KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KTCN TPHCM GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP - TỰ DO – HẠNH PHÚC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHOA:MT & CNSH BỘ MÔN:CNSH HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN THỊ THU NGÀNH: CNSH MSSV: 207111055 LỚP: 07CSH Đầu đề Khóa luận tốt nghiệp: CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH Nhiệm vụ (yêu cầu nội dung số liệu ban đầu): - Tổng quan Sâm Ngọc Linh - Tìm hiểu số qui trình nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh Ngày giao Khóa luận tốt nghiệp : 05/04/2010 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 28/06/2010 Họ tên người hướng dẫn CN BÙI VĂN THẾ VINH Phần hướng dẫn Toàn Nội dung yêu cầu KLTN thông qua Bộ môn Ngày tháng năm 2010 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH (Ký ghi rõ họ tên) (Ký ghi rõ họ tên) CN BÙI VĂN THẾ VINH PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN Người duyệt (chấm sơ bộ): ………………………………… Đơn vị:……………………………………………………… Ngày bảo vệ:………………………………………………… Điểm tổng kết:……………………………………………… Nơi lưu trữ Khóa luận tốt nghiệp: ………………………… SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH LỜI CẢM ƠN Vậy ba năm học mái trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ kết thúc Trong suốt thời gian học tập em nhận nhiều giúp đỡ tận tình từ phía thầy cô, gia đình bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quí thầy cô trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ nói chung quí thầy cô khoa Môi Trường Công Nghệ Sinh Học giảng dạy, truyền đạt kiến thức để em vững bước, tự tin với học Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy Bùi Văn Thế Vinh tận tình giúp đỡ, hướng dẫn suốt trình học tập thời gian làm khóa luận tốt nghiệp Xin cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ, để em có thêm nhiều động lực hoàn thành tốt khóa học Do nhiều hạn chế trình độ kiến thức nên tiểu luận nhiều hạn chế, thiếu sót Em mong quí thầy cô, bạn bè dạy, bổ sung thông cảm để em rút nhiều kinh nghiệm làm trình học tập Sinh viên thực Nguyễn Thị Thu TP.HCM, tháng năm 2010 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU DANH SÁCH CÁC HÌNH CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 01 1.1 Đặt vấn đề 01 1.2 Mục đích đề tài 02 CHƯƠNG II TỔNG QUAN 03 2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 0.3 2.1.1 Khái niệm .03 2.1.2 Các kỹ thuật nuôi cấy 04 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 08 2.1.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 09 2.1.5 Các nhân tố đảm bảo thành công nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.2 Giới thiệu Sâm Ngọc Linh 15 2.2.1 Phân loại .15 2.2.2 Đặc điểm hình thái 16 2.2.3 Sinh thái phân bố 18 2.2.4 Hiện trạng tiềm sâm Ngọc Linh 19 2.2.5 Thành phần hóa học 20 CHƯƠNG III CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH 27 3.1 Nuôi cấy mô sẹo 27 3.1.1 Nguyên liệu 27 3.1.2 Môi trường 27 3.1.3 Thiết bị dụng cụ 27 3.1.4 Hóa chất .27 3.1.5 Qui trình thực 28 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.1.6 Điều kiện nuôi cấy 28 3.2 Tái sinh chồi từ mô sẹo 29 3.2.1 Nguyên liệu 29 3.2.2 Môi trường 29 3.2.3 Thiết bị dụng cụ 29 3.2.4 Hóa chất .29 3.2.5 Qui trình thực 29 3.2.6 Điều kiện nuôi cấy 29 3.3 Nuôi cấy rễ 30 3.3.1 Nguyên liệu 30 3.3.2 Môi trường 30 3.3.3 Thiết bị dụng cụ 30 3.3.4 Hóa chất .30 3.3.5 Qui trình thực 31 3.3.6 Điều kiện nuôi cấy 31 3.4 Nuôi cấy sinh khối 31 3.4.1 Nguyên liệu 31 3.4.2 