ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN TIẾN DŨNG NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT LOÀI PHỤ SALMONELLA GÂY BỆNH VỚI CÁC LOÀI PHỤ KHÁC TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN TIẾN DŨNG NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT LOÀI PHỤ SALMONELLA GÂY BỆNH VỚI CÁC LOÀI PHỤ KHÁC TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CHUYÊN NGÀNH VI SINH MÃ SỐ: 1.05.12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN LINH THƯỚC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2010 Mục lục, danh mục bảng , hình i Nguyễn Tiến Dũng MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vị trí phân loại cách gọi tên Salmonella 1.2 Đặc điểm sinh học tính chất ni cấy 10 1.3 Đặc điểm kháng nguyên 11 1.4 Bệnh Salmonella 12 1.5 Đặc điểm di truyền liên quan đến tính gây bệnh Salmonella 13 1.5.1 Đặc điểm gen 13 1.5.2 Các cụm gây bệnh 14 1.5.3 Các gen gây độc 15 1.6 Đặc điểm tiến hóa tính gây bệnh 18 1.6.1 Các bước tiến hóa tính gây bệnh giống Salmonella 18 1.6.2 Tiến hố theo hướng tăng tính gây bệnh .19 1.6.3 Loài phụ S entreica I tiến hóa theo hướng thích nghi với vật chủ người động vật máu nóng 20 1.6.4 Tiến hóa protein có vai trị bám dính có liên quan đến phổ vật chủ 21 1.7 Sự tương tác Salmonella vật chủ 22 1.7.1 Cấu tạo hệ tiêu hóa người động vật máu nóng liên quan đến q trình xâm nhiễm vi khuẩn 22 1.7.2 Sự tương tác Salmonella vật chủ 24 1.7.3 Cơ chế phòng vệ vật chủ xâm nhập mầm bệnh .25 1.8 Triệu chứng bệnh Salmonella 28 1.9 Ý nghĩa việc phân biệt loài phụ S enterica I với Salmonella spp thực phẩm thủy sản 29 CHƯƠNG 33 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 33 2.1 Thiết bị 34 Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010 Mục lục, danh mục bảng , hình ii Nguyễn Tiến Dũng 2.2 Hố chất, mơi trường 34 2.2.1.Hóa chất 34 2.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật .36 2.3 Vật liệu thí nghiệm 36 2.3.1 Chủng giống vi sinh vật 36 2.3.2 Chuột sử dụng nghiên cứu 37 2.4 Phương pháp .37 2.4.1 Phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật 37 2.4.2 Định lượng mật độ tế bào phương pháp nuôi cấy 38 2.4.3 Phương pháp nuôi cấy để phân lập phát Salmonella spp thực phẩm .39 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy xác định S enterica I .42 2.4.5 Phương pháp PCR để phát Salmonella spp., S enterica I để khảo sát diện gen 44 2.4.6 Thí nghiệm khảo sát lựa chọn gen mục tiêu cho qui trình phát Salmonella spp S enterica I 47 2.4.7 Khảo sát xây dựng quy trình multiplex PCR phát phân S enterica I Salmonella spp thực phẩm dựa vào hai gen invA iagAB 47 2.4.8 Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella spp S enterica I thực phẩm phản ứng multiplex PCR cặp mồi nhân đồng thời gen mục tiêu invA iagAB .48 2.4.9 Phương pháp RT-PCR thí nghiệm khảo sát biểu gen gây bệnh 48 2.4.10 Phương pháp nghiên cứu khả xâm nhiễm gây bệnh chuột 50 2.4.11 Nghiên cứu phiên mã in vivo gen ssrA Salmonella sử dụng mơ hình chuột bị gây nhiễm 53 2.4.12 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình chuẩn phát Salmonella spp 53 2.4.13 Xác nhận hiệu lực phương pháp PCR phân tích Salmonella spp thực phẩm 55 CHƯƠNG 59 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 59 Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010 Mục lục, danh mục bảng , hình iii Nguyễn Tiến Dũng 3.1 Phân lập định danh Salmonella từ thực phẩm, thủy sản phương pháp ni cấy, sinh hóa, miễn dịch 60 3.2 Nghiên cứu phương pháp phát Salmonella spp loài phụ gây bệnh S enterica I thực phẩm phản ứng PCR .61 3.2.1 Khảo sát khả nhân gen mục tiêu invA, fimA, iagAB, spvC Salmonella cặp mồi tương ứng 61 3.2.2 Phát Salmonella spp phản ứng PCR dựa gen mục tiêu invA .62 3.2.3 Phát loài phụ gây bệnh S enterica I phản ứng PCR dựa vào gen mục tiêu iagAB .64 3.2.4 Phát phân biệt Salmonella spp S enterica I phản ứng multiplex PCR dùng cặp mồi 66 3.2.5 Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella spp S enterica I thực phẩm phản ứng multiplex PCR cặp mồi nhân đồng thời gen mục tiêu invA iagAB .68 3.3 Nghiên cứu so sánh diện biểu gen gây bệnh Salmonella spp loài phụ S enterica I 70 3.3.1 So sánh diện gen gây bệnh Salmonella spp loài phụ S enterica I từ mẫu có nguồn gốc thực phẩm mẫu có nguồn gốc bệnh phẩm .70 3.3.2 So sánh mức độ phiên mã gen gây bệnh Salmonella spp loài phụ S enterica I điều kiện in vitro .73 3.3.3 Khảo sát phiên mã in vivo gen ssrA Salmonella sử dụng mơ hình chuột bị gây nhiễm 76 3.4 Nghiên cứu so sánh đặc tính gây bệnh loài phụ S enterica I với loài phụ khác 78 3.4.1 Khảo sát so sánh tính gây bệnh in vivo loài phụ S enterica I với loài phụ khác .78 3.4.2 Sự khác biệt tính kháng nhân tố phịng vệ vật chủ .83 3.4.3 Mối quan hệ gen gây bệnh độc lực Salmonella 89 3.5 Xây dựng quy trình PCR phát Salmonella spp S enterica I để ứng dụng lĩnh vực thực phẩm 92 Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010 Mục lục, danh mục bảng , hình iv Nguyễn Tiến Dũng 3.5.1 Tối ưu hóa quy trình PCR để phát Salmonella spp thực phẩm dựa vào gen invA 92 3.5.2 Đề xuất quy trình phân tích Salmonella spp phương pháp PCR dựa gen mục tiêu invA 96 3.5.3 Đánh giá hiệu lực quy trình PCR để phát Salmonella spp thực phẩm dựa gen mục tiêu invA 98 3.5.4 Đề xuất quy trình PCR để phát Salmonella spp dựa vào gen mục tiêu invA thành tiêu chuẩn ngành lĩnh vực thủy sản 101 3.6 Xây dựng quy trình multiplex PCR phát phân biệt Salmonella spp với S enterica I thực phẩm 101 3.6.1 Tối ưu hóa quy trình multiplex PCR cặp mồi để phát phân biệt Salmonella spp với S enterica I thực phẩm dựa vào gen invA iagAB 101 3.6.2 Đề xuất quy trình multiplex PCR cặp mồi để phát phân biệt Salmonella spp với S enterica I thực phẩm dựa vào gen invA iagAB 104 CHƯƠNG 106 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 106 4.1 Kết luận 107 4.2 Đề nghị 108 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010 Mục lục, danh mục bảng , hình v Nguyễn Tiến Dũng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự phòng vệ vật chủ chống lại xâm nhiễm mầm bệnh 26 Bảng 1.2 Các yêu cầu Salmonella qui định an toàn vệ sinh thực phẩm số nước 30 Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 35 Bảng 2.2 Danh mục chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm .37 Bảng 2.3 Các phương pháp phân lập định danh vi sinh vật sử dụng 37 Bảng 2.4 Các đặc trưng sinh hóa Salmonella 41 Bảng 2.5 Các đặc trưng sinh hoá S enterica I .43 Bảng 2.6 Nhiệt bắt cặp cặp mồi sử dụng phản ứng multiplex PCR .46 Bảng 3.1 Tổng hợp kết phân lập, định danh chủng Salmonella từ thực phẩm dùng làm nguyên liệu cho nghiên cứu 60 Bảng 3.2 Kết kiểm tra tính chuyên biệt gen fimA; invA mục tiêu chủng Salmonella xác nhận nguồn gốc 63 Bảng 3.3 Kết khảo sát diện gen invA fimA chủng Salmonella có nguồn gốc tự nhiên nuôi cấy chủng 63 Bảng 3.4 Kết khảo sát diện gen iagAB chủng vi sinh vật 65 Bảng 3.5 Kết multiplex PCR kết hợp cặp mồi nhân đồng thời gen invA iagAB 66 Bảng 3.6 Tần suất diện Salmonella spp S enterica I nhóm thực phẩm TP HCM 69 Bảng 3.7 Kết khảo sát diện gen gây độc chủng Salmonella 72 Bảng 3.8 Tỉ lệ phân bố gen gây bệnh loài phụ Salmonella khác 73 Bảng 3.9 Tỉ lệ phân bố các gen gây bệnh chủng Salmonella khảo sát 73 Bảng 3.10 Kết biểu gen gây bệnh chủng Salmonella .74 Bảng 3.11 Tỉ lệ biểu gen gây bệnh loài phụ Salmonella khác 75 Bảng 3.12 Tỉ lệ phân bố biểu gen gây bệnh chủng Salmonella khảo sát 75 Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010 Mục lục, danh mục bảng , hình vi Nguyễn Tiến Dũng Bảng 3.13 Sự biểu gen ssrA trước sau xâm nhiễm vào chuột .77 Bảng 3.14 Kết khảo sát khả gây bệnh chủng thuộc loài phụ S enterica I loài phụ khác 79 Bảng 3.15 Khả xâm nhiễm vào gan lách chuột chủng S enterica I 82 Bảng 3.16 Khả xâm nhiễm gan lách chuột chủng Salmonella phân lập từ thực phẩm 83 Bảng 3.17 Quy định số thứ tự chủng dùng thí nghiệm khảo sát tính kháng nhân tố phịng vệ vật chủ .85 Bảng 