chủng cải tạo qua lần cấy truyền 54 Bảng 3.8 Khả sinh tổng hợp endopolygalacturonase dòng xử lý UV nhiều lần qua lần cấy truyền 55 x Bảng 3.9 Khả sinh EPG A niger UV06-12-23 qua lần cấy truyền 56 Bảng 3.10 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố hoạt độ EPG thu đƣợc điều kiện nuôi cấy khác 61 Bảng 3.11 Kết phân tích phƣơng sai mô hình tối ƣu phần mềm DX7.1.5 62 Bảng 3.12 Hoạt độ EPG phân đoạn tƣơng ứng với đỉnh thu đƣợc tinh 64 Bảng 3.13 Các bƣớc tinh EPG từ A niger UV06-12-23 65 Bảng 3.14 Vận tốc phản ứng endopolygalacturonase nồng độ chất khác 70 Bảng 3.15 Thành phần pectin tách chiết từ vỏ chanh leo 75 Bảng 3.16 Ảnh hƣởng thời gian đến chuyển hóa HM pectin thành LM pectin 76 Bảng 3.17 Ma trận thực nghiệm trình thủy phân pectin tạo POS 84 Bảng 3.18 Kết phân tích phƣơng sai ANOVA mô hình 85 Bảng 3.19 Hiệu trình thủy phân pectin vỏ chanh leo enzyme 88 Bảng 3.20 Hiệu suất thu hồi POS sau lọc dòng ngang 89 Bảng 3.21 Hiệu suất thu hồi POS sau lọc gel 90 Bảng 3.22 Ảnh hƣởng hàm lƣợng chất khô dịch POS trƣớc sấy phun 92 Bảng 3.23 Ảnh hƣởng chế độ sấy đến hiệu suất chất lƣợng sản phẩm 93 Bảng 3.24 Kết đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật sau ngày bảo quản 95 Bảng 3.25 Kết đánh giá chất lƣợng POS lỏng sau tháng bảo quản 96 Bảng 3.26 Chất lƣợng POS dạng bột sau 12 tháng bảo quản 96 Bảng 3.27 Ảnh hƣởng POS tới phát triển vi khuẩn có lợi gây hại 100 Bảng 3.28 Ảnh hƣởng POS tới phát triển đồng thời vi khuẩn có lợi có hại 101 Bảng 3.29 Kết phân tích hoạt tính sinh học POS thô dạng bột 102 Bảng 3.30 Kết phân tích tiêu vi sinh vật kim loại POS thành phẩm 106 Bảng 3.31 Bảng theo dõi trọng lƣợng chuột cho ăn POS 108 Bảng 3.32 Xác định công thức bánh quy xốp bổ sung POS 110 -124- 96 Onumpai C., Kolida S., Bonnin E., Rastall R.A (2011) Microbial utilization and selectivity of pectin fractions with various structures Applied and Environmental Microbiology 77(16), pp 5747 – 5754 97 Palframan R., Gibson G.R., Rastall R.A (2003) Development of a quantitative tool for the comparison of the prebiotic effect of dietary oligosaccharides Letters in Applied Microbiology 37(4), pp 281 - 284 98 Parenicová L., Benen J.A., Kester H.C., Visser J (1998) pgaE encodes a fourth member of the endopolygalacturonase gene family from Aspergillus niger European Journal of Biochemistry 251(1-2), pp 72 - 80 99 Pasha K.M., Anuradha P., Rao D.S (2013) Purification and properties of polygalacturonase from a novel strain Aspergillus foetidus MTCC 10367 International Journal of Advanced Research 1(6), pp 104 - 108 100 Phutela U., Dhuna V., Sandhu S., Chadha B.S (2005) Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels Brazilian Journal of Microbiology 36, pp 63 - 69 101 Pilnik W., Voragen A.G.J (1992) Gelling agents (pectins) from plants for food industry Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 1, pp 219 - 270 102 Pinheiro E.R., Silva I.M.D.A., Gonzaga L.V., Amante E.R., Teofilo R.F., Ferreira M.M.C., Amboni R.D.M.C (2008) Optimization of extraction of high-ester pectin from passion fruitpeel (Passiflora edulisflavicarpa) with citric acid by usingresponse surface methodology Bioresource Technology 99, pp 5561 – 5566 103 Polakovic M., Bryjak J (2004) Modelling of potato starch saccharification by an Aspergillus niger glucoamylase Biochemical Engineering Journal 18, pp 57 - 64 104 Qiang X., Yonglie C., Qianbing W (2009) Health benefit application of functional oligosaccharides Carbohydrate Polymers 77, pp 435 - 441 105 Radha S., Babu R.H., Sridevi A., Prasad N.B.L., Narasimha G (2012) Development of mutant fungal strains of Aspergillus niger for enhanced production of acid protease in submerged and solid state fermentation European Journal of Experimental Biology 2(5), pp 1517 - 1528 106 Rajmane S.D., Korekar S.L (2012) Impact of carbon and nitrogen sources on pectinase production of post-harvest fungi Current Botany 3(3), pp 01 - 20 -125- 107 Ralet M.C., Cabrera J.C., Bonnin E., Quemener B., Hellın P., Thibault J.F (2005) Mapping sugar beet pectin acetylation pattern Phytochemistry 66(15), pp 1832 1843 108 Ralet M.C., Crepeau M.J., Bonnin E (2008) Evidence for a blockwise distribution of acetyl groups onto homogalacturonans from a commercial sugar beet (Beta vulgaris) pectin Phytochemistry 69(9), pp 1903 - 1909 109 Ramachandran C., Wilk B.J., Hotchkiss A., Chau H., Eliaz I., Melnick S.J (2011) Activation of human T-Helper/inducer cell, T-cytotoxic cell, B-cell, and Natural Killer (NK)-cell and induction of natural killer cell activity against K562 chronic myeloid leukemia cells with modified citrus pectin BMC Complementary & Alternative Medicine 11(59), pp 1-9 110 Rastall R., Gibson G., Gill H., Guarner F.,Klaehammer T (2005) Modulation of the microbial ecology of human colon by probiotics, prebiotics and synbiotics to enhance human health: an overview of enabling science and potential applications FEMS Microbiology Ecology 52, pp 145 - 152 111 Rhoades J., Manderson K., Wells A., Hotchkiss A.T., Gibson G.R., Formentin K (2008) Oligosaccharide-mediated inhibition of the adhesion of pathogenic Escherichia coli strains to human gut epithelial cells in vitro Journal of Food Production 71(11), pp 2272 - 2277 112 Sabajanes M.M., Yáñez R., Alonso J.L., Parajó J.C (2012) Pectic oligosaccharides production from orange peel waste by enzymatic hydrolysis International Journal of Food Science & Technology 47(4), pp 747 – 754 113 Saeed A., Naser F (2013) Product optimization, purification and characterization of a novel polygalacturonase produced by Macrophomina phaseolina Biological Journal of Microorganism 1(4), pp 21-34 114 Sangkharak K., Vangsirikul P., Janthachat S (2012) Strain improvement and optimization for enhanced production of cellulase in Cellulomonas sp TSU-03 African Journal of Microbiology Research 6(5), pp 1079 - 1084 115 Schnitzhofer W., Weber H.J., Vrsanska M., Biely P., Paulo A.C., Guebitz G.M (2007) Purification and mechanistic characterisation of two polygalacturonases from Sclerotium rolfsii Enzyme and Microbial Technology 40, pp 1739 - 1747 116 Shafique S., Bajwa R., Sobiya S (2011) Strain improvement in Trichoderma viride through mutation for overexpression of cellulase and characterization -126- of mutants using random amplified polymorphic DNA (RAPD) African Journal of Biotechnology 10(84), pp 19590 - 199597 117 Sharma B.R., Naresh L., Dhuldhoya N.C, Merchant S.U., Merchant U.C (2006) An overview on pectins Times Food Processing Journal June-July, pp 44 - 51 118 Soroor M.A.M., Ghazy A.M., Mahdy E.M.S., ElBadery M.O., Shousha W.G., El-Khonezy M.I (2013) Purification and characterization of polygalacturonases produced by Trichoderma