Môi trường 31 3.4.3 Thiết bị dụng cụ 31 3.4.4 Hóa chất .32 3.4.5 Qui trình thực 32 3.4.6 Điều kiện nuôi cấy 32 3.5 Tái sinh qua đường tạo phôi soma 33 3.5.1 Nguyên liệu 33 3.5.2 Môi trường 33 3.5.3 Thiết bị dụng cụ 33 3.5.4 Hóa chất .33 3.5.5 Qui trình thực 33 3.5.6 Điều kiện nuôi cấy 34 3.6 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh 35 3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng số loại chất khử trùng 35 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp hoocmon lên phát sinh hình thái 36 3.6.3 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả tạo mô sẹo từ cuống 37 3.6.4 Ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo 38 3.6.5 Ảnh hưởng auxin lên khả khởi tạo mô sẹo từ cuống 39 3.6.6 Ảnh hưởng auxin lên khả tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh 40 3.6.7 Ảnh hưởng BA NAA đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo 41 3.6.8 Ảnh hưởng BA lên trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro 43 3.6.9 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tăng trưởng chồi 43 3.6.10 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả tăng trưởng chồi invitro 44 3.6.11 Ảnh hưởng IAA, IBA, NAA đến khả rễ bất định từ mô sẹo .45 3.6.12 Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ bất định 46 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô 1210C 13 Bảng 2.2: Nồng độ thời gian sử dụng số chất xử lí mô cấy thực vật 14 Bảng 2.3: Hàm lượng số saponin sâm 20 Bảng 2.4: Hàm lượng saponin Sâm Ngọc Linh so sánh với loài Panax spp trồng trọt 21 Bảng 2.5: Các saponin yếu thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol 21 Bảng 2.6: Acid Oleanolic 22 Bảng 2.7: Ocotillol 22 Bảng 2.8: Các axid béo tìm thấy 23 Bảng 2.9: Thành phần acid amin chủ yếu 24 Bảng 2.10: Các nguyên tố vi lượng 25 Bảng 3.1: Ảnh hưởng loại nồng độ khử trùng 35 Bảng 3.2: Ảnh hưởng tổ hợp hoocmon lên phát sinh hình thái Sâm Ngọc Linh cấy mô 36 Bảng 3.3: Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả tạo mô sẹo từ cuống 37 Bảng 3.4: Ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo 38 Bảng 3.5: Ảnh hưởng auxin lên khả khởi tạo mô sẹo từ cuống 39 Bảng 3.6: Ảnh hường auxin lên khả tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh 40 Bảng 3.7: Khả tái sinh chồi từ mô sẹo môi trường MS có bổ sung BA NAA 42 Bảng 3.8: Ảnh hưởng BA lên trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro 43 Bảng 3.9: Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH tăng trưởng chồi 44 Bảng 3.10: Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả tăng trưởng chồi invitro 44 Bảng 3.11: Ảnh hưởng IAA, IBA, NAA đến khả rễ bất định từ mô sẹo 45 Bảng 3.12: Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung NAA 47 Bảng 3.13: Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung IBA 47 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh tự nhiên 15 Hình 2.2: Hình thái Sâm Ngọc Linh 16 Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh 17 Hình 3.1: Mô sẹo Sâm Ngọc Linh 28 Hình 3.2: Chồi Sâm Ngọc Linh 30 Hình 3.3: Rễ Sâm Ngọc Linh 31 Hình 3.4: Nuôi cấy Bioreactor 32 Hình 3.5: Phôi vô tính Sâm Ngọc Linh 34 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH TÀI LIỆU THAM KHẢO Dương Tấn Nhựt cộng sự, Đề tài “ Hoạt chất saponin từ nguyên liệu nuôi cấy invitro Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Trung Tâm Sâm Dược Liệu TP HCM Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, Nxb ĐHQG TP HCM Nguyễn Ngọc Dung, Nhân