3.18 Kết khảo sát thời gian tăng sinh cần thiết để phát Salmonella spp.trong thực phẩm phản ứng PCR .94 Bảng 3.19 Ảnh hưởng nồng độ MgCl2 lên phản ứng PCR phát Salmonella spp .95 Bảng 3.20 Ảnh hưởng nhiệt độ bắt cặp lên phản ứng PCR 95 Bảng 3.21 Tương quan kết phân tích Salmonella phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy 98 Bảng 3.22 Kết đánh giá độc lập qui trình PCR phân tích Salmonella thực phẩm dựa vào gen mục tiêu invA 100 Bảng 3.23 Kết xác định thông số kỹ thuật phương pháp PCR phát Salmonella thực phẩm dựa vào gen invA đánh giá độc lập phòng thí nghiệm khác 100 Bảng 3.24 Ảnh hưởng nồng độ MgCl2 lên phản ứngPCR cặp mồi nhân đồng thời gen invA iagAB 102 Bảng 3.25 Ảnh hưởng nhiệt độ bắt cặp lên phản ứng PCR cặp mồi nhân đồng thời hai gen invA iagAB 102 Bảng 3.26 Mật độ tế bào Salmonella ni cấy phát phản ứng PCR cặp mồi 103 Bảng 3.27 Kết khảo sát độ nhạy phản ứng PCR cặp mồi để nhân gen invA iagAB mẫu thực phẫm bị gây nhiễm Salmonella 104 Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010 Mục lục, danh mục bảng , hình vii Nguyễn Tiến Dũng DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Khuẩn lạc Salmonella môi trường XLD 11 Hình 1.2 Q trình tiến hóa hình thành tính gây bệnh Salmonella 19 Hình 1.3 Cấu tạo lớp tạo nên ống tiêu hóa 23 Hình 2.1 Kích thước vạch thang DNA .36 Hình 2.2 Khuẩn lạc đặc trưng Salmonella mơi trường phân lập XLD 40 Hình 2.3 Phản ứng ngưng kết huyết Salmonella 42 Hình 2.4 Đặc trưng sinh hố S enterica I .44 Hình 2.5 Dụng cụ phẩu thuật chuột sau phẩu thuật 51 Hình 3.1 Phân tích sản phẩm phản ứng PCR phát Salmonella spp., S enterica I cặp mồi invA1-invA2, fimA1- fimA2, iagAB1-iagAB2 spvC1-spvC2 61 Hình 3.2 Tín hiệu khuếch đại thực phản ứng multiplex PCR đồng thời với hai cặp mồi invA1-invA2 iagAB1- iagAB2 chủng Salmonella Salmonella 67 Hình 3.3 Biểu chuột bệnh chuột khỏe mạnh 81 Hình 3.4 Tính chịu acid chủng Salmonella .86 Hình 3.5 Khả kháng nitrite chủng khảo sát 87 Hình 3.6 Khả kháng H2O2 chủng Salmonella 89 Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010 Phần Mở đầu Nguyễn Tiến Dũng MỞ ĐẦU Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2010 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng Môi trường Lysine Decarboxylase Broth (LDC): sử dụng để thử nghiệm khả sản sinh enzym Lysine decarboxylase Salmonella Thành phần môi trường sau: Pepton 5,0g/l, Cao nấm men 3,0g/l, Dextrose 1,0g/l, LLysine HCl 10,0g/l, Ferric (II) ammonium citrate 0,5g/l, Na2S2O5 0,04g/l, Bromocresol purple 0,016g/l, pH 6,7 Môi trường Mannitol Phenol Red Broth: sử dụng để thử nghiệm khả lên men đường Mannitol Salmonella Thành phần môi trường sau:Pepton thịt 5,0g/l, Pepton đậu nành 5,0g/l, Mannitol 10g/l, NaCl 5,0g/l, Phenol red 0,018g/l, pH 7,4 10 Môi trường Sorbitol Phenol Red Broth: sử dụng để thử nghiệm khả lên men đường Sorbitol Salmonella Thành phần môi trường sau: Pepton thịt 5,0g/l, Pepton đậu nành 5,0g/l, Sorbitol 10g/l, NaCl 5,0g/l, Phenol red 0,018g/l, pH 7,4 11 Môi trường Ducitol Phenol Red Broth: sử dụng để thử nghiệm khả lên men đường Ducitol Salmonella Thành phần môi trường sau: Pepton thịt 5,0g/l, Pepton đậu nành 5,0g/l, Ducitol 10g/l, NaCl 5,0g/l, Phenol Red 0,018g/l, pH 7,4 12 Môi trường Malonate Broth: dùng để thử nghiệm khả sử dụng Malonate Salmonella Thành phần môi trường sau: Ammonium sulphate 2g/l, Dipotassium phosphate 0,6g/l, Monopotassium photphate0,4g/l, Sodium chloride 2,0g/l, Sodium malonate 3,0g/l, Bromthymol blue 0,025g/l 13 Môi trường Lactose agar 1%: sử dụng để cảm ứng tạo enzym betagalactosidase dùng thử nghiệm ONPG Thành phần môi trường sau: Lactose 10g/l, Pepton 5g/l, Cao thịt 3g/l, NaCl 10g/l, Agar 15g/l 14 Đĩa giấy ONPG: sản xuất Bio-rad, dùng cho thử nghiệm ONPG khả tổng hợp enzym beta-galactosidase Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng PHỤ LỤC Số lượng nguồn gốc chủng Salmonella sử dụng luận án TT Nguồn gốc Loài phụ Số lượng Chủng gốc từ phịng thí nghiệm S