reesei F418 using Lemon peels and rice straw under solid-state fermentation Journal of Applied Sciences Research 9(4), pp 3184 - 3198 119 Stratilova E., Dzurova M., Breierova E., Omelkova J (2005) Purification and biochemical characterization of polygalacturonases produced by Aureobasidium pullulans Naturforsch 60c, pp 91 - 96 120 Sullivan L.O., Murphy B., McLoughlin P., Duggan P., Lawlor P.G., Hughes H., Gardiner G.E (2010) Prebiotics from marine macroalgae for human and animal health applications Marine Drugs 8, pp 2038 – 2064 121 Thakur A., Pahwa R., Singh S., Gupta R (2010) Production, purification and characterization of polygalacturonase from Mucor circinelloides ITCC 6025 Enzyme Research, pp - 122 Transparency Market Research (2013) Prebiotic ingredients market – global industry analysis, size, share, trends, and forecast, 2012 – 2018 123 Uzoma O.A., Ihuaku O.V., Joy O., Adedotun A.A., Albert E.O., Blessing O.M (2009) Pectinase production by UV-2DG resistant mutant of Aspergillus niger with a catabolite repression resistance activity FASEB Journal, http://www.fasebj.org/cgi/content/meeting_abstract/23/1_MeetingAbstracts/499.1 124 Vos A.P., Esch B.C, Stahl B., Rabet L.M., Folkerts G., Nijkamp F.P (2007) Dietary supplementation with specific oligosaccharide mixtures decreases parameters of allergic asthma in mice International Immunopharmacology 7(12), pp 1582 - 1587 125 Vu V.H., Pham T.A., Kim K (2009) Fungal strain improvement for cellulase production using repeated and sequential mutagenesis Mycobiology 37(4), pp 267 - 271 126 Wang Y., Han F., Hu B., Li J.B., Yu W.G (2006) In vivo prebiotic properties of alginate oligosaccharides prepared through enzymatic hydrolysis of alginatea Nutrition Research 26, pp 597 - 603 -127- 127 Westerbeek E.A.M., Berg J.P., Lafeber H.N., Fetter W.P.F., Boehm G., Twisk J.W.R., Elburg R.M (2010) Neutral and acidic oligosaccharides in preterm infants: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial 1–4 The American Journal of Clinical Nutrition 91, pp 679 - 686 128 Woosley B., Xie M., Wells L., Orlando R., Garrison D (2005) Comprehensive glycan analysis of recombinant Aspergillus niger endo-polygalacturonase C Analytical Biochemistry 354, pp 43-53 129 Yapo B.M., Robert C., Etienne I., Wathelet B., Paquot M (2007) Effect of extraction conditions on the yield, purity and surface properties of sugar beet pulp pectin extracts Food Chemistry 100, pp 1356 – 1364 130 Yapo B.M., Wathelet B., Paquot M (2007) Comparison of alcohol precipitation and membrane filtration effects on sugar beet pulp pectin chemical features and surface properties Food Hydrocolloid 21, pp 245 - 255 131 Yu L., Zhang X., Shanshan L., Xiaoyu L., Sun L., Haibo L (2010) Rhamnogalacturonan I domains from ginseng pectin Carbohydrate Polymers 79(4), pp 811 - 817 132 Zambare V (2010) Strain improvement of alkaline protease from Trichoderma reesei MTCC-3929 by physical and chemical mutagen The IIOAB Journal 1(1), pp 25 - 28 133 Zeni J., Cence K., Grando C.E., Tiggermann L., Colet R., Lerin L.A., Cansian R.L., Toniazzo G., Oliveira D., Valduga E (2011) Sceening of pectinase producing microorganisms with polygalacturonase activity Applied Biochemistry and Biotechnology 163, pp 383 - 392 134 Zhou H., Li X., Guo M., Cao Y., Qiao D., Xu H (2015) Secretory expression and