giống Sâm Ngọc Linh đường sinh học, Nxb Nông Nghiệp Nguyễn Ngọc Duy (1995), Nhân giống Sâm Ngọc Linh đường sinh học kinh nghiệm trồng Nhân Sâm Khai Thành Triều Tiên, Nxb Nông Nghiệp Nguyễn Thanh Bình, Nguyễn Ngọc Duy (1996), Thăm dò khả nhân giống vô tính phương pháp nuôi cấy mô invitro Sâm Ngọc Linh số dự án chuyên ngành lâm nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM PGS TS Lê Văn Hoàng, Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, Đại học Đà Nẵng PGS TS Trần Văn Minh (1994), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Viện Dược Liệu, Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (Tập II), Nxb KH & KT Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, Sinh lý học thực vật, Nxb GD 10 http://www.nhasinhoctre.com/forum/viewtopic.php?f=47&t=4450 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH PHỤ LỤC  Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog, 1962): Khoáng đa lượng (mg l-1) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCL2.2H2O 440 Mg2SO4.7H2O 370 KH2PO4.7H2O 170 Khoáng vi lượng KI H3BO4 (mg l-1) 0.83 6.2 MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Na2.EDTA 27.8 Vitamin chất hữu khác (mg l-1) Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0.5 Pyridoxine HCl 0.5 Thiamine HCl 0.1 Glycine 2.0 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Chọn chồi mọc thẳng hay chồi bên làm nguyên liệu nuôi cấy có chiều dài 2-3 cm, cắt bỏ hết lá, xử lý cồn 70 % phút tủ cấy vô trùng, sau tráng lại lần nước cất vô trùng, sau xử lý mẫu dung dịch hypoclorid canxi hay HgCl2 sau tráng nước cất vô trùng nhiều lần cho hết chất khử trùng Sau khử trùng xong cắt phần đầu có màu xanh, chiều dài 0.4 cm đặt vào môi trường Bảng 3.1: Ảnh hưởng loại nồng độ khử trùng: Mẫu Số mẫu Sâm 10 Ngọc Linh Thời (Mầm, gian thân, (phút) HgCl2 0.2% 0.3% 10 15 100% 100% 100% 20 5 15 0.4% 20 20% 40% 40% Chết Chết Chết rễ) Mẫu Số mẫu Sâm 10 Ngọc Linh Thời (mầm, gian thân, (phút) Ca(OCl)2 5% 10% 15% 10 15 20 10 15 10 100% 100% 100% 40% Chết Chết Chết Chết rễ)  Kết quả: Sâm Ngọc Linh xử lý HgCl2 với nồng độ 0.2 % thời gian 20 phút tỷ lệ nhiễm thấp (20%) tỷ lệ nhiễm không cao (80%) Còn xử lý SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Ca(OCl)2 với nồng độ 10%, thời gian phút tỷ lệ nhiễm thấp (10 %) tỷ lệ không nhiễm cao (90%) (Bảng 3.1) 3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp hoocmon lên phát sinh hình thái: Sử dụng mẫu mầm, thân, rễ Sâm Ngọc Linh Nuôi cấy phối hợp tổ hợp môi trường khác để đánh giá phát sinh hình thái Bảng 3.2: Ảnh hưởng tổ hợp hoocmon lên phát sinh hình thái Sâm Ngọc Linh cấy mô: Bộ Đối phận tượng cấy Hoccmon sinh hình thái IBA Sâm Ngọc Linh Kết phát IAA NAA K 2ip G 0.2 0.2 Chết 0.5 0.5 Chết 0.5 Callus Mầm, 0.2 0.5 Callus thân, rễ 0.5 0.25 Rễ 0.5 1 Phôi soma 0.5 0.5 Phôi chồi Rễ 0.5 Chồi  Kết quả: - Với tổ hợp hoocmon IBA 0.5 + 2ip Sâm Ngọc Linh phát sinh phôi soma - Với tổ hợp hoocmon NAA + G phát sinh phôi chồi - Với tổ hợp hoocmon NAA + 2ip 0.5 phát sinh rễ 3.6.3 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả tạo mô sẹo từ cuống lá: Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần không cần suốt thời gian tạo mô sẹo Đối với mẫu lá, đa số trường hợp tạo mô sẹo tối thường tốt SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH sáng Tuy nhiên, số trường hợp mẫu cấy lại tạo mô sẹo tốt điều kiện sáng Môi trường tốt cho tạo mô sẹo ban đầu từ mẫu cuống dùng để khảo sát điều kiện chiếu sáng Mẫu đặt hai