enterica I Bệnh phẩm từ người S enterica I 3 Bệnh tích ruột heo S enterica I Thịt heo sản phẩm chế biến từ heo S enterica I 20 Trứng, vỏ trứng S enterica I Thịt gia cầm S enterica I Thịt bò S entreica I 24 Thủy sản S enterica I 17 S enterica II S enterica III S enterica IV S enterica V S entreica VI S enterica I S enterica III S enterica V S enterica I 99 S enterica II S enterica III 13 S enterica IV S enterica V S entreica VI Tổng Rau Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng PHỤ LỤC Kết khảo sát tính chịu acid chủng Salmonella STT Chủng 10 11 12 13 14 16 17 18 19 20 21 29 25 27 15 22 24 26 23 28 30 31 S ty SE 99.299 SE 99.303 SE 99 301 SE 02158 SE 02151 SE 02153 SE ST ST 02157 ST 02159 SP20a SP 18 SP 15 SP 4b SP 32b SP 28 SB 10 SB 11 SD 6.2 SS 1204 SO4104 SS 4803 SP 16 SS 1204 SS 1003 SS 9104 SS1203 SS 1203 SS Fn 31 SS Fn 3a Loài phụ S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica II S enterica III S enterica III S enterica III S enterica IV Salmonella V Salmonella V Salmonella V 0h CFU/ml CFU/ml 2giờ %sống sót (CFU/ml) %sống sót 1,0x108 8,8x107 6,5x107 1,2x108 1,1x108 7,7x107 1,2x108 8,0x107 8,6x107 1,2x108 1,2x108 8,0x107 7,8x107 3,6x107 9,1x107 8,8x107 5,6x107 8,4x107 9,6x103 1,1x105 4,4x107 3,9x107 3,0x107 1,5x107 1,7x107 3,7x107 4,3x106 8,9x106 4,3x107 4,7x107 2,3x107 1,6x107 2,9x106 9,5x107 6,5x105 0,10 0,01 67,69 31,45 2,63 19,35 14,17 46,25 0,50 0,74 37,07 58,75 29,49 44,44 3,19 107,95 0,00 0,08 2,1x104 100 2,9x107 1,5x107 3,5x106 1,2x107 4,0x106 1,8x107 1,4x107 1,9x106 2,1x107 3,9x106 1,5x106 4,8x106 9,1x107 0 0,02 0,00 44,62 11,85 0,31 15,06 3,33 21,88 0,00 1,19 1,64 26,25 5,00 4,17 0,53 103,41 0,00 0,00 3,9x107 7,4x107 9,1x107 4,5x107 8,2x107 5,9x107 4,4x107 7,0x107 4,8x107 8,1x107 8,5x107 8,6x107 7,6x107 1,2x106 4,5x107 1,6x107 2,5x107 4,3x107 7,5x107 5,9x106 8,2x107 5,8x106 1,6x104 3,4x103 0,00 1,57 49,45 36,22 0,00 42,37 97,73 107,14 12,29 101,23 6,82 0,02 0,00 5,0x105 6,0x106 2,7x106 2,1x106 5,0x107 8,6x107 2,4x105 9,5x107 9,5x105 1,7x103 0,00 0,68 6,59 6,00 0,00 3,56 113,64 122.86 0,50 117,28 1,12 0,00 0,00 Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng PHỤ LỤC Kết khảo sát tính kháng nitrite chủng Salmonella STT Chủng Loài phụ 0h CFU/ml 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 S ty SE 99.299 SE 99.303 SE 99 301 SE 02158 SE 02151 SE 02153 SE ST ST 02157 ST 02159 SP20a SP 18 SP 15 SP 32b SP 28 SB 10 SB 11 SD 6.2 SS 1204 SS 1203 SS 1204 SS 9104 SP 4b SO4104 SP 16 SS 1003 SS 4803 SS1203 SS Fn 31 SS Fn 3a S enterica I 9,5x10 S enterica I 8,8x10 S enterica I 1,2x10 S enterica I 6,5x10 S enterica I 8,0x10 S enterica I 7,7x10 S enterica I 1,2x10 S enterica I 1,1x10 8 S enterica I 8,6x10 S enterica I 1,2x10 S enterica I 1,2x10 S enterica I 8,0x10 S enterica I 7,8x10 S enterica I 6,5x10 S enterica I 9,1x10 S enterica I 8,8x10 S enterica I 8,2x10 S enterica I 8,40*10 S enterica I 3,9x10 S enterica I 5,9x10 S enterica I 9,1x10 S enterica I 4,5x10 S enterica I 8,2x10 S enterica II 7,7x10 S enterica III 4,4x10 S enterica III 3,3x10 S enterica III 5,4x10 S enterica IV 8,1x10 Salmonella V 5,0x10 Salmonella V 7,9x10 Salmonella V 7,6x10 3h 6h CFU/ml % sống sót CFU/ml %sốngsót 1,0x107 6,4x106 3,2x107 4,2x107 4,4x106 2,8x106 4,2x106 2,3x107 5,2x106 2,8x105 2,6x106 1,2x105 2,0x107 1,6x106 1,3x105 3,7x105 3,3x106 1,7x107 3,9x106 4,4x107 1,8x105 2,3x107 4,7x106 2,2x107 3,8x106 9,2x105 1,3x107 5,2x105 3,2x106 2,7x105 10,53 7,2x105 7,23 8,8x106 25,81 2,8x107 64,00 3,2x107 5,55 3,6x106 3,69 2,5x106 3,53 8,4x105 20,35 1,7x107 6,05 8,4x105 0,23 2,1x105 2,24 4,8x105 0,15 7,x104 25,38 3,2x106 2,46 5,3x105 0,14 2,3x105 0,42 5,3x105 4,02 2,6x105 20,00 1,4x106 0,00 6,61 1,3x106 47,80 3,0x107 0,39 27,80 1,2x106 6,10 1,9x106 50,45 4,1x106 11,52 2,5x106 1,70 3,6x105 16,54 4,1x106 1,04 1,2x106 4,05 7,2x106 0,36 3,0x105 0,76 10,00 22,26 49,23 4,45 3,22 0,70 15,09 0,98 0,18 0,41 0,09 4,10 0,82 0,25 0,60 0,32 1,67 0,00 2,27 32,97 