characterization of an acidic endo-polygalacturonase gene from Aspergillus niger SC323 in Saccharomyces cerevisiae Journal of Microbiology and Biotechnology 25(7), pp 999 - 1006 135.http://www.prweb.com/releases/prebiotics/prebiotic_ingredients/prweb362554 4.htm: Prweb (2010) Prebiotics: A US & European market report Global Industry Analysts, Inc -128- PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Các hình bảng số liệu kết phân lập, tuyển chọn cải tạo chủng A niger sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao 5037 Hình PL1.1 Khuẩn lạc chủng A niger nuôi môi trƣờng chứa 1% pectin, sau ngày 30OC Giếng 17: CNTP 5037 Giếng 4: CNTP 5004 Giếng 32: CF1 Giếng 34: C2 Giếng 30: B3 Hình PL1.2 Vòng thủy phân chất pectin enzyme từ số chủng nấm mốc thử nghiệm (0,1 ml/lỗ, giờ, 50oC) -129- n P ột số h nh ảnh vòng thủ ph n chủng đột biến -130Bảng PL1.1 Giá trị D/d thu từ chủng A niger CNTP 5037 xử lý UV TT d (mm) D (mm) D/d TT d (mm) D (mm) D/d 3,0 12,0 4,0 27 3,0 11,0 3,6 3,0 11,0 3,7 28 2,0 10,0 5,0 3,0 10,0 3,3 29 3,0 10,0 3,3 3,0 12,0 4,0 30 2,0 11,0 5,5 3,0 11,0 3,7 31 2,0 12,0 6,0 3,0 10,0 3,3 32 3,0 12,0 4,0 1,0 6,0 6,0 33 1,5 11,0 7,3 3,0 12,0 4,0 34 3,0 12,0 4,0 2,0 8,0 4,0 35 3.5 14,0 4,0 10 2,0 8,0 4,0 36 2,0 9,0 4,5 11 3,0 10,0 3,3 37 4,0 15,0 3,8 12 1,5 11,0 7,3 38 5,0 16,0 3,2 13 2,0 12,0 6,0 39 5,0 17,0 3,4 14 2,5 10,0 4,0 40 4,0 14,0 3.5 15 3,0 10,0 3,0 41 2,0 9,0 4,5 16 2,0 11,0 5,5 42 5,0 16,0 3,2 17 2,0 10,0 5,0 43 2,0 11,0 5.5 18 1,0 9,0 9,0 44 2,0 7,0 3,5 19 2,0 8,0 4,0 45 2,0 12,0 6,0 20 3,0 11,0 3,7 46 3,0 12,0 4,0 21 3,0 11,0 3,7 47 2,5 11,0 4,4 22 1,5 9,0 6,0 48 3,5 16,0 4,5 23 2,0 8,0 4,0 46 4,0 14,0 4,4 24 2,0 8,0 4,0 47 3,0 10,0 3,3 25 2,0 10,0 5,0 48 3,0 11,0 3,3 26 2,0 10,0 5,0 ĐC 5,0 12,0 2,5 -131- PHỤ LỤC 2: Các bảng số liệu kết thu nhận đặc tính endopolygalacturonase từ A niger UV06-12-23 Bảng PL2.1 Ảnh hƣởng nồng độ ammonium sulfat bão hòa đến hiệu suất thu nhận EPG Nồng độ ammonium sulfat bão hòa (%) Hoạt độ EPG tổng (U) 10.950 Hiệu suất thu hồi (%) 100 60 4.785 43,70 70 6.042 55,18 80 7.013,5 64,05 85 7.416 67,73 90 6.208 56,69 Bảng PL2.2 Ảnh hưởng nồng độ ethanol tới hiệu suất thu nh n EPG Nồng độ Ethanol Hoạt độ EPG tổng Hiệu suất thu hồi (%) (U) (%) 10.950 100 60 4.984 45,52 70 8.015 73,20 80 7.673 70,07 Bảng PL2.3 Hiệu suất c đặc thu hồi EPG phương pháp lọc (màng lọc 10 kDa) Thể tích Hoạt độ tổng Hiệu suất (ml) (U) (%) Dịch EPG thô 1000 10.950 100 Dịch sau lọc cut-off 100 9.187 83,90 -132- PHỤ LỤC 3: Các bảng số liệu nghiên cứu điều kiện thủy phân giới hạn pectin chanh leo nồng độ 1% tạo POS A B C D E Hình PL3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ enzym (A), pH (B), nhiệt độ (C), tốc độ khuấy (D) thời gian (E) đến trình thủy phân giới hạn pectin tạo POS -133- PHỤ LỤC 4: Các bảng số liệu nghiên cứu tối ƣu a điều kiện thủy phân giới hạn pectin chanh leo nồng độ 1% tạo POS Bảng PL4.1 Ma tr n thực nghiệm trình thủy phân pectin tạo POS TN X1 X2 X3 POS (mg/ml) TN X1 X2 X3 POS (mg/ml) 35 15 250 4,25 10 40 25 200 5,81 45 15 250 4,37 11 40 15 300 4,02 35 25 250 5,27 12 40 25 300 5,30 45 25 250 5,67 13 40 20 250 5,48 35 20 200 5,05 14 40 20 250 5,53 45 20 200 5,19 15 40 20 250 5,43 35 20 300 4,18 16 40 20 250 5,41 45 20 300 4,55 40 15 200 4,79 17 40 20 250 5,48 Bảng PL4.2 Kết ph n tích phương sai ANOVA mô hình Thông số Phƣơng sai