điều kiện tối hoàn toàn chiếu sáng (16 giờ/ ngày) Bảng 3.3: Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên khả tạo mô sẹo từ cuống lá: 2,4-D (mg/l) Bộ phận Phần trăm tạo mô sẹo (%) Chiếu sáng (16 giờ/ ngày) Tối hoàn toàn 20 30 90 80 90 90 3.0 80 80 0.5 100 100 100 100 100 100 100 100 0.5 1.0 2.0 1.0 2.0 Lá Cuống 3.0  Kết quả: Kết bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ phát sinh mô sẹo mẫu cuống gần tương đương hai điều kiện chiếu sáng tối, lượng mô sẹo điều kiện tối chất lượng mô sẹo có tượng thủy tinh thể, môi trường có 3.0 mg/l 2,4-D 3.6.4 Ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo: Mô sẹo cắt theo ba kích thước: KT1, KT2, KT3 Mẫu mô sẹo với kích thước xác định cấy vào môi trường nhân nhanh SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Mô sẹo sau trình tăng sinh sử dụng cho trình tái sinh chồi rễ bất định Bảng 3.4: Ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo: Chỉ tiêu quan sát Trọng lượng tươi ban đầu (mg) Kích thước (cm) Sinh khối sau tuần nuôi cấy Trọng lượng tươi (mg) Trọng lượng khô (mg) Tỷ lệ chất khô ( %) Tỷ lệ tăng sinh khối khô KT1 KT2 KT3 (0.5*0.5) (0.7*0.7) (1.0*1.0) 147 267 ± 18 576 ± 24 1.1*0.9 1.4*1.0 1.6*1.2 667 ± 45 804 ± 35 1505 ± 66 53.9 ± 36 57.8 ± 2.5 102.8 ± 4.5 8.08 7.19 6.83 5.46 3.22 2.65  Kết quả: Kích thước mẫu cấy yếu tố quan trọng nhân giống invitro Khi khảo sát ảnh hưởng kích thước mẫu cấy ban đầu lên tăng sinh mô sẹo, ta nhận thấy kích thước nhỏ (KT1) cho hiệu tốt tỷ lệ tăng sinh khối lẫn trọng lượng khô, khác biệt nhiều khả tăng sinh KT2 KT3 (Bảng 3.4) Sự tương quan bắt nguồn từ tương quan kích thước mẫu cấy - khả thu nhận dinh dưỡng từ môi trường ảnh hưởng chất thải nội sinh mô sẹo trình nuôi cấy 3.6.5 Ảnh hưởng auxin lên khả khởi tạo mô sẹo từ cuống lá: Những nghiên cứu có đối tượng thuộc chi Panax cho thấy giai đoạn khởi tạo mô sẹo thường có kết hợp cytokinin auxin SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Mẫu cuống sau khử trùng cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ loại auxin 2,4-D, IBA, NAA, với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0 3.0 mg/l Mẫu đặt ngửa mặt môi trường cuống đặt ngửa (Vết cắt hướng lên trên) Bảng 3.5: Ảnh hưởng auxin lên khả khởi tạo mô sẹo từ cuống lá: Auxin 2,4-D IBA NAA Nồng độ auxin ( mg/l) Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Cuống Lá 0.5 100 20 1.0 100 90 2.0 100 90 3.0 100 80 0.5 0 1.0 0 2.0 0 3.0 0 0.5 0 1.0 0 2.0 0 3.0 0  Kết quả: Kết thu sau tuần nuôi cấy ghi nhận bảng 3.5 Trong ba loại auxin bổ sung vào môi trường có 2,4-D có khả kích thích cuống tạo mô sẹo Trên môi trường bổ sung 1.0 mg/l 2,4-D, mẫu cấy có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao (Đạt 90 % 100 % cuống lá), có lượng sẹo hình thành nhiều nhất, cấu trúc có màu vàng sáng Ở nồng độ 3.0 mg/l 2,4D, mô sẹo bắt đầu có tượng thủy tinh thể Do đó, nồng độ 2,4-D từ 3.0 mg/l trở lên không phù hợp cho phát sinh mô sẹo 3.6.6 Ảnh hưởng auxin lên khả tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh: SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Các mẩu mô sẹo tạo từ giai đoạn khởi tạo cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ loại auxin 2,4-D, IBA NAA với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0; 3.0 5.0 mg/l điều kiện chiếu sang 16 giờ/ ngày Bảng 3.6: Ảnh hường auxin lên khả tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh: Trọng Auxin 2,4-D IBA NAA Nồng độ Sinh khối sau tuần nuôi cấy Tỷ lệ tăng lượng tươi