0,00 1,46 2,47 9,27 7,64 0,67 5,04 2,34 9,11 0,39 Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng PHỤ LỤC Kết khảo sát tính kháng hydrogen peroxide chủng Salmonella Stt 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Chủng S ty SE 99.299 SE 99.303 SE 99 301 SE 02158 SE 02151 SE 02153 SE ST ST 02157 ST 02159 SP20a SP 18 SP 15 SP 32b SP 28 SB 10 SB 11 SD 6.2 SS 1204 SS 1203 SS 9104 SS 1204 SP 4b SO4104 SP 16 SS 1003 SS 4803 SS1203 SS Fn 31 SS Fn 3a Loài phụ S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica I S enterica II S enterica III S enterica III S enterica III S enterica IV Salmonella V Salmonella V Salmonella V Đường kính vòng vô khuẩn (mm) 13 14,5 15 14,5 14 12 13,5 14 15 11 12 16 15 13,5 12 15,25 14 14 15,5 14,5 13,75 14,5 15,75 14 14 11 14,5 12,5 14,75 10 14,5 Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng PHỤ LỤC Kết phân tích Salmonella trên loại mẫu thực phẩm khác Nhóm thực phẩm Mẫu Mẫu không gây nhiễm Gây nhiễm – 10 CFU/25g PCR - Nuôi cấy - PCR + Nuôi cấy + Nhóm sản Phó mát phẩm sữa Sữa đặc có đường - - + + - - + + Thịt gà - - + + - - + + - - + + Patê - - + + Jambong xơng khói - - + + Bò viên - - + + Tôm - - + + - - + + - - + + Cá dưa xơng khói - - + + Sà lách - - + + - - + + - - + + Nấm - - + + Nước ép cam - - + + Bún tươi - - + + Trứng - - + + Sữa bột Nhóm thịt Xúc xích gà gà Càri gà Nhóm thịt Nhóm hải Nghêu sản Bạch tuộc Nhóm rau Cà chua Tương ớt Thực phẩm khác (+): phát Salmonella (-): không phát Salmonella Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng PHỤ LỤC CHUẨN BỊ MẪU CHO ĐÁNH GIÁ ĐỘC LẬP QUI TRÌNH PHÂN TÍCH SALMONELLA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR NHÂN BẢN GEN INVA Chuẩn bị mẫu trắng Chọn mẫu hải sản, thịt, sửa, đại diện chợ hay siêu thị, mẫu thu khoảng 100g Mẫu sau thu cho vào bao PE vô trùng, bảo quản mẫu -20oC chưa tiến hành phân tích Các mẫu phân tích Salmonella phương pháp nuôi cấy lặp lại lần Nếu ba lần cho kết âm tính kết luận mẫu khơng bị nhiễm Salmonella (mẫu âm tính) Chọn loại mẫu hải sản (ký hiệu HS mực (HS-A) cá (HS-B), hai loại mẫu sửa (ký hiệu S) sữa bột (S-A) sữa tươi (S-B), loại mẫu thịt (ký hiệu T) thịt heo (T-A) thịt gà (T-B) xác định âm tính Salmonella Tiến hành cân mẫu vào bao vô trùng, bao 25g (mẫu sữa tươi 25ml) Mẫu cắt nhỏ trước cân Gây nhiễm mẫu Chủng S typhimurium tăng sinh qua đêm 37oC Pha loãng canh khuẩn theo lũy thừa bậc 10, xác định mật độ Salmonella độ pha loãng phương pháp cấy trãi 0,1ml dịch pha lỗng lên mơi trường XLD, ủ đĩa cấy 37oC khoảng 24 Đếm khuẩn lạc xuất môi trường, qui số CFU/ml dịch pha loãng Chọn độ pha loãng có mật độ vi khuẩn khoảng - 10CFU/ml 10 - 100CFU/ml để bgây nhiễm vào mẫu - Mẫu không gây nhiễm Salmonella ký hiệu SalHS-A0, SalHS-B0, SalT-A0, SalT-B0, SalS-A0, SalS-B0 - Mẫu gây nhiễm - 10CFU Salmonella /25g ký hiệu SalHS-A1, SalHS-B1, SalT-A1, SalT-B1, SalS-A1, SalS-B1 Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng - Mẫu gây nhiễm 10 - 100CFU Salmonella/25g ký hiệu SalHS-A2, SalHS-B2, SalT-A2, SalT-B2, SalS-A2, SalS-B2 Phân phối mẫu đến phịng thí nghiệm thành viên thực bảng sau Phịng thí nghiệm tham Số mẫu phân phối gia đánh giá Sal - Tổng Sal - Sal - SalT- SalS- SalHS- SalT- SalS- SalHS- SalT- SalS- SalHSA/B0 A/B0 A/B0 A/B1 A/B1 A/B1 A/B2 A/B2 A/B2 Viện VSYTcông cộng 2 2 2 2 18 Viện Pasteur TP HCM 2 / 2 / 2 / 12 TT Thú y Vùng / 2 / 2 / 2 12 TT Kỹ thuật / 2 / 2 / 12 TT Y tế dự phòng / 2 / 2 / 2 12 Công ty Hài Việt / 2 / 2 / 12 Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng PHỤ LỤC CÁC KHÁI NIỆM SỬ SỤNG TRONG ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Độ đặc hiệu tương đối (SP): thông số thể khả cho kết âm tính phương pháp thay (phương pháp PCR) mẫu xác định âm tính phương pháp tham chiếu (phương pháp ni cấy) Độ đặc hiệu tương đối tính tỉ số số kết âm tính thu từ phương pháp thay số kết âm tính thu từ phương pháp tham chiếu SP=[1- (FP/N-)] 100% N-: tổng số mẫu âm tính khơng gây nhiễm (0 