Chuẩn F Mức có nghĩa p Thông số Phƣơng sai Chuẩn F Mức có nghĩa p Mô hình 5,18 256,48 < 0,0001 X2.X3 0,02 7,83 0,0266 Nhiệt độ (X1) 0,13 58,57 0,0001 X12 0,70 310,91 < 0,0001 Tỷ lệ Enzym/cơ chất (X2) 2,66 1185,80 < 0,0001 X22 0,12 54,37 0,0002 Tốc độ khuấy (X3) 0,97 432,40 < 0,0001 X32 0,42 187,99 < 0,0001 0,0229 Không tƣơng thích 0,01 1,06 0,4594 X1.X2 0,02 8,43 1: Monogalacturonic acid 2: Dịch thủy phân pectin 1% trước tối ưu 3: Dịch thủy phân pectin 1% sau tối ưu 4: Mono, Di, Tri – galacturonic acid Hình PL4.3 Sản phẩm thủy phân giới hạn pectin tạo POS sau tối ưu -134- PHỤ LỤC 5: Tính toán hiệu suất tạo POS từ pectin vỏ chanh leo Bảng PL5.1 Hiệu suất trình sản xuất POS Thể tích Khối lƣợng Khối lƣợng Khối lƣợng Hiệu suất thủy phân pectin (g) POS (g) sản phẩm trình sản xuất POS bột (g) POS (%) (lít) 150 120 250 80 60 1800 1382 2560 76,8 Thể tích dịch thủy phân: 60 lít Thể tích sau lọc nano: 20 lít Lƣợng POS dịch: 7,5 độ Bx, tỷ khối g/ml nên lƣợng POS = 20 x 0,075 = 1,5 kg Lƣợng maltodextrin cần bổ sung để đạt 12 độ Bx: tỷ khối 1,1 g/ml Lƣợng chất khô có 20 lít dung dịch có hàm lƣợng chất khô 12oBx là: 20 x 1,1 x 0,12 = 2,64 kg Lƣợng maltodextrin cần bổ sung: 2,64 – 1,5 = 1,14 kg Sau sấy thu đƣợc 2,56 kg với độ ẩm 5% Lƣợng chất khô bột POS: 2,56 (1-0,05) = 2,432 kg Tổn thất trình sấy phun: 2,64 – 2,432 = 0,208 kg Phần trăm tổn thất trình sấy phun: (0,208/2,64) x 100% = 7,9 % Lƣợng POS bột thu đƣợc sau sấy: 1,5 x (1 - 0,079) = 1,3815 kg Hiệu suất trình sản xuất POS từ pectin vỏ chanh leo: (1,3815/1,8) x 100% = 76,75% -135- PHỤ LỤC 6: Một số hình ảnh trình sản xuất pectin, POS ứng dụng A B D E C F Hình PL6.1 Một số hình ảnh trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo A: vỏ chanh leo vàng, B: vỏ chanh leo tím, C: cắt nguyên liệu thành mảnh nhỏ D: ủ hỗm hợp acid citric, E: kết tủa pectin, F: pectin từ vỏ chanh leo vàng A C B D E Hình PL6.2 Một số hình ảnh trình thu nh n pectin quy mô pilot A: vỏ chanh leo, B: thiết bị nghiền trục vít C: c đặc dịch chiết pectin thiết bị c đặc chân không, D: thu pectin kết tủa thiết bị ép, E: sản phẩm pectin -136- B A C D E Hình PL6.3 Nguyên liệu bánh quy xốp bổ sung POS A: nguyên liệu làm bánh, B: bánh đối chứng, C: bánh bổ sung POS 1%, D: bánh bổ sung POS 2%, E: bánh bổ sung POS 3% -137- PHỤ LỤC 7: Ản ƣởng POS tới phát triển vi khuẩn Bảng P Số lượng khuẩn lạc vi khuẩn (107 cfu/ml) đồng nu i cấ sau 24 gi m i trư ng bổ sung POS Vi khuẩn Tổng số lƣợng khuẩn lạc tăng sau 24 L acidophilus Vi khuẩn có hại L acidophilus + S typhi 672,75 ± 7,50 658,25 ± 7,25 14,50 ± 0,01 L acidophilus + E coli 616,00 ± 5,85 605,00 ± 6,10 11,00 ± 0,02 L acidophilus + S aureus 619,95 ± 6,05 591,45 ± 6,05 28,50 ± 0,02 A1 A2 A3 A4 A5 B1 B2 B3 B4 B5 C1 C2 C3 C4 C5 D1 D2 D3 D4 D5 E1 E2 E3 E4 E5 Hình PL 7.1 Một số chủng Lactobacillus m i trư ng bổ sung prebiotic (glucose (1), POS (2), MOS (3), FOS (4), Inulin (5)) A1 – A5: L rhamnosus nuôi sau 24 gi ; B1 – B5: L acidophilus nuôi sau 24 gi ; C1 – C5: L bulgaricus nuôi sau 24 gi ; D1 – D5: L plantarum nuôi sau 24 gi ; E1 – E5: L johnsonii nuôi sau 24 gi -138- PHỤ LỤC 8: Các kết p ân tíc àm lƣợng aflatoxin endopolygalacturonase từ chủng đột biến A niger UV06-12-23 hoạt tính sinh học, chất lƣợng, an toàn vệ sinh thực phẩm độc tính cấp POS [...]