Trọng Tỷ lệ sinh lượng khô chất khô khối (mg/l) (%) khô ban đầu Trọng lượng (mg) tươi (mg) 0.5 203 ± 16 584 ± 34 43.3 ± 2.5 7.42 3.18 1.0 212 ± 14 809± 37 66.2 ± 3.0 8.18 4.56 2.0 204 ± 17 711 ± 32 52.4 ± 2.4 7.37 3.73 3.0 205 ± 508 ± 24 36.6 ± 2.2 7.21 2.65 5.0 201 ± 13 493 ± 38 34.6 ± 1.7 7.01 2.50 0.5 197 ± 18 474 ± 23 45.6 ± 2.2 9.62 3.45 1.0 203 ± 19 532 ± 29 48.6 ± 2.7 9.14 3.56 2.0 207 ± 13 631 ± 32 49.5 ± 2.5 7.84 3.63 3.0 203 ± 15 552± 26 41.1 ± 1.9 7.45 3.10 5.0 209 ± 12 531 ± 23 35.3 ± 1.5 6.66 2.53 0.5 218 ± 485 ± 13 41.2 ± 1.1 8.49 2.81 1.0 212 ± 14 548 ± 21 45.0 ± 1.8 8.22 3.33 2.0 206 ± 15 588 ± 18 46.6 ± 1.4 7.92 3.37 3.0 199 ± 602 ± 32 45.7 ± 2.4 7.60 3.38 5.0 205 ± 14 720 ± 48 51.6 ± 3.4 7.20 3.77 (mg/l)  Kết quả: Bảng 3.6 cho thấy sau trình tăng sinh, mô sẹo nuôi cấy môi trường có 0.5 mg/l IBA có tỷ lệ chất khô cao 9.62 % tỷ lệ tăng sinh khối khô cao SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 4.56 lần lại thu mô sẹo môi trường có 2,4-D nồng độ 1.0 mg/l Có thể kết hợp auxin cytokinin làm tăng khả thu nhận đường chất dinh dưỡng khác từ môi trường mô sẹo kéo theo tăng sinh mô sẹo, đặc biệt tăng tỷ lệ chất khô IBA auxin kích thích thu nhận dinh dưỡng từ môi trường kết hợp với TDZ tốt so với NAA 2,4-D Kết tỷ lệ chất khô mô sẹo nuôi cấy môi trường có IBA cao ba loại auxin sử dụng Tuy IBA cho tỷ lệ mô sẹo có tỷ lệ chất khô cao 2,4-D có tỷ lệ tăng sinh khối khô cao (Gấp 4.56 lần) có tỷ lệ chất khô tương đối cao (8.18 %) Mặt khác, mô sẹo môi trường 2,4-D có hình thái tốt nhất, dạng mô sẹo có khả tái sinh cao 3.6.7 Ảnh hưởng BA NAA đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo: Các mô sẹo thu thí nghiệm nhân nhanh mô sẹo tách chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung BA NAA với nồng độ bảng 3.6  Kết quả: Tỷ lệ auxin cytokinin đóng vai trò cần thiết cho tái sinh chồi, cytokinin thường thúc đẩy hình thành chồi trình thường kích thích bổ sung auxin với nồng độ thấp Trong thử nghiệm, sử dụng BA kết hợp với NAA kết nhận thấy tổ hợp NAA BA khác nhau, kết hợp 1.0 mg/l BA 1.0 mg/l NAA cho số chồi đạt cao 6.3 chồi/ mẫu trọng lượng trung bình 0.185 g (Bảng 3.7) Bảng 3.7: Khả tái sinh chồi từ mô sẹo môi trường MS có bổ sung BA NAA: BA (mg/l) NAA (mg/l) SVTH: NGUYỄN THỊ THU Số lượng chồi/ mẫu Trọng lượng chồi (g) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 0.5 1.0 2.0 4.0 GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 0.5 5.0 0.106 1.0 6.1 0.141 1.5 4.6 0.193 2.0 3.3 0.197 2.5 3.0 0.094 0.5 5.5 0.163 1.0 6.3 0.185 1.5 5.9 0.158 2.0 3.9 0.148 2.5 3.7 0.157 0.5 4.2 0.152 1.0 5.5 0.141 1.5 2.9 0.144 2.0 2.8 0.112 2.5 2.7 0.108 0.5 3.3 0.154 1.0 3.0 0.122 1.5 2.6 0.122 2.0 0.8 0.108 2.5 0 3.6.8 Ảnh hưởng BA lên trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: Những chồi tốt sau thu nhận tách chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung 1.0 g/l than hoạt tính, 30 g/l sucrose, 0.5 mg/l NAA BA ( 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 mg/l) SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Bảng 3.8: Ảnh hưởng BA lên trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: BA (mg/l) Trọng lượng tươi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 0.5 0.61 5.66 3.0 1.0 0.87 6.16 3.3 2.0 0.72 4.11 4.0 4.0 0.71 4.33 3.9  Kết quả: Trong nồng độ BA đươc sử dụng, nồng độ 1.0 mg/l BA kết hợp với 0.5 mg/l NAA cho kết tăng trưởng chồi chốt với trọng lượng tươi chồi 0.87 g chiều cao chồi 6.16 cm (Bảng 3.8) Vậy