CFU/ml) FP: số kết dương tính (so với kết phương pháp nuôi cấy PTN trọng tài) Độ nhạy tương đối (SE): thông số thể khả phát vi sinh vật có mẫu phương pháp thay (phương pháp PCR) Độ nhạy tương đối tính tỉ số số kết dương tính thu từ phương pháp thay số kết dương tính thu từ phương pháp tham chiếu (phương pháp nuôi cấy) SE = TP/N+  100% N+ : tổng số mẫu dương tính mức gây nhiễm 1-10 10-100 (CFU/ml) TP: số kết thực dương tính Độ xác tương đối (AC): thông số đánh giá khả cho kết xác phương pháp thay (phương pháp PCR) so với phương pháp tham chiếu (phương pháp ni cấy) Đó mức độ phù hợp kết nhận từ phương pháp thay phương pháp tham chiếu AC=(PA+NA+FC)/N  100% N : số mẫu thử nghiệm PA : số kết đồng dương tính phương pháp NA + FC : số kết đồng âm tính hai phương pháp Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng Tỉ lệ dương tính giả (FP): tỉ số kết dương tính giả thu từ phương pháp thay số kết chứng minh âm tính FP = PD/(PD+NA)  100% PD: số kết dương tính phương pháp tham chiếu, âm tính phương pháp thay PA: số kết đồng dương tính hai phương pháp Tỉ lệ âm tính giả (FN): tỉ số số kết âm tính giả thu từ phương pháp thay số kết chứng minh dương tính FN = ND/(ND+PA)  100% ND: số kết âm tính phương pháp phương pháp tham chiếu, dương tính phương pháp thay NA: số kết đồng âm tính hai phương pháp Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng PHỤ LỤC 28 TCN 199 : 2004 - Salmonella sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định tính kỹ thuật Polymerase Chain Reaction Salmonella in fishery products - Method for qualitative analysis by Polymerase Chain Reaction Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp định tính Salmonella sản phẩm thuỷ sản kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (sau gọi tắt PCR) Tài liệu tham khảo - Rapid Identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virulence gens, invA and spvC, by an Enrichment broth culture multiplex PCR combination assay (CHENG HSUN CHIU AND JONATHAN T.OU - Journal of Clinical microbiology, p.2619-2622 Oct 1996) - Specific detection of Salmonella spp by multiplex polymerase chain reaction (JS WAY, KL JOSEPHSON, SD PILLAI, M ABBASZADAGAN, CP GERBA AND IL PEPPER - Appl Environ Microbiol., 59 (5) : 1473 - 1479, 1993) - Detection of Salmonella spp and Listeria monocytogenes in Suspended Organic Waste by Nucleic Acid Extraction and PCR (CAROLA BURTSCHER, PAPA A FALL, PETER A WILDERER, AND STEFAN WUERTZ - Appl Environ Microbiol 65 (5): 2235 - 2237, 1999) th - Nordic commitees on food analysis (NMKL) No 71, ed., 1999, Salmonella - Detection in foods Giải thích thuật ngữ Trong Tiêu chuẩn này, thuật ngữ hiểu sau : 3.1 Salmonella Giống Salmonella vi sinh vật thuộc họ vi khuẩn đường ruột enterobacteriaceae có 2400 kiểu huyết Salmonella trực trùng Gram âm, kích thước khoảng 0,6 - 2,0 m, hiếu khí, di động, không tạo bào tử, sinh lên men dextrosa, sinh khí đihyđrosunfua Tất khiểu huyết Salmonella mang cụm gen inv (invasion) giúp cho trình xâm nhiễm vào thành ruột người động vật, mở đầu tiến trình gây bệnh Cụm gen nằm hệ thống gen SPI - (Salmonella pathogenicity island) có mặt tất Salmonella, từ nhóm tiến hố thấp S bongori đến nhóm tiến hoá cao S enterica I InvA gen ln có mặt hệ thống gen inv 3.2 Kỹ thuật PCR kỹ thuật dùng để khuếch đại số lượng trình tự AND đích qua chu kỳ gồm bước: biến tính ADN, bắt cặp bổ sung với mồi tổng hợp mạch nhờ enzym ADN polymerase 3.3 ADN đích (target ADN) Trong kỹ thuật PCR, ADN đích hiểu đoạn ADN đặc trưng cho đối tượng cần phát Trong Tiêu chuẩn này, ADN đích đoạn gen invA 3.4 Biến tính chuyển từ sợi ADN dạng mạch kép sang dạng mạch đơn tác dụng tác nhân biến tính Trong Tiêu chuẩn này, tác nhân biến tính nhiệt 3.5 Bắt cặp bổ sung kết hợp hai mạch ADN hay ADN mạch đơn với ARN có trình tự bổ sung để tạo nên mạch kép 3.6 ADN polymerase enzym tổng hợp nên mạch ADN từ mạch khuôn Phương pháp sử dụng Taq ADN polymerase ADN polymerase hoạt động nhiệt độ cao 