... sản phẩm pectin với tên thƣơng mại GRINDSTED Pectin của hãng Danisco) 1.2.2 Pectin từ vỏ chanh leo Chanh leo (chanh dây) là cây leo thân gỗ, thu c họ Passifloraceae và có nguồn gốc từ Brazil Chanh leo vào Việt Nam có hai giống, phân biệt bằng xuất xứ và màu vỏ Giống chanh leo vỏ vàng có nguồn gốc từ Sirilanca, Urganda và Hawaii có mặt ở Việt Nam với tên gọi là chanh dây hay lạc tiên Giống chanh leo vỏ... thủy phân pectin tạo POS bằng enzyme Từ những mối quan tâm trên, chúng tôi tiến hành thực hiện luận án: “Ng iên cứu thu nhận pectic oligosaccharide từ pectin vỏ chanh leo bằng endopolygalacturonase  Mục tiêu nghiên cứu - Thu nhận đƣợc nguồn endopolygalacturonase - Xây dựng đƣợc quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo bằng phƣơng pháp thủy phân giới hạn nhờ endopolygalacturonase - Nghiên cứu... điều kiện tách chiết đến hiệu suất thu pectin chanh leo 72 pH, nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ ethanol: dịch lọc 72 Hình 3.18 Sơ đồ quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo 73 Hình 3.19 Pectin vỏ chanh leo tím trƣớc và sau khi chuyển hóa 76 Hình 3.20 Ảnh hƣởng của nồng độ pectin đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo 77 Hình 3.21 Ảnh hƣởng... trong phân tử pectin để tạo thành pectic oligosaccharide (POS) và acid galacturonic Bên cạnh đó, Việt Nam là nƣớc nông nghiệp, có các nguồn nguyên liệu dồi dào từ phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin: vỏ cam, chanh, bƣởi, chanh leo Vỏ quả chanh leo chiếm khoảng 60% trọng lƣợng quả và chứa 2 – 3% pectin, là một nguồn phụ -2- phẩm đáng kể để thu nhận pectin Việc chuyển hóa nguồn pectin chanh leo thành POS... oligosaccharide (POS) Pectin từ chanh leo đã đƣợc tách chiết từ rất sớm (năm 1949 với vỏ chanh leo tím và năm 1953 đối với chanh leo vàng) Phân tích thành phần của vỏ chanh leo vàng và tím cho thấy chúng đều chứa hàm lƣợng carbohydrate cao và lƣợng protein thấp [129, 130] Báo cáo năm 2008 của Pinheiro E.R và cộng sự về thành phần vỏ chanh leo (bảng 1.2) hàm lƣợng chất xơ hòa tan trong vỏ chanh leo chiếm lƣợng... trong dịch thủy phân pectin chanh leo 78 Hình 3.22 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo 79 Hình 3.23 Ảnh hƣởng của pH đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo 80 Hình 3.24 Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy đến hàm lƣợng và thành phần POS trong dịch thủy phân pectin chanh leo ... tinh sạch và xác định đặc tính của enzyme từ chủng cải tạo 2 - Xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo + Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ chanh leo + Nghiên cứu điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS + Tách, tinh sạch và bảo quản chế phẩm POS 3 - Đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng chế phẩm POS thu đƣợc trong sản xuất thực phẩm chức năng + Đánh giá hoạt tính sinh học + Đánh giá... endopolygalacturonase trên cơ chất pectin đã đƣợc nghiên cứu và chứng minh [40] 1.4 Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide (POS) Pectic oligosaccharide là một prebiotic có nguồn gốc từ pectin Hiện nay có một số phƣơng pháp sản xuất POS bao gồm: tách chiết từ thực vật [34], tổng hợp và phân cắt pectin tạo POS [25] Việc chuyển hóa nguồn cơ chất pectin bởi các chủng vi sinh vật hoặc các chế phẩm pectinase... hợp khác nhau và endopolygalacturonase M2 cho hiệu suất tạo POS cao nhất 76% [26] Các mảnh oligogalacturonic có DP