môi trường nuôi cấy có bổ sung 1.0 mg/l BA 0.5 mg/l tốt cho trình tăng trưởng chồi 3.6.9 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tăng trưởng chồi: Những chồi tốt thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, 1.0 mg/l BA, pH = 5.7 đường với nồng độ đường 10; 20; 30; 40; 50; 60 g/l  Kết quả: Qua kết thử nghiệm cho thấy sucrose carbohydrate hào tan chiếm ưu nồng độ thường dùng nằm khoảng 30 - 120 g/l sucrose Nghiên cứu ảnh hưởng sucrose lên tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy việc bổ sung sucrose vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực lên sinh trưởng chồi Sự gia tăng nồng độ sucrose môi trường kích thích sinh trưởng chồi Sâm Ngọc Linh mà có tác dụng mạnh đến biến đổi khối lượng chúng Nồng độ 50 g/l sucrose cho kết tốt trọng lượng, chiều cao số lượng (Bảng 3.9) Bảng 3.9: Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tăng trưởng chồi: Sucrose (g/l) Trọng lượng chồi (g) SVTH: NGUYỄN THỊ THU Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 10 0.49 4.4 2.2 20 0.55 5.4 2.5 30 0.68 5.7 2.6 40 1.06 5.8 3.2 50 1.46 6.1 3.5 60 1.28 6.1 3.2 3.6.10 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả tăng trưởng chồi invitro: Những chồi tốt thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, 1.0 mg/l BA, pH = 5.7 với nồng độ than hoạt tính 1.0; 2.0; 3.0 4.0 g /l Bảng 3.10: Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả tăng trưởng chồi invitro: Than hoạt Trọng lượng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 0.53 3.3 3.6 1.0 0.61 4.6 3.7 2.0 1.01 5.3 3.3 3.0 0.97 6.8 2.7 4.0 0.94 8.5 3.1 tính (g/l)  Kết quả: Than hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thưc vật, có khả thay đổi thành phần môi trường Than hoạt tính điều chỉnh pH môi trường, hấp thụ chất làm cản trở phát triển mô Kết thu cho thấy nồng độ than hoạt tính tăng có thay đổi rõ rệt trọng lượng chiều cao chồi, số lượng thay đổi đáng kể Trọng lượng chồi đạt cao môi trường chứa 2.0 g/l than hoạt tính khoảng 1.01 g/chồi, tăng 1.9 lần so vời đối chứng (Bảng 3.10) Vậy nồng độ 2.0 g/l than hoạt tính phù hợp cho qúa trình tăng sinh chồi Sâm Ngọc Linh 3.6.11 Ảnh hưởng IAA, IBA, NAA đến khả rễ bất định từ mô sẹo: SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Mô sẹo cấy vào môi trường rễ có chứa auxin (NAA, IBA, IAA) nồng độ 1.0; 3.0; 5.0; 7.0 mg/l Bảng 3.11: Ảnh hưởng IAA, IBA, NAA đến khả rễ bất định từ mô sẹo: Auxin NAA IAA IBA Tỷ lệ khối Nồng độ Tỷ lệ rễ Số lượng ( mg/l) (%) rễ / mẫu 1.0 30 3.0 ± 0.3 5.98 18 3.0 100 8.7 ± 0.1 21.88 13 5.0 70 2.6 ± 0.1 6.23 7.0 50 2.1 ± 0.1 12.21 1.0 3.0 5.0 10 7.0 1.0 70 1.6 ± 0.1 7.83 16 3.0 80 4.0 ± 0.3 5.21 21 5.0 100 4.8 ± 0.3 15.81 18 7.0 60 3.5 ± 0.1 8.06 1.7 lượng rễ / mẫu (%) Chiều dài tối đa rễ (mm) 0.2 ± 0.2  Kết quả: Quá trình khảo sát ảnh hưởng ba loại auxin trên, ta nhận thấy IAA không thích hợp cho trình rễ Sâm Ngọc Linh từ mô sẹo auxin không kích thích mô sẹo rễ bất định NAA IBA ngược lại Nồng độ 3.0 mg/l NAA cho kết tố với tỷ lệ rễ lên đến 100 %, số lượng rễ/ mẫu lớn (8.7 rễ/ mẫu), tỷ lệ khối lượng rễ / mẫu lớn (21.88 %), chiều dài tối đa rễ 13 mm SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH (Bảng 3.11) IBA nồng độ 5.0 mg/l cho tỷ lệ rễ đạt 100 %, Số lượng rễ trung bình/ mẫu 4.8 mẫu, tỷ lệ khối lượng 15.81 % chiều dài tối đa rễ 18 mm Kết giải thích auxin tổng hợp có hoạt tính cao dạng tự nhiên Vậy hai môi trường kích thích rễ tốt môi trường Ms ½ bổ sung 3.0 mg/l NAA môi trường MS ½ bổ sung mg/l IBA 3.6.12 Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ bất định: RỄ bất định sau tạo thí nghiệm tách cấy chuyền sang môi trường nhân rễ có bổ sung auxin NAA, IBA nồng độ 1.0; 3.0; 5.0 mg/l  Kết quả: Từ kết bảng 3.12 bảng 3.13 cho thấy nguồn gốc mẫu rễ có ảnh hưởng lớn đến hiệu nhân rễ Mẫu rễ bảng 3.12 có khả nhân rễ tốt hơn, nghiệm thức rễ, tỷ lệ rễ cao 60 %, số rễ thứ cấp cao rễ/ mẫu Mẫu rễ bảng 3.13 có tỷ lệ rễ cao 40 %, số rễ thứ cấp cao rễ/ mẫu, có nghiệm thức rễ mẫu lại cấy môi trường chứa NAA Khi xét đến ảnh hưởng loại auxin, ta thấy NAA phù hợp với trình nhân rễ bất định Sâm Ngọc Linh Ở nồng độ 5.0 mg/l NAA kích thích nhân rễ tốt (60 %), có số rễ thứ cấp nhiều (9 rễ/ mẫu) mẫu tăng trọng cao (Trọng lượng tươi trung bình 390 ± 20 mg/l, tăng 3.5 lần so với ban đầu) Hơn nữa, có tới 5/6 nghiệm thức bổ sung NAA cho kết rễ so với IBA có 4/6 nghiệm thức Vậy IBA NAA, NAA nồng độ 3.0 mg/l phù hợp cho việc khơi tạo rễ từ mô sẹo NAA nồng độ 5.0 mg/l phù hợp cho trình nhân rễ bất định Sâm Ngọc Linh Bảng 3.12: Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung NAA: NAA IBA Tỷ lệ rễ Số rễ thứ (mg/l) (mg/l) (%) cấp SVTH: NGUYỄN THỊ THU Trọng lượng tươi trung bình (mg/l) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH - 20 140 ± 10 - 30 290 ± 10 - 60 390 ± 20 - 10 450 ± 50 - 20 330 ± 20 - 30 280 ± 30 Bảng 3.13: Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân rễ mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung IBA: Trọng lượng tươi trung NAA IBA Tỷ lệ rễ Số rễ thứ (mg/l) (mg/l) (%) cấp - 40 350 ± 10 - 20 180 ± 30 - 0 - 10 - 0 - 0 bình (mg/l) 270 ± 10 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Sâm Ngọc Linh công nhận Sâm có hàm lượng saponin cao với số lượng nhiều nhất, so với loài Panax khác giới Do SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại nhiều ý nghĩa thực tiễn việc bảo tồn nguồn dược liệu quý giá - Quá trình khảo sát ảnh hưởng loại nồng độ auxin lên khả tạo mô sẹo ban đầu cuống cho thấy nồng độ 3.0 mg/l 2.4-D trở lên không phù hợp cho phát sinh mô sẹo từ Sâm Ngọc Linh - Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao môi trường ½ MS bổ sung 1.0 mg/l BA, 1.0 mg/l NAA, 50 g/l sucrose - Đối với trình rễ từ mô sẹo, mẫu mô sẹo nuôi cấy môi trường ½ MS có bổ sung 3.0 mg/l NAA cho tỷ lệt rễ cao nhất, số lượng rễ nhiều tỷ lệ trọng lượng tươi rễ/ mẫu cao - Môi trường ½ MS có bổ sung 5.0 mg/l NAA kích thích nhân rễ tốt nhất, cho tỷ lệ rễ cao rễ phân nhánh nhiều 4.2 Kiến nghị: - Được giới ghi nhận loài Sâm quý bậc nhất, đến Sâm Ngọc Linh chưa biết đến nhiều loài Sâm Hàn Quốc hay Sâm Triều Tiên - Việc nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu loài Sâm giới nhiều tác giả tiến hành nhiều năm, Việt Nam khẳng định tính thực khả tạo nguồn Sâm đường nuôi cấy mô tế bào Nhưng cần nhiều nghiên cứu loài Sâm Ngọc Linh Việt Nam để Việt Nam chủ động nguồn nguyên dược liệu quý, đồng thời đưa thương hiệu Sâm Việt Nam mang tầm quốc tế - Là loài Sâm đặc hữu tìm thấy với số lượng phạm vi phân bố hẹp, nhạy cảm với môi trường sống, nguồn cung cấp hạn chế, thời gian từ lúc trồng từ hạt thu củ lên đến 5-6 năm Do đó, nguồn Sâm Ngọc Linh cạn kiệt dần nguy tuyệt chủng cao, nên cần có nhiều biện pháp cấp bách để bảo tồn phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên quốc gia SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THU GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH [...]