3.7 Mồi trình tự ADN hay ARN ngắn bắt cặp với mạch khn ADN có mang đầu 3' OH tự giúp ADN polymerase bắt đầu tổng hợp mạch Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng Nguyên tắc Phương pháp định tính dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có khuếch đại hay khơng Q trình xác định thực cách điện di sản phẩm khuếch đại gel agarose, nhuộm màu ADN etyl bromua quan sát đèn UV có bước sóng 302 mm Nếu mẫu có gen đích, bảng gel điện di xuất sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài đoạn ADN đích định Nếu mẫu khơng có gen đích, gel diện di khơng xuất sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khơng phù hợp với đoạn ADN đích Thiết bị, dụng cụ, hố chất mơi trường 5.1 Thiết bị, dụng cụ o 5.1.1 Tủ ấm 37 C 5.1.2 Máy luân nhiệt 5.1.3 Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml 5.1.4 Máy lắc ống nghiệm 5.1.5 Thiết bị điện di ngang nguồn điện di có điện hoạt động từ 80 đế 150 volt 5.1.6 Hộp đèn soi UV có kính lọc 302mm 5.1.7 Bộ chụp ảnh đèn UV 5.1.8 ống Eppendorf 0,2 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR 5.2 Hoá chất, môi trường 5.2.1 Mồi Gồm hai mồi invA1 invA2 thiết lập cách 520 bp gen invA có vai trị q trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật người Trình tự hai mồi sau : invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3' invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3' Nồng độ mồi sử dụng phân tích pha lỗng thành pM đệm TE Ðệm TE có thành phần sau : 10 mM Tris-HCl (pH = 8), mM EDTA 5.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật loại hố chất khác Khuyến khích sử dụng mơi trường nuôi cấy dạng bột khô vật liệu dùng cho phản ứng khuếch đại PCR tổng hợp thành kit lưu hành thị trường có thành phần phù hợp Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn nhà sản xuất Trong trường hợp sử dụng vật liệu hoá chất riêng lẻ, độ tinh khiết thành phần nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho vi sinh sinh học phân tử 5.2.2.1 Dung dịch đệm pepton Pepton (C5H10O5): Natri clorua (NaCl): Ðinatri hyđro phôt phat (Na2HPO4): Kali đihyđro phôt phat (KH2PO4): Nước cất: 10,0g 5,0g 3,6 g 1,5g 1000 ml Hoà tan thành phần nước cất, đun tan, phân phối vào bình chứa phù hợp Hấp o o khử trùng nhiệt độ 121 C 15 phú pH sau khử trùng 7,0 0,2 25 C 5.2.2.2 Hỗn hợp dùng khuếch đại PCR 1,1x Taq polymerase: o Tris - HCl (pH = 8,8 nhiệt độ 25 C): 0,025 U/l (1,25 U/50 l) 75 mM Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng Sunphat amon (NH4)2ư SO4: Tween 20: 20 nM 0,01% (v/v) dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): Magiê clorua (MgCl2) 200 M (mỗi loại) 1,5 mM o Tất thành phần pha chế nước cất lần bảo quản nhiệt độ C o tháng Có thể bảo quản nhiệt độ - 20 C năm Không nên rã đông tái đông dung dịch pha chế nhiều lần 5.2.2.3 Thang ADN Nên sử dụng thang đo phù hợp ước lượng đoạn khuếch đại 520 bp Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp biết trước làm thang đo phương pháp 5.2.2.4 Agarose Sử dụng kỹ thuật loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ 1000 bp 5.2.2.5 Ðệm điện di TAE 1x Tris: Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0: Axit axetic băng: Nước cất cho đủ: 4,84 g ml 1,14 ml 1000 ml Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), sử dụng pha loãng với nước thành dung dịch 1x 5.2.2.6 Ðệm tải mẫu 6x Glyxerol: Xanh bromphenon: Tris: Na2EDTA: 30 % 0,25 % 200 mM 20 mM o Các thành phần pha nước cất, bảo quản nhiệt độ C 5.2.2.7 Thuốc nhuộm AND: dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml Phương pháp tiến hành 6.1 Lấy mẫu Cân xác 25 g mẫu (hoặc khối lượng xác tuỳ theo yêu cầu) cho vào bình tam giác bao PE vơ trùng 6.2 Tăng sinh Nhằm làm tăng số lượng Salmonella mẫu, tế bào bị suy yếu hay tổn thương phục hồi phát triển Giai đoạn tiến hành môi trường không chọn lọc nguyên tắc phần khối lượng mẫu bổ sung phần khối lượng môi trường tăng sinh Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm o o ủ mẫu có mơi trường tăng sinh nhiệt độ 37,0 C 1,0 C khoảng 18 giờ 6.3 Xử lý mẫu giải phóng ADN Giai đoạn nhằm thu nhận sinh khối sau tăng sinh, rửa môi trường sau nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng ADN Cách xử lý sau: 6.3.1 Lắc canh khuẩn tăng sinh Hút 0,5 ml vào ống eppendorf tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút phút loại bỏ phần môi trường lỏng bên Rửa sinh khối bên với nước cất vô trùng tiếp tục ly tâm với chế độ để loại bỏ phần nước Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng 6.3.2 Huyền phù sinh khối ống với 0,5 ml nước cất vô trùng Ðun sôi cách thuỷ 10 phút Ly tâm huyền dịch sau đun với tốc độ 10 000 vòng/phút phút để lắng mảnh vỡ tế bào xuống đáy Phần dịch bên coi khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại 6.4 Khuếch đại Giai đoạn nhằm làm tăng số lượng đoạn ADN đích máy luân nhiệt (thermocycler) hai mồi đặc trưng Quá trình khuếch đại tiến hành khoảng 30 chu kỳ 6.4.1 Chuẩn bị ống khuếch đại Hút 45 l hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào ống nghiệm PCR tích 0,2 0,5 ml, thêm vào l mồi invA1 invA2 có nồng độ pM l mẫu khn ADN Tổng thể tích ống khuếch đại 50 l Ðối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu dịch ADN Salmonella chuẩn biết Ðối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu nước cất vô trùng 6.4.2 Chương trình khuếch đại Các ống khuếch đại đặt vào máy luân nhiệt Chương trình khuếch đại sau: o Duy trì nhiệt độ 95 C phút để làm biến tính hồn tồn sợi ADN mẫu Tiếp theo o o o 35 chu kỳ, chu kỳ có bước sau: 94 C/30 giây; 55 C/40 giây 72 C/45 giây Sau kết o o thúc 35 chu kỳ, mẫu giữ nhiệt độ 72 C 10 phút, sau giữ ổn định nhiệt độ 20 C điện di 6.5 Ðiện di sản phẩm khuếch đại 6.5.1 Chuẩn bị gel điện di agarose 1% Gel agarose % pha đệm TAE 1x đun chảy hoàn toàn đổ vào khay điện di có sẵn lược để tạo giếng Gel điện di phải có độ dày khoảng - mm Gel sau chuẩn bị ngâm chìm hồn toàn đệm TAE 6.5.2 Chuẩn bị dịch điện di Mẫu sau khuếch đại nhuộm với 10 l đệm tải mẫu 6x trộn thật 6.5.3 Ðiện di Một giếng gel điện di sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương Nạp 10 l dịch điện di chuẩn bị vào gel agarose Tiến hành điện di 60 phút hiệu điện 100 vôn 6.6 Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại 6.6.1 Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu Pha dung dịch nhuộm ADN sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào khay chứa có miệng rộng gel điện di 6.6.2 Nhuộm gel Ngâm gel điện di vào dung dịch nhuộm 10 phút Rửa gel nước khoảng phút để loại bỏ phần etyl bromua dư 6.6.3 Quan sát, chụp hình Cho gel nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn quan sát vạch sáng đỏ ADN xuất gel Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết Ðọc giải thích kết Kết phân tích xem xét kết luận mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại ADN với kích tước 520 bp mẫu đối chứng âm khơng có sản phẩm Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009 Phụ lục Nguyễn Tiến Dũng Mẫu kết luạn dương tính Salmonella có sản phẩm khuếch đại 520 bp gel Mẫu kết luận âm tính khơng có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác 520 bp Qui định đảm bảo an tồn Trong q trình tiến hành thao tác phải thực qui định sau đây: 8.1 Thuốc nhuộm etyl bromua chất độc gây ung thư cho người động vật Do đó, sử dụng hố chất phải có găng tay kính bảo hộ Dung dịch sau sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước đổ bỏ 8.2 Chỉ bật đèn UV để quan sát ADN sau đóng kính bảo vệ 8.3 Nghiêm cấm sử dụng dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc tăng sinh hay chuẩn bị mẫu 8.4 Phịng thí nghiệm phải bố trí riêng biệt khu chuẩn bị mẫu trước khuếch đại khu xử lý sản phẩm sau khuếch tránh tượng nhiễm chéo gây kết dương tính giả _ Nghiên cứu phân biệt loài phụ Salmonella gây bệnh với loài phụ khác thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử - Luận án tiến sĩ, chuyên ngành Vi sinh, 2009