... Công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) dưới sự hướng dẫn của thầy Bùi Văn Thế Vinh 1.2 Mục đích của đề tài: - Tổng quan về Sâm Ngọc Linh - Tìm hiểu một số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG II TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy. .. dưỡng Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào  Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng cho các mục đích: - Chọn dòng tế bào - Nghiên cứu cấu trúc tế bào, ... triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau - Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp 2.1.2.6 Nuôi cấy protoplast Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay sử dụng enzyme Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ưu thế của kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào trần là tế bào không có màng... thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật ( tế bào đơn, mô, cơ quan…) trong điều kiện vô trùng  Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc: - Dựa vào tính toàn năng của tế bào: Mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi Mỗi tế bào là một hệ thống... hệ tế bào mới nếu cần thiết - Dựa vào khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào: Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó Các tế bào dùng trong môi trường cấy đều có khả năng biệt hóa về cấu trúc và chức năng Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào. .. Thực tế, cây Sâm Ngọc Linh đã được nhân giống thành công từ mô sẹo Nhưng tiến hơn một bước để sản xuất ginsenosid Sâm Ngọc Linh bằng nuôi cấy mô thì chưa có nghiên cứu nào được công bố Với mong muốn tìm hiểu về loại cây trồng có giá trị kinh tế này cùng với những công nghệ nuôi cấy tế bào đã và đang được thực hiện nhằm mục đích nhân giống và sản xuất các hợp chất có giá trị kinh tế, tôi đã thực hiện... thuốc được gọi là Sâm Nhưng chỉ có bốn loài Sâm thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae) Chi Panax gần gũi với cây Nhân Sâm Panax SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH gingseng C A Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ Diệp, đều là các cây thuốc quý Năm 1968, KS Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên nó là Sâm Khu 5 Năm 1973,... tiềm năng của Sâm Ngọc Linh vẫn chưa hoàn toàn được đánh thức Cộng với địa bàn phân bố hẹp (chỉ có ở vùng núi Ngọc Linh) , lại bị khai thác bừa bãi, nên Sâm Ngọc Linh sớm đứng trước nguy cơ tuyệt chủng Với nỗ lực của những địa phương có Sâm Ngọc Linh phân bố, hiện nay loài dược liệu này đã có thể tránh bị tuyệt diệt Nhưng để đưa Sâm Ngọc Linh thành cây thuốc ngang hàng với các loại Nhân sâm có trên thị... thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên 1 đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bào/ 1ml môi trường)  Ứng dụng nuôi cấy protopast: - Tạo ra cây lai soma - Chuyển các bào quan và chuyển gen Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài - Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào 2.1.3 Môi trường nuôi cấy  Thành phần môi trường nuôi cấy gồm... quốc tế lưu ý nghiên cứu về nó Việt Nam cần tự nghiên cứu cũng như sản xuất, cố gắng đánh thức giá trị y học và giá trị kinh tế của Sâm Ngọc Linh Trong các hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô đã thật sự đưa nông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, vì vậy muốn nghiên cứu đưa cây Sâm Ngọc Linh phát triển theo hướng hiện đại, mang lại hiệu quả kinh tế cao không thể bỏ qua kỹ thuật này Thực tế, cây Sâm Ngọc